Agradecemos Chu P. para a realização de H & E e histologia; e C. Wang e r. McCarty para debates úteis. Pesquisa foi apoiada através de financiamento da Virgínia e D. K. Ludwig fundos para pesquisa do câncer; Nacional coração, pulmão e Instituto de sangue (R01HL058770 e U01HL099999); e o Instituto de Califórnia a medicina regenerativa (RC1 00354) subvenções I.W. Y.R. foi apoiado pelo humano Frontier Science programa carreira desenvolvimento Award (CDA00017), Fundação alemã de pesquisa (RI 2787/1), o Instituto de células-tronco de Siebel e o Thomas e Stacey Siebel Foundation (GHBJI-1119368-104). JMT foi apoiado pelo NIH (T32GM007365), o Prêmio Nacional de serviço de pesquisa (1F30DK108561) e Paul e Daisy Soros Fellowship para Nova americanos.

Todos os animais foram realizados experimentos em estrita conformidade com as directrizes estabelecidas pela Associação de avaliação e acreditação do laboratório Animal conta internacional (AAALAC) e da Universidade de Stanford painel administrativo em animais de laboratório Cuidados (APLAC), (número de protocolo #10266) e nos Estados Unidos, ou o Europeu Animal Welfare Act, Directiva 2010/63/UE. O protocolo foi aprovado pelo Comité de ética de experimentos Animal do governo da Baviera, Alemanha e recebeu a permissão não: 55.2-1-54-2532-150-2015.
1. preparação animal
<ol><li>Prepare uma gaiola vazia com roupa de cama adequada sobre uma almofada de aquecimento.</li>
	<li>Antes de tocar os animais com luvas, esfrega da cama da mãe para as luvas.</li>
	<li>Remova todos os filhotes da sua mãe e coloque na gaiola vazia. Remover algumas das roupas de cama da mãe e colocá-lo na gaiola vazia com os filhotes.</li>
	<li>Coloca a mãe em uma gaiola separada, limpa e seca, longe do campo cirúrgico.</li>
	<li>Don luvas novas, limpo, estéril antes da preparação do campo cirúrgico.</li>
</ol>2. preparação do campo cirúrgico
<ol><li>Utilizando uma pipeta de 10 mL, adicione 10 mL de salina tamponada fosfato (PBS) para um prato de Petri de 10 cm.</li>
	<li>Pipete 2 mL da solução de antiséptica betadine ou equivalente na prato de Petri de 10cm.</li>
	<li>Coloque um escopo dissecação no campo cirúrgico. Ligue dissecando lâmpada de escopo e ajustar o nível de luz para conforto do cirurgião. Um filhote pode ser colocado no campo cirúrgico sob a lâmpada de escopo a dissecação. Luz adequada pode ser confirmada pela ausência de sombras na superfície ventral do filhote.</li>
	<li>Preparar a câmara de anestesia de isoflurano (ver Tabela de materiais) com um cone de nariz. A câmara deve ser limpa sem evidências de urina ou fezes. Coloque o cone de nariz e tubagem associada no âmbito dissecação no campo cirúrgico. Desvie o fluxo de oxigênio e isoflurano exclusivamente para o cone de nariz.</li>
	<li>Preparar uma área de recuperação pós-operatória com uma almofada de aquecimento, situado a aproximadamente 37 ° C. A recuperação pós-operatória deve consistir em 4 pedaços de gaze colocada em cima da almofada de aquecimento. Se possível, esfrega a gaze no fundamento, fezes e urina para conservar o perfume da mãe da mãe. Nota: É aconselhável usar uma lâmpada de calor, como isso torna difícil controlar a temperatura. Temperaturas elevadas resultará na morte de camundongos neonatais.</li>
	<li>Preparar e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com uma autoclave. As ferramentas necessárias incluem: microdissecando tesouras, pinças microdissecando, gaze, pinça hemostática e qualquer sutura não absorvível de monofilamento de 6-0. Instrumentos cirúrgicos podem ser reesterilizados em com qualquer esterilizador de grânulo de vidro.</li>
</ol>3. parcial Hepatectomy Lobular
<ol><li>Anestesia o filhote, colocando-o no nariz cone em sua volta e suavemente a gravar seus pés e mãos no lugar. O filhote deve receber 5% de isoflurano em oxigênio.<ol>
<li>Permitir que o filhote se sentar por 5 min ou até devidamente anestesiado, que pode ser verificado por um teste do beliscão do dedo do pé.</li>
		<li>Injete 5 mg/kg de carprofeno por via subcutânea, antes da incisão. Nota: A cirurgia toda deveria ser não mais do que 30 min. resultados mais pobres podem ser observados em recém-nascidos que estão sob anestesia geral para mais de 30 min. Tome precauções para minimizar a duração da cirurgia através da preparação de campo minuciosa e umectação da pele antes da sutura para minimizar a sutura induzida pele lágrimas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe suavemente a parede abdominal posterior com uma pequena gaze molhada com betadine. Permitir que o betadine secar por 1 min.</li>
	<li>Faça uma incisão de esquerdo médio-clavicular 0,5 cm imediatamente abaixo da caixa torácica com o microdissecando tesoura e pinça. Delicadamente, separar a pele usando fórceps e efectue uma segunda incisão mais profunda na cavidade peritoneal (ver Figura 1, esquerda e centro)</li>
	<li>Aplica suavemente a pressão lateral de ambos os lados do abdome usando as costas, extremidades sem corte da tesoura e pinça microdissecando para forçar o ápice do lobo esquerdo fora da cavidade peritoneal. O ápice esquerdo do lobo esquerdo deve ser facilmente visualizado (Figura 1, direito).</li>
	<li>
Partir do ápice, amputar e pesar a quantidade de tecido a ser removido.
	<ol>
<li>Usando a tesoura de micro-dissecção, delicadamente ampute a quantidade desejada de tecido a partir do ápice do lobo esquerdo.</li>
		<li>Cheio o tecido amputado em um tubo de 1,5 mL de PBS. Pesar o tecido amputado usando uma balança analítica (ver Tabela de materiais). Nota: Coloque um pedaço de gaze ou papel sobre a balança e tare-lo. Depois, coloque o tecido amputado na gaze ou papel e medir sua massa.</li>
		<li>Corrigi a área amputada em 2% paraformaldeído na temperatura ambiente durante 1 h e lugar no ideal da temperatura de corte (OCT) composto sobre gelo seco para análise de biópsia. Analise seções congeladas por corte 7-10 µm as seções usando qualquer padrão criostato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando um pedaço de laminado de gaze, delicadamente substitua o lobo esquerdo na cavidade peritoneal. Deixe a gaze na cavidade até o sangramento parar.</li>
	<li>Retire a gaze e molhar o local cirúrgico e a área circundante com gaze embebida com PBS.</li>
	<li>Feche o local cirúrgico com monofilamento de 6-0, suturas não absorvíveis com um corrido. O peritônio e a pele devem ser fechadas separadamente. Nota: Molhar suavemente a pele com gaze embebida com PBS pode minimizar as lágrimas de sutura induzida.</li>
	<li>Delicadamente mas completamente limpa o filhote com gaze embebida com PBS e garantir que não há restos de sangue ou betadine. Rolo da gaze embebida e esfregue suavemente sobre o sinal de ferida para limpar qualquer sangue ou betadine. Nota: Isto é especialmente importante como a mãe pode canibalizar os filhotes, se são limpos inadequadamente.</li>
	<li>Retire o filhote do cone do nariz e coloque-o sobre a área de recuperação que inclui a gaze exposta a fezes e urina da mãe. Uma vez que o filhote se recupera, substitua o filhote na gaiola vazia com roupa de cama da mãe. Nota: Não utilize uma lâmpada de calor. O uso de uma lâmpada de calor pode causar o neonato a superaquecer.</li>
	<li>Repita o procedimento para o número desejado de filhotes. Embora todos os filhotes podem ser usados, é geralmente aconselhável deixar alguns filhotes não operadas a ser substituído junto com os filhotes operados.</li>
	<li>Substitua todos os filhotes simultaneamente com roupa de cama da sua mãe na gaiola da mãe.</li>
</ol>4. recuperação e análise
<ol><li>
Acompanhar diariamente nos ratos.
	<ol>
<li>Verifique que a ferida permanece fechada e remova qualquer filhotes mortos, se houver.</li>
		<li>Se reabre a ferida, prepare a área local e recuperação cirúrgica como anteriormente descritas e repita as etapas 3.8 a 3.12.</li>
		<li>Injete 5 mg/kg de carpofen por via subcutânea de 24 e 48 h após o procedimento.</li>
		<li>Acompanhar os filhotes para 56 dias ou mais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanásia dos animais após a quantidade desejada de dias pós-operatórios por exposição de dióxido de carbono (CO2) e deslocamento cervical.<ol>
<li>Coloque os ratos na indução / câmara de eutanásia e ativar o CO2 até ratos param de respirar.</li>
		<li>Certifique-se de eutanásia por deslocamento cervical. Empurre para baixo no pescoço dorsal do mouse usando o fore-dedo e o polegar e usando a outra mão, puxe para baixo na cauda.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Remover o todo fígado em bloco e pesá-lo.
	<ol>
<li>Com cuidado, separe cada lóbulo e pesar separadamente. Nota: Remova o fígado por dissecção cuidadosa dos vasos diafragma e hepática e portal. Separe os lóbulos do outro por dissecar cuidadosamente cada lóbulo na sua fixação proximal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine a extensão da regeneração, comparando a massa do lobo esquerdo amputado à massa do fígado inteiro. Um lobo esquerdo ileso é aproximadamente 30% do fígado inteiro.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Regeneration.">Liver Regeneration.</a> Science. 276 (80), 60-66 (1997).</li><li>Ponfick, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+of+the+Liver.">Surgery of the Liver.</a> Lancet. 1, 881 (1890).</li><li>Higgins, G., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Pathology+of+the+liver.+Restoration+of+the+liver+of+the+white+rat+following+partial+surgical+removal.">Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal.</a> Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).</li><li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and+unconventional+cell+division+of+hepatocytes+underlie+liver+regeneration.">Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration.</a> Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).</li><li>Miyaoka, Y., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+divide+or+not+to+divide:+revisiting+liver+regeneration.">To divide or not to divide: revisiting liver regeneration.</a> Cell Div. 8, 8 (2013).</li><li>Tsai, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+hepatic+lobular+regeneration+by+central-vein-associated+lineage-restricted+progenitors.">Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331, 1078-1080 (2011).</li><li>Shyh-Chang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lin28+enhances+tissue+repair+by+reprogramming+cellular+metabolism.">Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism.</a> Cell. 155, 778-792 (2013).</li><li>Yin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+alcohol-induced+liver+injury+in+mice.">Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice.</a> Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).</li><li>Gao, B., Bataller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcoholic+liver+disease:+pathogenesis+and+new+therapeutic+targets.">Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets.</a> Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).</li><li>Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+is+involved+in+the+mechanism+of+early+alcohol-induced+liver+injury+in+mice.">Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice.</a> Hepatology. 34, 101-108 (2001).</li><li>Coen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+metabonomic+investigation+of+acetaminophen+toxicity+in+the+mouse+using+NMR+spectroscopy.">An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy.</a> Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).</li><li>Oz, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+antioxidants+protect+against+acetaminophen+hepatotoxicity.">Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).</li><li>Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+proteomics+analysis+of+acetaminophen+toxicity+in+mouse+liver.">Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver.</a> Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).</li><li>Gunawan, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+plays+a+major+role+in+murine+acetaminophen+hepatotoxicity.">c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity.</a> Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).</li><li>Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postulated+carbon+tetrachloride+mode+of+action:+a+review.">Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review.</a> J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).</li><li>Recknagel, R. O., Glende, E. a., Dolak, J. a., Waller, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+carbon+tetrachloride+toxicity.">Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity.</a> Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).</li><li>Sell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+plasticity+of+hepatocyte+lineage+cells.">Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells.</a> Hepatology. 33, 738-750 (2001).</li><li>Malato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+tracing+of+mature+hepatocytes+in+mouse+liver+homeostasis+and+regeneration.">Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration.</a> J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).</li><li>Greene, A. K., Puder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hepatectomy+in+the+mouse:+technique+and+perioperative+management.">Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management.</a> J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).</li><li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy.">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).</li><li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells.">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464, 549-553 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Global+Double-Fluorescent+Cre+Reporter+Mouse.">A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse.</a> Genesis. 605, 593-605 (2007).</li><li>Poley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotionality+related+to+maternal+cannibalism+in+BALB+and+C57BL+mice.">Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice.</a> Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).</li><li>Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+responses+to+infant+vocalizations+and+olfactory+cues+in+rats+and+mice.">Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice.</a> Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).</li></ol>

Os autores têm sem divulgações.

Lesão hepática aguda tem sido tradicionalmente estudado usando química (paracetamol, etanol, tetracloreto de carbono), ou modelos cirúrgicos (70% hepatectomy parcial). A resposta regenerativa após hepatectomy parcial 70% tem sido caracterizada a participação global hepatócito hipertrofia e várias rodadas de divisão celular4,5. Para parar a hemorragia, no entanto, este modelo é limitado, como os principais vasos devem ser ligados, deixando um ambiente anormal para regeneração. Muitos estudos têm, portanto, empregado outros modelos menos invasivos da lesão aguda através de dano químico, deixando a arquitetura bruta no local para a regeneração ocorra. Recentemente, Porrello et al e Chang et al demonstraram uma resposta regenerativa neonatal marcadamente diferente após a lesão aguda no coração, dicas de dígitos e orelhas7,8. Suas conclusões paralelas de resultados apresentados que o fígado também sofre um fenômeno regenerativo distinto na vida neonatal6. Com várias conclusões semelhantes nos principais órgãos, regeneração nas fases iniciais de desenvolvimento pós-natal é um campo emergente com potenciais implicações para a biologia de células-tronco.
Mortalidade precoce de neonatal parcial lobular hepatectomies muitas vezes vem de recuperação inadequada, hemorragia importante ou negligência materna. Conforme mencionado anteriormente, o uso de uma fonte de calor maior intensidade como uma lâmpada de calor de recuperação, pode levar à morte após a cirurgia. Os ratos neonatais são dependentes de sua mãe para pelo menos as duas primeiras semanas de vida. Ao mesmo tempo, a mãe vai muitas vezes negligenciam e ou canibalizar seus filhotes se ela detecta uma anomalia (tais como o cheiro de sangue ou outros produtos químicos)24,25. Portanto, é extremamente importante que o neonato é limpado completamente no período pós-operatório e friccionado com fundamento materno para mascarar qualquer ofensivas perfumes. Se estas questões são abordadas de forma adequada, sobrevivência pode atingir 100%. Se canibalismo materno se torna um problema, os filhotes podem ser colocados em uma gaiola com uma mãe de aluguel, com alguns dos seus próprios filhotes. Se este for o caso, use roupa de cama de mãe de aluguel nas etapas anteriores.
A ressecção de 20-30% do lobo esquerdo neonatal e posterior regeneração é provável não inerente apenas no esquerdo. Atualmente, esse método só foi testado na esquerda, como expor a mediana e mais os lobos direito e caudados posteriores seria necessário uma laparotomia maior, resultando em um maior risco de hemorragia e, indirectamente, um risco mais elevado de canibalismo materno para o em recém-nascidos. No entanto, se os mecanismos de regeneração neonatal são heterogêneos dentro do fígado é uma importante questão a ser abordada, e, portanto, ajustes cirúrgicos para este protocolo devem ser feitos para interrogar os outros lóbulos hepáticos.
Os resultados destes estudos hepatectomy neonatal têm mostrado um período de tempo (P0-P7) durante o qual a regeneração é capaz de ocorrer. Ressecções hepáticas semelhantes foram feitas em ratos juvenis (P7, P10, P14) e não resultar em regeneração completa com cicatriz demonstrada e fibrose, marcando uma área clara de onde ocorreu a amputação. Embora a resposta da lesão em ratos juvenis hepatectomy lobular parcial a seguir não foi o foco de um estudo inicial, a discrepância no potencial regenerativo entre ratos Neonatais e infantil e a perda da capacidade de reconstituir órgãos e tecidos arquitetura, será essencial para a compreensão de por que células estaminais ou progenitoras de mecanismo ocorre regeneração neonatal.
Nós demonstramos anteriormente que neonatal fígados regenerados não só aparecem o mesmo na arquitetura e estrutura, mas também são indistinguíveis por função. Imunofluorescência manchas para enzimas hepáticas funcionais tais como a glutamina sintetase (GS), carbamoylphosphate sintetase (CPS) e Citocromo p450 2E1 mostram uma distribuição semelhante dentro de áreas regeneradas quando comparado aos lóbulos ilesos. No entanto, o potencial regenerativo secundário de um neonato regenerado não foi testado. Como ratos neonatais permitidos a recuperação para 56 dias são fisiologicamente indistinguíveis dos controles ilesos, é provável que ocorreria a clássica resposta regenerativa seguindo adulto hepatectomy parcial de 70%. No entanto, esta regeneração hepática é muitas vezes limitada pela exaustão do hepatócito, e, portanto, hepatectomies serial hepatectomies lobular parcial a seguir seria um importante estudo.

A capacidade de regenerar um órgão, ou para restaurar a forma e função, foi pensada para ser principalmente perdido ao longo do tempo evolutivo. O potencial regenerativo do fígado dos mamíferos adulto após lesão aguda de química ou física foi encontrado para envolver a mobilização de todos os hepatócitos restantes, resultando em ondas de hipertrofia e algumas rodadas de divisão celular, resultando em um funcional, mas arquitetonicamente diferente órgão1,2,3,4,5. Recentemente, estudos começaram a caracterizar a resposta regenerativa dos órgãos de mamíferos neonatais a lesão na primeira semana de vida6,7,8. Estes estudos têm mostrado que, quando feridos durante o desenvolvimento neonatal, certos órgãos de mamíferos respondem com regeneração morfológica em vez de compensação crescimento ou fibrose7,8.
Estudos recentes demonstraram que a regeneração da estrutura global e a função ocorre durante o início período neonatal6,7,8. Lesão hepática estabelecidos protocolos envolvem lesão química ou administração de etanol9,10,11, paracetamol12,13,14,15 , tetracloreto de carbono16,17,18,19, 70% hepatectomy parcial4,20,21ou remoção da esquerda e lóbulos medianos. Administração química leva à morte de células do hepatócito, mas muitas vezes deixa o micro e macroestruturas intactas. Regeneração morfológica não pode prontamente ser estudada neste contexto, como a arquitetura hepática em geral não se extinguiu. A hepatectomy parcial 70% envolve a ligadura da sutura dos vasos grandes, que é necessária para parar o sangramento, mas deixa um ambiente não-fisiológica com interrupção permanente da vasculatura. Além disso, esse método só tem sido utilizado em roedores adultos, e sua aplicação para neonatos tecnicamente é extremamente difícil. Com isto em mente, desenvolvemos um método em que 20-30% do ápice do lobo esquerdo é removido em um recém-nascido mouse P0 (figura 1A-1B). Este método é cirurgicamente conservador, minimamente invasivo, não tecnicamente desafiador e leva à perda da morfologia sem a ligadura da vasculatura, deixando espaço para a regeneração ocorra de efectivação. O protocolo resultante do passo a passo, descrito abaixo, permite a qualquer pesquisador realizar uma hepatectomy parcial lobular em ratos neonatais para estudar mamíferos regeneração neonatal nas fases iniciais de vida pós-natal. Esse método também tem aplicações claras para estudos comparativos em medicina regenerativa e biologia de células-tronco, como ele pode ser usado no fígado durante as fases posteriores da vida.
Os estudos mais comuns de lesão hepática aguda são quimicamente induzida dano, amputação de fígado adulta ou hepatectomy parcial de 70%. Dano químico muitas vezes envolve a administração intravenosa, intraperitoneal ou oral de paracetamol, tetracloreto de carbono ou etanol e é um modelo de lesão relativamente fácil e não-invasiva. Como já discutido, resultados de dano químico na morte de celular do hepatócito, mas muitas vezes folhas estroma e parênquima estruturas intactas, tornando-se difícil fazer afirmações sobre regeneração morfológica. Dano químico muitas vezes gira em torno dos vasos hepáticos, tornando-se uma técnica útil para estudar o local e a lesão de células específicas, mas também dificulta a interrogar, no nível do órgão inteiro, outras populações que pode situar-se longe dos navios e que podem contribui para a regeneração. Apesar dessas limitações, dano químico continua a ser um modelo de lesão altamente fisiologicamente relevantes e úteis.
Adulto hepatectomy parcial de 70% envolve a remoção dos lobos esquerdos e medianos após ligadura da vascularização hepática. A resposta a hepatectomy tem sido bem caracterizada: o fígado amputado 14 dias pós 70% hepatectomy parcial desenvolve uma arquitetura grosseiramente diferente do lobo original intacto, como os hepatócitos dos lobos direito e caudados restantes submeter-se hipertrofia e algumas rodadas de divisão celular4,5. Isto torna-se massa perdida e função, mas falha regenerar os dois lobos amputados e, portanto, não substitui a morfologia bruta. Como resultado, a resposta da lesão a hepatectomy parcial 70% é útil para estudar os mecanismos de crescimento compensatório com regeneração limitada.
Aqui, descrevemos totalmente um protocolo para um hepatectomy lobular parcial neonatal. O procedimento envolve a seleção apropriada de animais e preparação, preparação do campo cirúrgico, cirurgia e recuperação. Otimização e adaptação de cada uma dessas etapas podem ser necessárias para diferentes aplicações do protocolo.
Temos amplamente realizada e otimizado este protocolo sobre filhotes de C57BL/6J de tipo selvagem (JAX 000664), no entanto, para estudar populações de células diferentes e mecanismos de regeneração, também usamos vários animais transgénicos, incluindo ratos, abrigando diversos Cre e CreERT2 transgenes e/ou bater-ins (JAXAxin2CreERT2 018867, e Sox9CreERT2 JAX 018829) em combinação com repórteres fluorescentes, tais como sistemas de arco-íris e mTmG (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. não encontramos nenhuma necessidade de mudar esta metodologia para as estirpes de mouse diferente, como não nos resultados de sobrevivência ou potencial regenerativo foram observadas diferenças.
Além de usar diferentes estirpes animais, realizamos também parcial hepatectomies lobular em neonatais ratos tratados com pequenas moléculas, tais como 4-hidroxi-tamoxifeno e 5-ethynyl-2-desoxiuridina (EdU). Dimetilsulfóxido (DMSO) e etanol foram usados como solventes, como verificou que o óleo de milho era uma importante causa de morbidade. Caso contrário encontramos que a administração intraperitoneal de pequenas moléculas não afetou sobrevivência ou resultados regenerativos. Podemos prever que o presente protocolo será adaptado para uso com outras moléculas pequenas para interrogar os vários aspectos da regeneração.
Cirurgias de rato neonatal podem ser tecnicamente desafiadoras e podem exigir conhecimentos especiais na manipulação de animais e de dissecação microscópica. Experiência de criação de animais é necessária para evitar o canibalismo materno após a cirurgia e durante o período de recuperação imediata.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surrogate mother and surrogate litter (optional)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Serum (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providine-iodine or equivalent antiseptic solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm straight spring micro scissors</td>
			<td>Vannas</td>
			<td>72932-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5SF Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Kelly forceps</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>17-050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>000771-810-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>0044-5260-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>1205S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze, 10.16 x 10.16cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 monocryl sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP489G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S35839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid, Plain, 110V</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Cost Induction Chamber</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SOMNO-0730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial lobular hepatectomy: a surgical model for morphologic liver regeneration

Regeneração morfológica do órgão após perda de tecido aguda é comum entre vertebrados inferiores, mas é raramente observada em mamíferos vida pós-natal. Regeneração hepática adulta após hepatectomy parcial 70% resulta em hipertrofia do hepatócito com alguns replicação em lóbulos remanescentes com a restauração da atividade metabólica, mas com perda permanente de lóbulo ferido morfologia e arquitetura. Aqui, detalhamos um novo método cirúrgico no recém-nascido que deixa um ambiente fisiológico conducente à regeneração. Este modelo envolve a amputação do ápice do lobo esquerdo e um regime de tratamento conservador subsequentes e não possui a necessidade de ligadura dos vasos sanguíneos do fígado ou lesão química, deixando um ambiente fisiológico onde regeneração pode ocorrer. Estendemos este protocolo para amputações no juvenis ratos (P7-14), durante o qual o fígado lesionado transita de regeneração do órgão para crescimento compensatório por hipertrofia. O protocolo apresentado, breve 30 min fornece uma estrutura para estudar os mecanismos de regeneração, seu declínio idade-associadas em mamíferos e a caracterização dos putativo hepático tronco ou progenitoras.

Figura 1A detalha um cronograma geral da hepatectomy lobular parcial neonatal (esquemática na figura 1B) e a duração prevista do tempo de espera até a regeneração é observada. Regeneração sutil do lobo esquerdo pode ser observada 7-14 dias pós-cirurgia. Regeneração total observou-se muitas vezes após 56 dias pós cirurgia. Os ratos devem não mostra sinais de anormalidade fisiológica após a cirurgia.
Ratos submetidos a hepatectomies lobular parcial foram autorizados a recuperar para 2, 7, 14, 35 e 56 dias. Hematoxilina e eosina (H & E) dos lobos esquerdos lesionados destes ratos após a recuperação são mostrados na Figura 2. Notavelmente, após 56 dias, o lobo esquerdo amputado pode parecer indistinguível de controle, lóbulos ilesos. Cirurgias feitas em P14 juvenis ratos foram feitos para comparação e permitiu recuperar para 7, 14 e 56 dias pós cirurgia (Figura S1).
Para caracterizar a regeneração neonatal, 45 ratos foram submetidos a hepatectomy lobular parcial no dia 0 e as massas de todos os seus lóbulos foram tirados 56 dias pós cirurgia. A massa do lobo esquerdo lesionado foi submetido a uma mudança maior em massa quando comparado com os outros ileso mediana, bem e caudados lóbulos (Figura 3A) e controles ilesos, aproximando-se a massa de um lobo esquerdo ferido no P56. Isto indica a regeneração seguir lesão hepática neonatal está localizada no lobo esquerdo. Cirurgias feitas em P14 juvenis ratos foram feitos para comparação, que mostrou diminuição da regeneração no lobo esquerdo e compensação aumentada de lóbulos ilesos (Figura 3B), indicando que por 14 dias, a resposta de lesão à ressecção aguda mudou-se de regeneração específico de lobo a indemnização global. Caracterização adicional foi feita pela coloração de áreas do lobo esquerdo de ratos feridos no dia pós-operatório 56 com actina filamentosa (f-actina) para visualizar as membranas celulares (Figura 4A). Áreas distais e proximais à área da lesão foram comparadas com controles ilesos e lobos adultos 14 dias após a hepatectomies parcial de 70%. Hepatócitos foram encontrados para ter áreas semelhantes como controles ilesos, sobre 1.5-2x ratos menos de adultos submetidos a regeneração seguindo a clássica hepatectomy parcial 70% (Figura 4B). Isto sugere que a hipertrofia não desempenham um papel na regeneração. Finalmente, neonatais ratos foram injetados com 0,025 mg de 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) em 90% de PBS e 10% de etanol e 1, 3, 5, 7 e 14 dias após a cirurgia. O número de células positivas EdU foram contado de ratos permitidos recuperar durante 7 dias após a cirurgia (Figura 4). Um aumento significativo no número de células positivas EdU foram encontrados no lobo esquerdo lesionado/regeneração quando comparados aos controles ilesos, indicando que a proliferação celular contribui para a regeneração neonatal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57302/57302fig1.jpg"> Figura 1: visão geral de Hepatectomy parcial do Lobular. () Um esquema geral e cronograma da hepatectomy parcial lobular é mostrado com ressecção hepática neonatal, feita em P0. Análises foram feitas no P7, P14, P35 ou P56. Ressecções também foram julgadas em P7 e P14. (B), um esquema da extensão da ressecção do lobo esquerdo é mostrada, demarcando ressecções 20% e 30%. (Esta figura foi modificada de Tsai et al) 6. (C) imagens de cirurgias neonatais mostrando: direita face incisão médio-clavicular (esquerdo, centro) e exposição do ápice lobo esquerdo (à direita). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57302/57302fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57302/57302fig2.jpg"> Figura 2: regeneração seguindo Hepatectomy parcial de Lobular. Ratos submetidos a parcial hepatectomies lobular em P0 foram seguidos por 2, 7, 14, 35 e 56 dias. Fígados foram fixados e corados com H & E, e observou-se a extensão da regeneração do ápice esquerdo. Setas indicam áreas onde regeneração ocorreu em camundongos P0. Barra de escala é de 1 cm. Esta figura foi modificada de Tsai et al . 6 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57302/57302fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57302/57302fig3.jpg"> Figura 3: regeneração por Lobe Hepatectomy Lobular parcial a seguir. (A) de ratos submetidos à hepatectomies lobular parciais em P0 foram analisados no 7, 35 e 56 dias pós-operatório. Os ratos foram sacrificados e as massas de todos os lóbulos de ratos feridos (vermelhos) foram tiradas e comparadas a idade correspondentes massas de controle ileso (vermelho). (B) Ratos submetidos a hepatectomies lobular parcial no P14 foram analisados no 7, 35 e 56 dias pós-operatório. Massas de todos os lóbulos de ratos feridos (vermelhos) foram tomadas e em comparação com massas de controle ileso (vermelho). * = p < 0.05, * * = p < 0.005, * * * = p < 0,0005, NS = não significativo. Isso percebi que foi modificado de Tsai et al . 6 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57302/57302fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57302/57302fig4.jpg"> Figura 4: caracterização da regeneração Post Hepatectomy. (A) de ratos submetidos à hepatectomies lobular parciais em P0 foram analisados 56 dias após a ressecção e manchados por F-Actina. Imagens são mostradas de manchas de áreas proximais e distais à área da amputação, bem como a partir de controles idade-ilesos e de ratos adultos 14 dias após hepatectomy parcial de 70%. Barras de escala são 100 µm. (B) áreas dos hepatócitos após lesão em áreas proximais ou distais ao site da ressecção foram comparadas com áreas de hepatócitos de controles ilesos e hepatectomies.* parcial de adulto 70% = p < 0.05, * * = p < 0.005, * * * = p < 0,0005, * * * = p < 0.00005, NS = não significativo. (C) de ratos submetidos à hepatectomies lobular em P0 foram tratados com EdU e analisaram-se 7 dias após a ressecção. EdU+ células no lobo esquerdo são mostradas. (Barra de escala, 100 µm). (D) a quantificação de EdU+ células em camundongos tratados com EdU 7 e 14 dias seguintes parcial hepatectomy lobular comparado aos controles. Os valores são meios ± SEM. Isso percebi que sido tenha modificado de Tsai et al . 6 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57302/57302fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura S1: regeneração incompleta dos ratos juvenis. Ratos submetidos a hepatectomies lobular parcial no P14 foram seguidos por 7, 35 e 56 dias. Fígados foram fixados e corados com H & E e constatou-se a extensão da regeneração do ápice esquerdo. Setas indicam áreas onde regeneração ocorreu em camundongos P0. Barra de escala é de 1 cm. Isso percebi que foi modificado de Tsai et al . 6 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57302/Figure_S1.pdf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration at JoVE.com

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Hepatectomy parcial de Lobular: Um modelo cirúrgico para regeneração hepática morfológica

Aqui, apresentamos um novo método para ressecção parcial do lobo esquerdo hepático em camundongos neonatais (dia 0). Este novo protocolo é apropriado para estudar a resposta de lesão no cenário neonatal e lesão hepática aguda.

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

partial-lobular-hepatectomy-surgical-model-for-morphologic-liver

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.0K visualizações.  Stanford University School of Medicine. Aqui, apresentamos um novo método para ressecção parcial do lobo esquerdo hepático em camundongos neonatais (dia 0). Este novo protocolo é apropriado para estudar a resposta de lesão no cenário neonatal e lesão hepática aguda.

Vídeo: Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

The objective of this report is to describe the protocols to derive the retinal pigment epithelium (RPE) from induced pluripotent stem (iPS) cells using different sizes of embryoid bodies.

Derivando Retinal Pigment Epithelium (RPE) de pluripotentes induzidas (iPS) Stem Cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolamento de rato Endometrial epiteliais e estromais para células<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Química amputação e regeneração da faringe nos Turbellaria mediterranea Schmidtea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

Um modelo de Mouse quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatócitos de derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Métodos para o estudo da regeneração em Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...