Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (AR061164-01A1 R01).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso para o Maine Medical Center Research Institute e institucional Cuidado Animal.
1. coleção tubos de preparação
<ol><li>Fazer os meios de cultura BMSC, completando meio essencial mínimo α (α MEM) com 10% de soro Fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Coloque 100 µ l de BMSC de meios de cultura em tubos de 1,5 mL microcentrifuge. 3 ossos geralmente vão caber em um único tubo então preparar conformemente.</li>
	<li>Corte as extremidades das pontas de pipetas da 200 µ l de suficiente para que eles se encaixam em tubos de centrífuga. Insira as pontas dentro dos tubos e certifique-se de que as tampas podem fechar antes de colocar os tubos no gelo. Nota: Como alternativa, tubos de microcentrifuga 0,75 mL com o corte de pontas podem ser inseridos no tubo microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
</ol>2. colheita de ossos de ratos
<ol><li>Eutanásia em animais usando CO2 , seguido por deslocamento cervical e pulverizá-los com etanol a 70%. Nota: Certifique-se que são utilizados animais de mesmo sexo e, de preferência, da mesma idade. Rotineiramente usamos animais com idades entre 7 a 8 semanas. Recomendamos que o pool de células pelo menos 3 animais por grupos experimentais para produzir uma população de células representativas e reprodutíveis a melhor.</li>
	<li>
Coloque o mouse euthanized em suas costas num tabuleiro de dissecação. Use fórceps para criar uma tenda de pele no abdômen. Faça uma pequena incisão (cerca de 1 cm) com uma tesoura estéril de dissecação. Descasca a pele para os membros e os pés do corte para expor a parte inferior do abdome e as pernas.
	<ol>
<li>Corte abaixo do tornozelo conjunta para remover o pé. Corte ao longo da crista ilíaca no quadril para separar a cabeça do fêmur do osso ilíaco. Enquanto o mouse está ainda em suas costas, fazer uma incisão no meio do osso ilíaco para separar os dois ossos ilíacos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando lenços fiapos, cuidadosamente remova o músculo os fêmures, tíbias e ossos ilíacos. Nota: Corte o máximo dos tendões e músculos do osso como torna possível a limpeza mais rápida e mais fácil com as toalhitas de fiapos (por exemplo, kimwipes). Tenha cuidado ao manipular os ossos como eles tendem a quebrar facilmente e sua fragilidade pode ser aumentada com determinados genótipos.</li>
	<li>Uma vez que todas as amostras têm sido dissecadas, colocá-los em PBS no gelo e mover-se para uma capa de cultura estéril para as etapas restantes de isolamento. Nota: Trabalhar assepticamente possível reduzirá o potencial de contaminação nas culturas.</li>
	<li>Faça pequenos cortes (cerca de 1 a 2 mm) em ambas as extremidades proximais e distais dos ossos antes de colocá-los em dicas seccionadas dentro dos tubos de centrífuga. Nota: Certifique-se para cortar uma quantidade suficiente para que a medula pode ser centrifugada para fora; no entanto, deve ter cuidado para evitar cortar demais como populações de células tendem a variar com base na proximidade dentro do espaço de medula.</li>
	<li>Centrifugação a 10.000 x g por 15 s à temperatura ambiente. Certifique-se que todo o tutano é liberado e peletizado na parte inferior do tubo de 1,5 mL, enquanto que os ossos estão dentro as inserções (ou 200 µ l pipeta ponta ou 0,75 mL microcentrifuga tubo). Depois de toda a medula é recolhida, remova as inserções com os ossos dos tubos de coleta. Nota: Se é liberada toda a medula, os ossos aparecerá brancos. No entanto, se a medula permanece em certos ossos, tente extremidades de corte novamente e centrifugar.</li>
</ol>3. suspensão
<ol><li>Usando uma agulha 25g, puxe a célula pelotas acima e para baixo lentamente para separar grupos e combinar todas as amostras em um tubo cônico único 15 mL. Adicione 10 mL de meio de cultura BMSC por 500 µ l de amostras.</li>
	<li>Coloque um filtro de 70 µm em cima de um tubo cónico de 50 mL e a suspensão de células atravessam este filtro para retirar fragmentos de osso possível.</li>
</ol>4. chapeamento e cultura das populações mistas de células da medula óssea (BMCs Total)
Nota: As células são cultivadas a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO2.
<ol><li>Calcular o número de células e placa-los em 1.0 x 106 células/cm2 em meios de cultura. Permita a 72 h de cultura mista de células anexar. Nota: Recomendamos diluir a suspensão de célula 20 x em meios de cultura e diluir novamente em trypan azul antes de contar as células usando um hemocytometer. Para camundongos C57Bl6/J machos de 7 semanas de idade, nós rotineiramente ceder um número de celular de cerca de 50 x 106 células mas idade, sexo e tensão podem afetar o número de celular grandemente. Nota: Uma população de mistura das pilhas deve anexar na parte inferior da cultura bem.</li>
	<li>Depois de 72 h, remova a mídia e substituí-lo com a nova mídia. Continue mudando os meios de comunicação cada outro dia e verificar se há confluência. Quando as células atingem 80-100% confluência, eles estão prontos para a diferenciação. Nota: Porque esta cultura é misturada com BMSCs e linfócitos, isso pode ser usado diretamente para osteoblastogenesis, adipogenesis, bem como osteoclastogenesis.</li>
</ol>5. chapeamento e cultura da população de Split de BMSCs (BMSCs aderentes)
Nota: As células são cultivadas a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO2.
<ol><li>Placa de todas as células coletadas dos fêmures, tíbias e ilíacos ossos de um rato em um prato de cultura de 10 cm (55 cm2 de área de cultura). Nota: Quando o pool de camundongos C57BL/6J de 2-3, nós tipicamente placa esta população 'total' da medula óssea em um balão de2 a 150 cm.</li>
	<li>Após 48 h de cultura mista, remova a mídia de cultura (que contém o linfócitos não-aderente). Se osteoclastogenesis experiências devem ser executadas, definir esta população de células não-aderente à parte (veja seção 7), se não, aspirado e descartar essas células.</li>
	<li>Lave o placa/frasco com PBS como cuidadosamente para não perturbar as células anexadas.</li>
	<li>Remover o PBS e levantar as células adicionando tripsina 0,25% e incubar a 37 ° C, durante 1-3 min Quench a tripsina adicionando mídia celular à suspensão de células. Neste ponto, o BMSCs, que agora é levantado, que podem ser contado (como feito anteriormente no passo 4.1) e chapeado para experiências futuras.</li>
	<li>Calcule o número de células necessárias para o chapeamento. Centrifugue o volume necessário de suspensão de células a 1.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Nota: As células normalmente são banhadas com base em experiências de ponto de extremidade. Por exemplo, se deve ser isolado da proteína/RNA nós tipicamente chapear em uma densidade mais elevada (~1.0-2.0 x 106 células/poço em placa de 6).</li>
	<li>Remova a mídia e ressuspender as células no volume de meios de cultura necessário para o chapeamento. As células em meios de cultura, de acordo com as experiências da placa e lhes permitem anexar por alguns dias. Quando os BMSCs chegarem a confluência, dirijam-se para realizar a diferenciação.</li>
</ol>6. diferenciação de BMSCs
<ol><li>
Osteoblastos
	<ol>
<li>Faça mídia de diferenciação osteoblástica adicionando 800 µ l de 1m β-glicerol fosfato em PBS e 200 µ l de ácido ascórbico de 0,5 M em PBS a 99 mL de meios de cultura BMSC (consulte a etapa 1.1 para a composição dos meios de cultura a BMSC).<ol>
<li>Uma vez que as culturas de BMSCs (BMCs totais da etapa 4.3) ou aderente BMSCs da etapa 5.6 são confluentes, diferenciá-los em osteoblastos alternando-se os meios de cultura para mídia de diferenciação osteoblástica.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Substitua a mídia diferenciação todos os dias. Células começam a produzir nódulos brancos de mineralização. Visualizá-las a olho nu no fundo do poço; Este processo pode ocorrer dentro de alguns dias a 3 semanas.<ol>
<li>Para avaliar osteoblastogenesis, realize a coloração da fosfatase alcalina e/ou Von Kossa coloração sobre os poços, conforme descrito na seção 8. Nota: Altere a mídia cuidadosamente pela inclinação das placas em um ângulo ligeiro para evitar perturbações da monocamada a célula.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipócitos
	<ol>
<li>Faça mídia base adipócito pela mistura de 90 mL de meio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM) glicose alta, 10ml de soro Fetal bovino, 1 mL de penicilina/estreptomicina, 100 µ l 20mm Rosiglitazona e 100 µ l de 2 mM de insulina. Se necessário, armazene essa mídia a 4 ° C para a semana durante o experimento de diferenciação.</li>
		<li>Faça mídia de indução dos adipócitos adicionando-se 200 µ l de 62,5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) e 25 µ l de 1mm dexametasona a 25 mL de mídia de Base dos adipócitos.</li>
		<li>Uma vez que as culturas de BMSCs (BMCs totais da etapa 4.3) ou aderente BMSCs da etapa 5.6 são confluentes, altere os meios de comunicação para mídia de indução dos adipócitos. Considere este dia 0 de diferenciação.</li>
		<li>Após 48 h, remova a mídia e atualizar a cultura com mídia de indução dos adipócitos.</li>
		<li>No dia 4, alterne para a mídia de base dos adipócitos. Nota: Gotículas lipídicas podem começam a aparecer tão cedo quanto dia 2 ou 4 dias.</li>
		<li>No dia 7, observe que as células acumularam gotículas lipídicas máxima e exibir um fenótipo semelhante a dos adipócitos maduros. Não cultura por esse ponto, como pode resultar morte/destacamento de célula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. diferenciação dos linfócitos em osteoclastos
<ol><li>Faça Osteoclast diferenciação mídias pela adição de 50 µ l de 25 µ g/mL de Receptor ativador de VHC ligante (RANKL) e 15 µ l de 25 µ g/mL de macrófagos (mCSF) fator estimulante da colônia para 25 mL de meio de cultura BMSC.</li>
	<li>Depois os BMCs totais (da etapa 4.3) ou as células não-aderente (da etapa 5.2) são anexadas ao poço, meios de cultura pode ser alternado para mídia de diferenciação do Osteoclast. Repor os meios de diferenciação todos os dias.</li>
	<li>Observe as culturas osteoclast cada dia sob um microscópio com ampliação de 10x. Observe que osteoclastos se fundem e formam células multinucleadas, tipicamente em torno de 5-7º dia de diferenciação.</li>
</ol>8. coloração
<ol><li>
Osteoblastos Nota: Para a coloração da fosfatase alcalina (AP), que muitas vezes usam uma coloração AP kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com as orientações.<ol>
<li>Execute AP coloração, seguindo as orientações do fabricante do kit.<ol>
<li>Aspirar a mídia e enxágue células com PBS. Consertar as células com 4% paraformaldeído (PFA) em PBS por 12 min à temperatura ambiente.</li>
			<li>Entretanto, fazer a solução de AP usando os reagentes do kit de coloração adicionando 500 µ l do AP nitrito de sódio, solução alcalina-FRV 500 µ l e misturando delicadamente; deixe descansar por 2 min. Adicione 22.5 mL dH2O e 500 µ l naftol AS-BI alcalina. Misture suavemente. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.</li>
			<li>Uma vez que as células são fixos, enxaguar com PBS e adicionar solução de AP a cada poço (1 a 2 mL por bem). Cubra com papel alumínio e deixe a mancha por 30 min em temperatura ambiente protegida da luz. Aspirar a solução, lavar com água destilada e deixar a placa secar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adquira imagens de colônias manchadas usando uma câmera para observar células positivas de fosfatase alcalina.</li>
		<li>Como alternativa, execute Von Kossa em vez de coloração da fosfatase alcalina. Por isso, poços de lavagem com água destilada como qualquer restantes PBS precipitará com nitrato de prata.
		<ol>
<li>Consertar as células com 4% PFA em PBS por 12 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione o suficiente solução de nitrato de prata 5% para cobrir o poço e expor à luz forte por 1h à temperatura ambiente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Remova a solução de nitrato de prata e lave cada poço com água destilada. Adicionar a solução de tiossulfato de sódio a 5% para as células e deixar repousar durante 3 min.</li>
		<li>Aspirar o tiossulfato de sódio e lave com água destilada. Deixe a placa secar e observar o depósito mineral corado em marrom escuro/preto com olho nu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipócitos
	<ol>
<li>Para a mancha de óleo vermelho O (ORO), consertar as células usando a 10% neutro tamponado formol por 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Entretanto, fazer a solução de estoque ORO pela dissolução de 0,035 g em 10 mL de isopropanol. Isto é suficiente para uma placa de 6. Misturar e transferir a solução usando um filtro de papel (poros tamanho 11 µm).</li>
		<li>Fazer a solução de trabalho de ORO diluindo 9 mL de solução-mãe de ORO com 6 mL de água destilada. Deixe a solução em um roqueiro até que esteja pronto para uso.</li>
		<li>Preparar o isopropanol 60% em água destilada (suficiente para cobrir cada um fazer bem).</li>
		<li>Uma vez que as células são fixos, remova o fixador e lave uma vez com água destilada. Substitua a água com a solução de isopropanol 60% por 1 min. Nota: Adicione o líquido lentamente enquanto derrubando a placa; adipócitos desalojar muito facilmente.</li>
		<li>Remover o isopropanol e adicionar solução de trabalhar bastante ORO para cobrir todas as células. Incube durante 15 min em um balancim de baixa velocidade à temperatura ambiente. Remover ORO e lavar duas vezes com água destilada. Nota: neste ponto, gotículas lipídicas ORO-manchadas podem ser visualizadas sob o microscópio.</li>
		<li>Para quantificar o ORO, destain o ORO, adicionando 1 mL de isopropanol 100% a cada poço e agite-o lentamente por 10 min.</li>
		<li>Entretanto, preparar uma série de diluição para criar uma curva padrão baseada nos seguintes 8 padrões usando solução de trabalho de ORO (2.100 µ g/mL) e isopropanol como diluente: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 e 0 µ g/mL.</li>
		<li>Carregar a 200 µ l das normas e as amostras destained em triplica em um prato e ler a absorvância a 490 nm.<ol>
<li>Determine a concentração de ORO para cada amostra com base na curva padrão. Nota: Recomendamos que normalizar a concentração ORO para o celular. Número do celular pode ser quantificado pela coloração violeta cristal ou a quantidade de DNA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclastos Nota: Quando estiver pronto, nós sugerimos coloração osteoclastos para kit de resistente ao tartarato ácido fosfatase (armadilha) usando a coloração de armadilha (ver Tabela de materiais).<ol>
<li>Armadilha de coloração, corrigi células por 30 min à temperatura ambiente com glutaraldeído 2,5% em PBS. Entretanto, fazer a solução de armadilha pela mistura de 50 µ l da solução de Base rápido granadas, 50 µ l de nitrito de sódio, 4,55 mL de água destilada, 50 µ l de Napthol AS-Biphosphate, 200 µ l de solução de acetato e solução de tartarato de 100 µ l.</li>
		<li>Aspire o fixador e lave as células com PBS duas vezes antes de adicionar a solução de armadilha para 1 h a 37 ° C.</li>
		<li>Lavar com água destilada antes da contagem de osteoclastos sob um microscópio (ampliação 10x). As células de armadilha+ aparecem roxas com 3 ou mais núcleos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

Os autores divulgar que eles têm não financeiro conflito de interesses.

Neste artigo, apresentam-se dois métodos de cultura de BMSCs com suas vantagens e limitações. Isolar as células provenientes da medula óssea é um processo relativamente fácil. No entanto, a obtenção de uma população de células representativa dos progenitores osteoclástica ou células-tronco mesenquimais pode ser um desafio devido ao ambiente celular diverso da cavidade da medula.
Cultivo a totalidade do conteúdo da medula óssea fornece uma representação perto do microambiente no vivo . No entanto, isolar células de diferentes grupos de ratos (genótipos, tratamentos, idades, etc.) pode resultar em um número muito diferente de BMSCs ou linfócitos no início do experimento em vitro . Portanto, separar BMSCs e linfócitos e re-chapeamento-lhes permitam um melhor controle sobre o número de células no início do experimento diferenciação. No entanto, reduzindo a heterogeneidade da cultura de pilha pode afetar os resultados do BMSCs ou linfócitos como ambos secretam fatores que influenciam a diferenciação osteoclástica e mesenquimal. É importante considerar essas limitações ao projetar o isolamento e a cultura da BMSCs e linfócitos.
A multidão de populações de células presentes na medula óssea pode apresentar desafios na interpretação dos dados. Além de linfócitos e BMSCs, o microambiente da medula óssea também contém células imunes diferenciadas, glóbulos vermelhos, células endoteliaisetc. Essas populações podem permanecer na fração aderente ou não aderente e, portanto, podem afetar os resultados experimentais. BMSCs de triagem pode ser uma opção para atingir uma população de células "mais pura". Com efeito, BMSCs são pensados para expressar CD34 enquanto linfócitos fazer não10. No entanto, foi também sugerido que a falta de CD34 na superfície do BMSCs pode ser o resultado da cultura e um estudo mostrou que um subconjunto não-aderente de CD34+ BMSCs poderia se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos11, 12. portanto, quando se considera a classificação para isolar BMSCs, uma matriz de marcadores bem definidos deve ser concebida previamente. Outros obstáculos à célula classificação são tempo e custo. Na verdade, adicionar um passo classificação poderia aumentar o tempo do isolamento protocolo consideravelmente bem como um aumento significativo no custo. Em resumo, classificação células apresentam desafios técnicos que podem reduzir o rendimento e a qualidade de BMSCs.

BMSCs murino primárias são comumente usados como um modelo in vitro de células-tronco mesenquimais, desde a sua descoberta no início dos anos 19801. Na verdade, culturas de células de plástico aderente liberadas da cavidade da medula óssea dos ossos longos mantêm a capacidade de ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos, condrócitos ou adipócitos em muitos estudos2,3, 4 , 5. no entanto, a medula óssea é um tecido exclusivo composto de muitas populações de células diferentes, incluindo, mas não limitado a, BMSCs, linfócitos, células endoteliais e imunes. Assim, o isolamento e as técnicas de cultura podem render populações de células com diferente homogeneidade. Usando essas técnicas para testar a potencial de diferenciação de células pode ser um desafio. Por exemplo, ao comparar células de ratos com diferentes genótipos, começando com uma população de célula mista limita a interpretação dos dados. Inversamente, a obtenção de populações homogêneas de BMSCs e linfócitos pode ser tecnicamente difícil e pode não ser tão representativa de um modelo ex vivo .
Em nosso laboratório, nós estamos principalmente interessados na utilização de BMSCs devido ao seu potencial a ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos. Aqui, apresentamos técnicas de isolamento BMSCs e linfócitos e cultura usada para avaliar osteoblastogenesis ou adipogenesis em vitro, assim como culturas de linfócitos de se diferenciarem em osteoclastos. Um método utiliza uma população mista de células da medula óssea (BMCs) contendo BMSCs e linfócitos diretamente apropriados para adipogenesis, osteoblastogenesis e osteoclastogenesis (chamado BMCs Total). Este método é uma representação de ex vivo perto da heterogeneidade encontrada entre as células do microambiente da medula óssea. Outro método separa aderente de células não-aderentes na tentativa de populações "puras" de cultura de BMSCs e linfócitos (chamados BMSCs aderente). O método posterior permite a cultura de pilha experimentos para iniciar com um número mais exato de BMSCs ou linfócitos e reduz o potencial de complexos efeitos indiretos de outras populações de células que permanecem na cultura. Ambos os métodos foram previamente publicados e usados para tratar diferentes pesquisas perguntas6,7,8,9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="636">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200&#956;L pipet tips&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">17014401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL conical tube</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Science</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70&#956;m filters</td>
			<td style="width:135px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% trypsin</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:135px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Nitrate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter Grade 1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:135px;">Electron</td>
			<td style="width:119px;">16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM&#945;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rosiglitazone</td>
			<td style="width:135px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:119px;">717410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IBMX</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RANKL</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">310-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mCSF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axio Observer inverter microscope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

Células do estroma da medula óssea (BMSCs) constituem uma população de células rotineiramente utilizada como uma representação de células-tronco mesenquimais in vitro. Eles residem dentro da cavidade da medula óssea, ao lado de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos), que pode dar origem a células vermelhas do sangue, progenitores imunes e osteoclastos. Assim, extrações de populações de células resultados da medula óssea em uma mistura muito heterogénea de diferentes populações de células, que pode apresentar desafios em delineamento experimental e confundir a interpretação dos dados. Várias técnicas de cultura e isolamento foram desenvolvidas em laboratórios a fim de obter mais ou menos homogêneas populações de BMSCs e linfócitos in vitro. Aqui, apresentamos dois métodos para isolamento de BMSCs e linfócitos de ossos longos de rato: um método que produz uma população mista de BMSCs e linfócitos e um método que tenta separar as populações de duas células com base em aderência. Ambos os métodos fornecem células apropriadas para osteogênico e adipogenic diferenciação dos experimentos de ensaios, bem como funcionais.

Visão geral das culturas de células As técnicas de duas cultura permitem a avaliação da diferenciação em uma população mista de BMCs composto de BMSCs e linfócitos (BMCs Total, figura 1A) ou de uma população de BMSCs separou-se linfócitos (BMSCs aderente, figura 1B). 48 horas depois que as células da medula são isoladas e chapeado (Figura 1), eles rapidamente anexar a parte inferior da placa de cultura de plástico e tendem a formar uma monocamada. Uma vez que as células alcançar confluência (Figura 1), pode ser usados para ensaios de diferenciação.
BMSCs diferenciadas em osteoblastos Confluentes culturas de BMSCs podem ser diferenciadas em osteoblastos, usando uma mídia osteogênica, composta de ácido ascórbico e β-glicerol fosfato (Figura 2A, B). Depois de alguns dias de diferenciação, osteoblastos começam expressando a fosfatase alcalina (Figura 2). Diferenciação mais provocará a produção de matriz osteoide e, finalmente, a mineralização dessa matriz (Figura 2D). Curiosamente, apenas uma proporção das células irá diferenciar em osteoblastos em vitro. Com efeito, a coloração com violeta de cristal (Figura 2E) revela que não todas as células expressam fosfatase alcalina ou mineralização da placa.
BMSCs diferenciadas em adipócitos Adipogenesis pode ser testado em culturas de BMCs mistos, bem como sobre a população de células mais homogênea. Como observado com diferenciação osteoblástica, se as populações mistas (Figura 3A) ou as populações de split (Figura 3B) são usadas, apenas uma proporção das células são adipogenic. Adipócitos aparecem redondos com múltiplos vacúolos de lipídios que podem ser manchados de vermelho com ORO (Figura 3). Em nossa experiência, sempre aparecem em vitro adipócitos multi vacuolated ao contrário dos adipócitos na vivo branco. Diferenças nas condições de genótipo ou cultura podem aumentar adipogenesis a um ponto onde os adipócitos desanexar e flutuam na placa de cultura. Para resolver esse problema, o experimento adipogenesis pode parar em um ponto do tempo anterior.
Linfócitos diferenciados em osteoclastos Osteoclastogenesis podem ser induzidas nas culturas, completando os meios de comunicação com mCSF e RANKL. Linfócitos começam a fundir-se rapidamente para formar as células multinucleadas que mancham positivas para a armadilha (Figura 4A). Os osteoclastos são capazes de resorbing matriz mineral em vitro e, portanto, podem ser usados para avaliar a atividade osteoclástica (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56750/56750fig1.jpg"> Figura 1: Cronograma esquemática dos protocolos para a cultura de linfócitos e de BMSCs. Técnicas de cultura diferente para produzir BMCs Total é composto por uma população mista de células (A) ou aderente BMSCs (B). Imagem representativa da cultura BMSCs isolada de ratos C57B6/J 48hr após sua chapeamento (C) e depois eles dividem-se de linfócitos (D). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56750/56750fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56750/56750fig2.jpg"> Figura 2 : Imagens de poços de BMSCs culturas diferenciadas em osteoblastos. BMSCs antes (A) e depois (B) sendo colocada na mídia osteogênica. Os osteoblastos podem ser manchados para expressão de fosfatase alcalina em rosa (C) e para o depósito mineral em marrom (D). Cristal violeta pode ser usada para representar o número de células após diferenciação (E). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56750/56750fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56750/56750fig3.jpg"> Figura 3: Imagens representativas das culturas de BMSCs diferenciados em adipócitos. ORO-manchado adipócitos obtidos de uma população mista de BMSCs (A) e uma cultura de divisão (B) após 7 dias em adipogenic mídia. Imagem de um adipócito manchada de ORO (C). Quantificação de ORO após 7 dias em mídia adipogenic antes (D) e (E) normalização a absorvância de violeta cristal. Dados são apresentados como meio com barras de erro, que representam o erro padrão da média. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56750/56750fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56750/56750fig4.jpg"> Figura 4: Culturas de linfócitos diferenciados em osteoclastos. ARMADILHA de coloração dos osteoclastos, aparecendo como grandes células multinucleadas de roxo-rosa (A). Mineralizado superfície manchada de preto por Von Kossa com reabsorção poços deixados pelos osteoclastos diferenciados de linfócitos após 7 dias (B). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56750/56750fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K visualizações.  Maine Medical Center Research Institute. Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Vídeo: Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Biologia do Desenvolvimento

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Um método enzimático para a Salvação da Células-Tronco Mesenquimais de amostras Clotted Medula Óssea

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Isolamento de células progenitoras Mesangiogenic (PPM) de humano Medula Óssea

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolamento de rato Endometrial epiteliais e estromais para células<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...