Name: generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
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O autor deseja agradecer a Annette Blak Rasmussen e Kristine Moeller para seu suporte técnico

A coleta de amostras de pele de voluntários adultos saudáveis, submetidos à cirurgia plástica requer aprovação do Comitê de ética das instituições de acolhimento. Este protocolo foi aprovado pelo Regional éticas Comitê da região Midtjylland, Dinamarca (M-20110027). O método descrito aqui é derivado de estudos semelhantes por Maciaq et al . 10 e Liu e Karasek11.
1. isolamento de queratinócitos da pele humana
<ol>
	<li>Começar por fazer as seguintes soluções: 50 mL de solução de glicose de tripsina e 0,1% de 0,25% em DPBS. Mix e filtro esterilizem (0,2 µm) a solução. Prepare-se 10 mL de RPMI-1640 + 2% solução FBS, 50 mL de DPBS e queratinócito meio livre de soro (KSFM). Adicione 250 µ l de gentamicina e KSFM suplementos para 500 mL de KSFM. Pré-aquecer as soluções a 37 ° C antes do uso.</li>
	<li>Colete a pele de voluntários adultos saudáveis, submetidos à cirurgia plástica. As amostras de pele usadas são aproximadamente 10 cm x 15 cm, mas podem variar de tamanho. Manter a calma de pele sob transporte transportando amostras de pele em uma caixa de isopor contendo um elemento de refrigeração. Se necessário, a amostra de pele pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Remova a gordura da abaixo da seção de pele usando pinças, bisturis e tesoura esterilizada.</li>
	<li>Fivela para fora a seção de pele (aproximadamente 10 x 15 cm) em uma cobertura estéril em cima de uma placa usando agulhas. Primeiro, limpe a pele com uma gaze esterilizada seca. Em seguida, limpe a pele usando uma gaze esterilizada com etanol a 70%.</li>
	<li>Utilizando uma plaina de pé, corte da camada superior (epiderme) da seção de pele e colocá-lo em uma placa de Petri de 9 cm. Então, imediatamente Adicione 25 mL da solução de DPBS/tripsina/glicose (preparada na etapa 1.1) para a placa de Petri. Incubar durante 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Usando uma pipeta retire a placa de Petri a solução de tripsina/DPBS/glicose e adicionar 10 mL de RPMI-1640 + 2% FBS para inactivar a tripsina.</li>
	<li>Usando duas pinças, agora solte as células epidérmicas no meio de delicadamente raspando e agitação epidérmico e dérmico compartimento das secções de pele.</li>
	<li>Filtrar a suspensão de células epidérmicas por um filtro de metal (tamanho do furo de 1 mm) e recolher em um tubo de 50 mL. Adicione as restantes secções de pele para um tubo de 50 mL contendo 10 mL de RPMI-1640 sem FBS e vórtice para 10 filtro s. a suspensão através do metal do filtro em um tubo de 50 mL contendo a suspensão de células epidérmicas. Adicione DPBS para um volume total de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 450 x g, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o celular epidérmica em cerca de 10 mL de 37 ° C KSFM dependendo do tamanho do centrifugado. Conte as células usando o azul Trypan método sob microscópio de coloração. O número de células obtidas a partir de uma seção de pele de 10 x 15 cm é aproximadamente 50-100 x 106 células. Cada frasco de cultura2 75cm, transferência de 8 x 106 células juntamente com 12 mL de 37 ° C KSFM. Agite os frascos de cultura para garantir uma distribuição uniforme das células.</li>
	<li>Incube os queratinócitos em uma incubadora de 37 ° C, com 100% de umidade e 5% de CO2. Mude o meio após 2 dias e três vezes por semana. Células de passagem quando a cultura é 70-80% de confluencia, que leva cerca de 2 semanas, dependendo da taxa de proliferação de queratinócitos.</li>
</ol>
2. passagem de queratinócitos
<ol>
	<li>Calor a quantidade adequada de solução de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C numa incubadora. Uso de 4,5 mL de solução de tripsina-EDTA 0,05% para um frasco de cultura 75 cm2 .</li>
	<li>Remova as células médio e adicione frasco de cultura 4,5 mL/75 cm2 pré aquecido solução de tripsina-EDTA 0,05% para as células. Coloque o frasco de cultura na incubadora (37 ° C) e após cerca de 5 min, verifique sob o microscópio, se as células começaram a afrouxar.</li>
	<li>Quando aproximadamente 50% das células afrouxaram, Bata suavemente o frasco de cultura contra a mão para soltar as células restantes. Então, para inactivar a tripsina, adicionar 6 mL de RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) para o frasco de cultura 75 cm2 e transferir a suspensão de eritrócitos para tubos de 50 mL.</li>
	<li>Lave os frascos de cultura com 3 mL de RPMI 1640 + 2% FBS e adicionar aos tubos de 50 mL. Centrifugar as células por 10 min a 450 x g, à temperatura ambiente.
	<ol>
		<li>Ressuspender as células peletizadas em 10 mL de KSFM (37 ° C). Contar as células e transferir 3 x 106 células para um frasco de cultura 150 cm2 junto com 20 mL de KSFM (37 ° C). Agite suavemente o frasco de cultura para garantir uma distribuição uniforme das células. Congele as células, quando a cultura é confluente de 80-90%, o que leva cerca de 4 a 6 dias dependendo da taxa de proliferação de queratinócitos (ver secção 3, congelando o protocolo abaixo). Expanda os queratinócitos para gerar estoques congelados apropriados.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. congelamento dos queratinócitos
<ol>
	<li>Calor a quantidade adequada de solução de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C numa incubadora. Uso 9 mL da solução de tripsina-EDTA 0,05% para um frasco de cultura de2 a 150 cm.</li>
	<li>Remova as células médio e adicione frasco de cultura 9ml/150 cm2 pré aquecido solução de tripsina-EDTA 0,05% para as células. Coloque o frasco de cultura na incubadora (37 ° C) e após cerca de 5 min, verifique sob o microscópio, se as células começaram a afrouxar.</li>
	<li>Quando aproximadamente 50% das células afrouxaram, Bata suavemente o frasco de cultura contra a mão para soltar as células restantes. Então, para inactivar a tripsina, adicionar 12 mL de RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) para o frasco de cultura de2 a 150 cm e aspire a suspensão de células para tubos de 50 mL.</li>
	<li>Lave os frascos de cultura com 6 mL de RPMI 1640 + 2% FBS e adicionar aos tubos de 50 mL. Centrifugar os tubos por 10 min a 450 x g a 4 ° C. Prepare o celular gelada congelamento médio (KSFM + 10% de DMSO).</li>
	<li>Ressuspender as células em KSFM + 10% de DMSO, contar as células e congelar as células em uma densidade de 6 x 106 células/mL, usando de métodos de criopreservação de congelamento lento padrão12.</li>
	<li>Armazene os queratinócitos em nitrogênio líquido (fase vapor) até que esteja pronto para usar.</li>
</ol>
4. descongelar e cultivo queratinócitos congelados
<ol>
	<li>Descongele rapidamente os frascos apropriados congelados em banho maria a 37 ° C. Use etanol a 70% para limpar o exterior do cryovial. Transferir o número adequado de células (aproximadamente 15.000 células/cm2) para um balão de cultura e adicione imediatamente meio de cultura previamente aquecido (KSFM) para o frasco de cultura. Qualquer tamanho de frascos de cultura pode ser usado dependendo da instalação do experimento.</li>
	<li>Use 5 mL de meio de cultura para um frasco de cultura 25 cm2 .</li></ol>O número de células adicionado que o frasco de cultura pode variar, porque o crescimento das células varia de um doador para o doador. Incube as células em uma incubadora de 37 ° C, com 100% de umidade e 5% de CO2.
	<li>Alterar o meio depois de 2 dias e três vezes semanalmente usando fresco KSFM previamente aquecido. Nota: Nossos dados demonstraram que, em média, 95% das células isoladas pelo protocolo descrito aqui são positivas para o queratinócito-marcador cytokeratine-1413.</li>

<ol>
	<li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation.">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li><li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes:+key+immunocytes+of+the+integument.">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li><li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis.">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li><li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions.">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li><li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease.">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li><li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases.">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li><li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation.">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li><li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+(MMP-1)+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes.">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li><li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes.">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li><li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth:+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes.">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li><li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture.">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li><li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms.">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li><li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation.">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li><li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture.">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li><li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin.">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2008).</li><li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent.">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li><li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment:+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases.">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li><li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment.">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li></ol>

. O autor não tem nenhum conflito de interesses.

Aqui, descrevemos como isolar facilmente queratinócitos humanos primários da pele adulta e como a cultura deles em vitro. Este modelo pode ter uma aplicação ampla para a investigação da biologia das células epidérmicas e pode ser útil para pesquisadores interessados no estudo de doenças cutâneas.
Algumas das vantagens do protocolo descrito aqui é que, em contraste com os queratinócitos isolados do prepúcio neonatal obtido de recém-nascido machos submetidos à circuncisão, queratinócitos humanos primários de pacientes adultos estão isolados de homens e mulheres e pode incluir qualquer idade ≥18 anos. Assim, a diversidade biológica é muito maior nestas células comparado com queratinócitos do prepúcio neonatal. Além disso, pedaços relativamente grandes de amostras de pele podem ser obtidos de pacientes submetidos à cirurgia plástica, tais como cirurgia de redução de mama ou cirurgia para perda de peso.
Como mencionado acima a epiderme é organizada em diferentes camadas, correspondente à fase específica de diferenciação dos queratinócitos. A fim de estudar a biologia da pele, o modelo descrito aqui é limitado pela falta de um microambiente tridimensional. As diferentes camadas da epiderme, bem como os diferentes tipos de células presentes na pele não são imitadas neste modelo. Para superar isso, podem ser usados modelos equivalentes de pele humana, que consistem de um epitélio de múltiplas camado, onde os queratinócitos diferenciam após exposição a uma interface ar-líquido e assim, mais intimamente, imitando a epiderme nativo17, 18,19. Outro modelo que pode ser obtido a fim de estudar a biologia da pele é o modelo da pele ex vivo , que biópsias de pele são mantidas em culturas em uma interfase ar-líquido, como descrito anteriormente,20.

A pele é o maior órgão do corpo humano e serve como uma barreira protetora contra o ambiente externo. A pele é composta de duas camadas principais: a derme e epiderme, onde a epiderme constitui a camada mais externa da pele. O tipo mais abundante de células na epiderme é os queratinócitos que compreende mais de 95% da célula em massa1,2. Os queratinócitos são mantidos em vários estágios de diferenciação na epiderme e são organizados em camadas basais, espinhosos, granulares e cornificadas que correspondem às fases específicas de diferenciação3. A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, produzindo assim uma barreira intacta ao mundo exterior.
Os queratinócitos também representam a primeira linha de defesa contra patógenos na pele e, portanto, desempenham um papel importante na resposta imune inata4,5. Exposição dos queratinócitos a estímulos externos leva à ativação das vias de sinalização intracelulares e, posteriormente, a produção de um número de vários mediadores inflamatórios, incluindo citocinas, quimiocinas e peptídeos antimicrobianos. Estas proteínas derivadas de queratinócitos participarem na resposta inflamatória, recrutamento e ativação de células imunes como específico T células6,7, neutrófilos e células dendríticas. Assim, porque os queratinócitos desempenham um papel crucial em inúmeros processos biológicos, a lógica por trás da técnica apresentada aqui foi gerar um modelo in vitro para estudar a biologia da pele. Culturas de queratinócitos primários obtidas de prepúcio neonatal são frequentemente utilizadas para estudar pele biologia8,9. No entanto, com a técnica descrita aqui, queratinócitos de ambos os sexos são obtidos resultando em uma maior diversidade biológica das células.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e a geração de queratinócitos humanos primários da pele de adulto, incluindo manutenção e congelamento de queratinócitos. O objetivo geral deste método é gerar queratinócitos humanos primários que podem ser usados como um modelo para estudar Biologia cutânea in vitro.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>KSFM supplements</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Supplements for KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimethyl sulfoxid</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Cell culture medium additive</td></tr><tr><td>Sterilization filter</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Syringe filter with a pore size of 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Used to trypsinize cells</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>-</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>-</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Used to inactivate trypsin</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>-</td><td>-</td><td>Forceps from any company can be used</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>-</td><td>-</td><td>Scissors from any company can be used</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Scalpels from any company can be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Gauze pads</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>Gauze pads from any provider can be used</td></tr><tr><td>Foot planer</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>Foot planer from any provider can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Petri dishes from any provider can be used</td></tr><tr><td>Metal filter</td><td>-</td><td>-</td><td>In-house 1 mm hole size metal filter</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>NUNC</td><td>156499</td><td>-</td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>TTP</td><td>90151</td><td>-</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Used to trypsinize cells when passaging</td></tr></tbody></table>

generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin

A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, mantendo assim uma barreira mecânica ao mundo exterior. Além disso, os queratinócitos desempenham um papel essencial na iniciação, manutenção e regulamento de epidérmicos respostas imunes por ser parte do sistema imunológico inato, respondendo a estímulos antigênicos de forma rápida e não específica. Aqui, descrevemos um protocolo para isolamento de queratinócitos humanos primários da pele de adulto e demonstrar que estas células respondem à diferenciação terminal induzida por cálcio, como medido por um aumento da expressão da involucrin de marcador de diferenciação. Além disso, mostramos que os queratinócitos isolados são responsivos à IL-1 β-induzida por ativação de vias de sinalização intracelulares, medida pela ativação da via MAPK p38. Tomados em conjunto, descrevemos um método para isolamento e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele adulta. Porque os queratinócitos são o tipo de célula predominante na epiderme, este método é útil para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea in vitro.

Diferenciação Terminal induzida por cálcio Queratinócitos humanos passam por diferenciação terminal após tratamento com cálcio14,15,16. Queratinócitos humanos primários foram isolados e cultivados conforme descrito no protocolo acima. Quando aproximadamente 50-60% de confluencia, as células foram estimuladas com cálcio (1.2 mM) ou veículo e fotos das células foram tiradas no dia 0, 1 e 2. A Figura 1 mostra as alterações morfológicas dos queratinócitos observadas após estimulação de cálcio.
A expressão de Involucrin é aumentada após estimulação de cálcio Culto de queratinócitos humanos foram cultivados até aproximadamente 50-60% de confluencia depois que as células foram estimuladas com cálcio (1.2 mM) ou um veículo para 24 e 48 h. Demonstrámos que, em paralelo com a maior diferenciação das células como observado pelas mudanças morfológicas dos queratinócitos, a expressão de RNAm da involucrin de marcador de diferenciação aumentou significativamente após a estimulação de cálcio. Após 24 e 48 h de estimulação, a expressão de RNAm de involucrin foi aumentado em aproximadamente 5.5-fold e 3.5-fold, respectivamente, em comparação com o veículo (Figura 2).
Fosforilação de IL-1 β-induzida de p38 MAPK Para determinar se os queratinócitos humanos isolados foram responsivos à induzida por citocinas ativação das vias de sinalização intracelulares, queratinócitos cultivados foram estimulados com IL-1 β (10 ng/mL) para vários pontos de tempo. Dentro de 5 min, IL-1 β estimulação levou a uma rápida ativação/fosforilação de p38 MAPK, conforme determinado pela mancha ocidental. Após 1 h, fosforilação de IL-1 β-induzido p38 MAPK tinha retornado ao nível basal (Figura 3). Apenas a forma fosforilada da p38 MAPK foi aumentada, como IL-1 β estimulação não teve efeito sobre o nível de proteína total de p38 MAPK (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56863/56863fig1.jpg"> 
Figura 1 : Imagens representativas de induzida por cálcio diferenciação dos queratinócitos. Queratinócitos humanos primários cultivados foram estimulados com veículo (dH2O) ou cálcio (1.2 mM) para os pontos de tempo indicado. (- E) Imagens de contraste de fase de queratinócitos no dia 0 (A), dia 2 e dia 1 (B e C) (D e E) após a estimulação de cálcio. Barra de escala = 100 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56863/56863fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56863/56863fig2.jpg"> 
Figura 2 : Aumento da expressão de RNAm de involucrin após estimulação cálcio. Cálcio (1.2 mM) ou veículo (dH2O) foi adicionado ao culturas queratinócitos humanos primários para os pontos de tempo indicado (n = 3). RNA foi isolado e a expressão da diferenciação marcador involucrin analisado por qPCR. RPLP0 a expressão de RNAm (P0 grande da proteína Ribosomal) foi usada para normalização. Os resultados representam média ± D.P. de três experimentos diferentes. p &#60; 0.05 em comparação com o veículo. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56863/56863fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56863/56863fig3.jpg"> 
Figura 3 : IL-1 β-induzido a fosforilação de p38 MAPK. Queratinócitos humanos primários cultivados foram estimulados com veículo (PBS + 0,15% BSA) ou IL-1 β (10 ng/mL) para os pontos de tempo indicado. Extratos de proteínas foram isolada e ocidental análise mancha, usado para medir o nível fosforilado de p38 MAPK e total p38 MAPK. Carga igual foi verificada pela incubação com um anticorpo anti-β-actina. Dados de um experimento representativo de três são mostrados. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56863/56863fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.2K visualizações.  Aarhus University Hospital. A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.

Vídeo: Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Biologia do Desenvolvimento

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biologia

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Bioengenharia

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

Geração de culturas primárias para imagens de células vivas de queratinócitos

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Neurociência

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos Orais Primários do Paladar do Rato Adulto

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

Isolamento de queratinócitos da pele humana: um método para cultivar queratinócitos primários de amostras de pele

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...