O método do ritmo foi desenvolvido e otimizado por vários membros do grupo de Dupree (Universidade de Cambridge, UK) ao longo dos anos, e agradecemos todas as suas contribuições. Este trabalho foi financiado no âmbito do Instituto de bioenergia comum DOE (http://www.jbei.org) suportado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, escritório de biológicos e investigação ambiental, através de contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Laboratório nacional de Berkeley e o departamento de energia dos EUA. Agradecemos também Thea Pick e Vy Ngo para ajuda com a preparação das amostras de csla9 .

1. colheita de Material vegetal <ol><li>colher material de planta fresco (~ 20 mg) e, imediatamente, submirja em etanol a 96% (v/v) e incubar a 70 ° C por 30 min; isto desativa qualquer parede celular presentes enzimas degradantes. Para material seco, comece pela etapa 2. 
	Cuidado: O álcool etílico é inflamável. 
	Nota: Uma única folha de haste ou Roseta irá fornecer material suficiente para análise. No entanto, menos erros surgirem se uma maior quantidade de tecido é agrupada e analisada desde que isto é mais fácil para pesar e lidar com.</li>
	<li>Registrar cuidadosamente o tipo de tecido e grau de desenvolvimento, como estrutura de polissacarídeo varia com os dois. Por exemplo, com Arabidopsis thaliana (usado aqui), fase o tecido de acordo com os métodos de Boyes et al 15 Nota: Este protocolo, usamos a metade inferior da haste da inflorescência, onde a primeira síliqua é totalmente alongada mas não amarelamento.</li></ol>
 2. preparação de álcool insolúvel resíduo (ar) <ol><li>preparar ar, seguindo o método de Mortimer et al 9 ou outro método semelhante, a fim de produzir um pó falta de açúcares solúveis, como sacarose e amido.</li>
</ol> 3. Alíquotas e pré-tratamento de ar Nota: A quantidade exata de ar necessária para cada amostra dependerá do (a) a abundância do polissacarídeo de interesse no material e (b) o tamanho médio dos oligossacarídeos, lançado pela o GH. O método adiciona uma molécula fluorescente ao final de cada oligossacarídeo, reduzindo assim o número de oligossacarídeos determina a sensibilidade do experimento. Como uma diretriz, para glucomannan no tronco de Arabidopsis digerido com GH5/GH26 (como descrito), 500 µ g é recomendado 11, Considerando que para xilana em tronco de Arabidopsis digerido com GH11, recomenda-se 100 µ g como em Mortimer &#39; estudo s 3. <ol><li>pesa ar (10-15 mg) em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicionar H 2 O a uma concentração final de 2 mg/mL. Vórtice para conseguir uma suspensão mesmo. Se isto é problemático, usar um homogeneizador de vidro para ajudar neste processo.</li>
	Tubos <li>alíquota 500 µ g em microcentrífuga. Alíquotas utilizando uma centrífuga a vácuo a seco (veja a Tabela de materiais) durante a noite em 30 ° C.</li>
	<li>Pré-tratamento de ar com 1 M de NaOH (20 µ l) por 1h à temperatura ambiente; isto de acetylates os polissacarídeos e incha as microfibrilhas de celulose, rompendo a estrutura de biomassa e permitindo o acesso de GH. 
	Nota: Este passo pode ser ignorado para polissacarídeos purificados. Cuidado &#8211; ácido/base forte.
	<ol><li>Incluem uma alíquota para um controle de ar não-enzimática (tratados da mesma forma como todas as amostras, exceto passo 4.1. é excluído).</li>
	</ol></li> <li>Adicionar 200 µ l de H 2 O e 20 µ l 1m HCl para neutralizar. Teste que o pH é ~ 6-7, removendo 1 µ l e mancha-lo em tiras de papel indicador de pH.</li>
	<li>De amónio de 1m adicionar 50 µ l de tampão de acetato, pH 6.0 (ou qualquer que seja o pH é apropriado para o GHs utilizado no estudo) e H 2 O para dar um volume total de 500 µ l. 
	Nota: Acetato de amônio é usado desde que sublima-se após a secagem, e então não adiciona sal adicional à amostra. Um excesso de sal pode levar a banda-forma pobre e resolução sobre o gel ritmo.</li>
</ol> 4. Hidrólise do ar com Glycosyl Hydrolases (GHs) Nota: como mencionado na discussão, a pureza do GHs é crítica. Use somente heterologously expressado, afinidade purificado de enzimas. Após o recebimento de cada lote do fabricante, hidrolisar alíquotas definidas de substrato (por exemplo, 500 µ g ar) com o aumento da quantidade de GH durante a noite (por exemplo, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ l) (3 unidades / µ l). Quando há um excesso de GH, a impressão digital ritmo vai olhar idêntico. Um excesso de enzima é necessário para entregar um resultado reprodutível, porque deve estar certo de que a reação de hidrólise aproxima-se o ponto de extremidade.
Controle <ol><li>Adicionar uma quantidade pré-determinada (veja acima), de mannanases (GH5 e GH26 11) para as alíquotas de ar no buffer da etapa 3.5, bem como um positivo (30 µ g de glucomannan konjac) e um controle negativo não-ar (mistura de enzima em um tubo vazio). Vórtice e em seguida girar brevemente para recolher a mistura de reação no fundo do tubo.</li>
	<li>Incubar durante uma noite a 37 ° C (ou a temperatura apropriada para o GH de escolha), com agitação suave (~ 100 rpm).</li>
	<li>Parar a reação incubando a 95 ° C por 20 min. 
	Nota: Tampas de Cap podem ser usadas para selar os tubos de microcentrífuga flip-top.
	<ol><li>Centrífuga usando uma microcentrífuga de bancada superior na velocidade máxima por 10 min e reter sobrenadante.</li>
	</ol></li> <li>Resuspenda o pellet em 250 µ l H 2 O, centrífuga como acima e reter sobrenadante.</li>
	<li>Combinar ambos os sobrenadantes e seque em uma centrífuga a vácuo (veja a Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 3 h ou durante a noite sem aquecimento).</li>
</ol> 5. Elaboração de normas Oligosaccharide <ol><li>estoque de 1 mM de preparar soluções em H 2 O da manose (homem), mannobiose (homem 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (homem 4), mannopentaose (homem 5) e mannohexaose (homem 6), todos os β, 1-4 ligados. Alíquota e loja a-20 ° C até necessário.</li>
	<li>Preparar 3 diferentes concentrações de um homem mistura de 1-6, combinando 1 µ l (padrão S1), 2 µ l (S2) ou 5 µ l (S3) de todos os seis.</li>
	<li>Seco em uma centrífuga a vácuo (ver Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization de oligossacarídeos <ol><li>Prepare uma solução stock de formigas de 0,2 M (ácido 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonic) em H 2 O: ácido acético 17:3. Estoque quente a 60 ° C para dissolver completamente o sólido. Loja a-20 ° C, protegido da luz, por 2-3 meses.</li>
	<li>Prepare uma solução stock de 0,2 M de 2-picolina borano (2-PB) em DMSO. Isto é extremamente higroscópico, resuspenda então imediatamente todo o pó em cima do recibo em DMSO. Alíquota e loja a-20 ° C durante 1-2 anos. Descongelar as alíquotas como necessária (loja a 4 ° C, durante 2 semanas e em seguida descarte).</li>
	<li>Preparar o buffer de derivatização de H 2 O: ácido acético: DMSO às 17:03:20.</li>
	<li>Para cada amostra, adicionar 5 µ l de formigas, 5 µ l de 2-PB e 10 µ l de tampão de derivatização. Spin brevemente para coletar no fundo do tubo, vórtice completamente e em seguida girar rapidamente novamente. Veja a Figura 1 para descrição de reação.</li>
	<li>Amostras de incubar durante a noite a 37 ° C, protegido da luz.</li>
	<li>Seco em uma centrífuga a vácuo (ver Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 2 h).</li>
	<li>Ressuspender amostras e padrão em ureia de 3M 100 µ l. Loja a-20 ° C, protegida da luz até necessária.</li>
</ol> 7. Gel de preparação do ritmo Nota: montagem do equipamento de fundição de gel vai depender da marca. Aqui, nós use um sistema de eletroforese vertical (ver Tabela de materiais), equipado com placas de vidro de 18 x 24 cm e 1,5 mm espaçadores.
<ol><li>Montar equipamento de fundição de gel pelo fabricante &#39; instruções de s.</li>
	Buffer de ritmo <li>make x 10 (1 M Tris-borato pH 8,2) como segue: Adicionar 121,14 g de Tris-Base a ~ 400 mL de H 2 O e misture para dissolver. Ajustar o pH a 8.2 por adição de ácido bórico sólido (cerca de 60 g) e em seguida fazem o volume até 1 L.</li>
	<li>Fazer um 10% (p/v) de amônio persulfato (APS) estoque em H 2 O. alíquota e armazenar em alíquotas de degelo-20 ° C. uma vez, armazenar a 4 ° C e descartar depois de 2 semanas.</li>
	<li>Fazer e despeje o gel de resolução. Para os equipamentos acima, 1 gel equivale a 50 mL. Em um tubo de centrífuga de 50 mL, misture H 2 O (20,2 mL), 5 mL x 10 ritmo de tampão, 24,6 mL 40% acrilamida/Bis-acrilamida (29:1 acrylamide:Bis). (Atenção: tóxico).
	<ol><li>Adicionar 200 µ l de APS e 20 µ l de N, N, N, N´-tetrametil-etilenodiamina (TEMED). Inverta suavemente para misturar (para evitar a introdução de bolhas de ar). Despeje o gel usando um serológicos ou outra pipeta de grande volume, a ~ 4 cm abaixo do topo das placas de vidro. Preste atenção para a possibilidade de ficar preso no gel de bolhas de ar. Se eles fazer, parar de derramar e inclinação/torneira o gel para soltá-los.</li>
	</ol></li> <li>Sobrepor o gel com isopropanol (inflamável de precaução :) ou, cuidadosamente, com H 2 Allow O. gel para polimerizar (20-30 minutos) e, em seguida, despeje a camada superior. Se isopropanol foi usado, em seguida, lave 2 x com H 2 O. Dry qualquer excesso de líquido usando papel mata-borrão.</li>
	<li>Fazer e despeje o gel de empilhamento. Misture 6,8 mL H 2 O, 1 mL de tampão de ritmo x 10, 2,8 mL acrilamida/Bis-acrilamida (PRECAUÇÃO: tóxico), 80 µ l APS e 8 µ l de TEMED em um tubo de centrífuga de 15 mL. Inverter para misturar e sobrepor em cima do gel de resolução polimerizado. Introduza cuidadosamente os pentes, evitando armadilhas bolhas de ar sob os dentes do pente.</li>
	Gel de <li>permitir a polimerizar (20-30 min), embrulhe em tecido úmido e em seguida em filme plástico e armazenar a 4 ° C até necessária. Loja com os pentes no lugar. 
	Nota: Ritmo géis podem ser armazenados por um período máximo de 2 semanas (embora menos de 1 semana é o ideal), se eles são mantidos húmidos.</li>
</ol> 8. Executando um ritmo Gel <ol><li>usar um marcador permanente para rotular as posições bem no vidro, que ajudarão a manter o controle de ordem de carregamento, e na identificação de onde os poços são uma vez que o pente é removido.</li>
	<li>Remover o pente. Encher os poços com buffer de ritmo 1 x.</li>
	<li>Usar um 10 µ l micro-seringa carregar 2 µ l de padrões e amostras em poços. Evite usar as pistas mais externa, que tendem a executar amostras mal.</li>
	<li>Montar a câmara superior do aparato gel de execução e colocar o gel em um tanque de refrigeração (~ 10 ° C) execução (10 ° C), contendo 1 x ritmo buffer. Encha a câmara superior com buffer de ritmo 1 x.</li>
	<li>Ligue o poder e executar o gel a 200 V (constante V) por 30 minutos e depois aumento da tensão de 1000 V para 1 h 40 min. Proteger os geles de luz (por exemplo, envolvendo tanques em sacos de lixo preto). 
	Nota: Verificar os géis ~ 5 min depois de ligar a tensão e depois mais 5 min. depois de um aumento da tensão de 1.000 V. Se a bateria é incapaz de manter a tensão, então provavelmente existe um vazamento de reserva. Remova o gel do tanque. Volte a montar a câmara superior, cuidadosamente verificando o posicionamento de todas juntas. Um chip grande na borda superior da placa de vidro pode impedir a placa formando uma boa vedação com a junta. Isso geralmente pode ser temporariamente resolvido adicionando uma gota de agarose fundido de 5% (p/v) para a parte lascada do vidro, antes de adicionar a câmara superior.</li>
</ol> 9. Visualizando um gel de ritmo Nota: Use um gel sistema equipado com lâmpadas de UV de ondas longas no transiluminador e um filtro de emissão para a câmera que é apropriado para o fluoróforo, aqui 530 nm de imagem. Alternativamente, um scanner a laser também pode ser utilizado, conforme descrito em Goubet 2.
<ol><li>Certifique-se de gel sistema de imagem é livre de poeira, limpando-a com tecido úmido fiapos.</li>
	<li>Remover o gel do tanque de ritmo e ver os brevemente, enquanto que o gel é ainda nas placas de vidro (&#60; 80 ms) para determinar se a frente de tintura é ainda no gel.</li>
	<li>Abrir o gel usando uma ferramenta de cunha e enquanto o gel é ainda na placa de um vidro, use um cortador de pizza para remover tanto o gel de empilhamento e, se a frente de tintura é ainda no gel, parte inferior do gel.</li>
	<li>Coloque a superfície do transiluminador ~ 5 mL H 2 O e depois transferir o gel diretamente sobre o transiluminador. Definir o filtro de UV 605 e ative o transiluminador UV de ondas compridas (ver Tabela de materiais) usando o software. 
	Nota: O formigas fluoróforo usado aqui tem uma excitação/emissão de 353/520 nm.</li>
	<li>Tirar várias fotos em vários tempos de exposição (por exemplo, 100 ms a 10 s). Certifique-se de que a luz UV é desligada entre imagens clicando no botão de luz de UV (para desligá-lo) para evitar a degradação da fluorescência. Garantir que pelo menos 2 das imagens não saturadas bandas (o gel software de imagem irá indicar isto).</li>
	<li>Salve arquivos como imagens de alta-resolution.tif. 
	Nota: Imagens podem ser analisadas usando o software fornecido com o sistema de imagem de gel, ou usando o software de análise de imagem livremente disponíveis, tais como ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Consulte a seção de resultados para uma discussão de quantificação.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+fingerprinting+of+Arabidopsis+pectic+polysaccharides+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+(PACE).">Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Planta. 224 (1), 163-174 (2006).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. 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Os autores não têm nada para divulgar.

RITMO é um método simples para caracterizar a estrutura de polissacarídeos. Pode ser aplicado a qualquer polissacarídeo para os quais existem conhecidas GHs com atividade caracterizada, ver inúmeros exemplos na literatura1,6,9,11. TT também foi aplicado para a caracterização do romance GHs12,13,18 e glycosyltransferases9, fazendo uso de substratos de polissacarídeo definidos e aceitadores.
Resultados reprodutíveis, interpretáveis são dependentes em três etapas-chave. Primeiro, o GHs usado deve ser livre de contaminar as atividades. Isto é melhor alcançado usando apenas heterologously expressa, afinidade purified enzimas. Em segundo lugar, para a maioria dos experimentos, é importante que a hidrólise enzimática de substratos é na conclusão. Isso garantirá que a mesma biomassa hidrolisada com o GH mesmo dá a mesma impressão em cada experimento. Finalmente, deve haver um excesso de fluoróforo na reação de derivatização. Isso garante que as extremidades reduzindo disponíveis são rotuladas em perto de 100%. Isso resultará em alta reprodutibilidade dos resultados, bem como os dados quantitativos.
Gel e reagente de qualidade são essenciais para garantir os dados podem ser reproduzidos. Buffers de má qualidade, especialmente de pH incorreto, bolhas no gel de ar, e amostras com excesso de sal podem todos afetam fator resolução e retenção dos oligossacarídeos. No entanto, inclusão dos controles recomendados descritos na seção de protocolo e resultados permitirá solução de problemas.
RITMO é limitado pela sua capacidade de identificar oligossacarídeos. Para algumas experiências, uma impressão digital simples é tudo que é necessário. Contudo, para verdadeiramente dosar a quantidade de glucomannan em uma amostra de ar, por exemplo, a identidade de todos os oligossacarídeos lançados seja necessária, que é um processo demorado. Isto é mais simples para menos polissacarídeos complexos como xilana3. Uma vez que existem alguns padrões de oligossacarídeo comercialmente disponível, pode não ser sempre possível ou desejável para identificar todas as bandas. Neste caso, o ritmo pode fornecer dados muito elogioso para espectrometria de massa (ou seja, MALDI-CID9 ou ESI-MS7e NMR6). Para esses métodos, muitas vezes é útil fazer uma preparação em grande escala, separados por cromatografia de exclusão de tamanho e em seguida analisar cada fração por ambos ritmo antes da MS ou NMR. Enquanto tem sido relatado que bandas podem ser extirpadas e identificadas por MALDI-CID, na prática, constatámos que isso tem uma baixa taxa de sucesso (possivelmente devido a interações dos oligossacarídeos, etiquetados com o gel do acrilamido quando exposto à luz UV).
A outra limitação importante do ritmo é a taxa de transferência. Para ter boa qualidade, géis interpretáveis com os controles apropriados, cada gel terá somente ~ 10 amostras experimentais, e um pesquisador pode esperar para executar géis de ritmo ~ 4 por dia. Recentemente, uma versão do ritmo utilizando eletroforese capilar (CE) tem sido desenvolvido,19, que permite a preparação de amostras em placas de 96 poços. Ele tem sido usado com sucesso para caracterizar as atividades de enzima glycosyltransferase e polissacarídeo estruturas6,19, ainda requer acesso a uma máquina de CE, o que pode ser caro para comprar e manter.

Polissacarídeo análise por eletroforese em gel (PACE) é um método para a caracterização detalhada dos polissacarídeos1,2,3. Polissacarídeos de parede celular de plantas são notoriamente difíceis de analisar, e a maioria dos métodos requerem equipamento caro, operadores qualificados e grandes quantidades de material purificado. Aqui, descrevemos um simples método para obter um polissacarídeo estrutural informações detalhadas, incluindo resolução de isômeros.
Estrutura de polissacarídeos da parede celular de plantas compreensão é necessária que os pesquisadores explorando a biossíntese da parede celular de planta ou o papel de parede da célula vegetal no desenvolvimento da planta. Recentemente, no entanto, composição de parede celular planta tornou-se interessante para um grupo maior de pesquisadores devido o foco sobre o uso de biomassa vegetal (essencialmente a parede celular) como uma matéria-prima para produzir biocombustíveis e bioquímicos4. Como exemplo, sacarificação enzimática eficiente deste material requer um entendimento detalhado das estruturas polissacarídeo, para que otimizado coquetéis enzimáticos podem ser selecionados5.
RITMO tem várias vantagens sobre métodos alternativos que o tornam ideal para a análise rápida de estruturas complexas glicano. Em primeiro lugar, não requer purificação do polissacarídeo em questão, como é necessário para a solução de ressonância magnética nuclear (NMR) estado6. Em segundo lugar, o ritmo pode resolver isómeros estruturais, ao contrário de espectrometria de massa (MS, por exemplo, assistida por matriz laser dessorção/ionização (MALDI) e ionização electrospray (ESI)), que também pode ser um desafio para executar por cromatografia líquida (LC) 7. em terceiro lugar, o ritmo é muito sensível, com resolução baixa-picomole, ao contrário da cromatografia de camada fina (TLC) ou a cromatografia em papel. Finalmente, não exige conhecimento caro de equipamento ou especialista, como é o caso de MS, NMR e LC.
O método de ritmo depende da especificidade da glycosyl hydrolase (GH) enzimas, que têm como alvo certas ligações glicosídicas em uma mistura de polissacarídeos. Quando a enzima GH atua na cadeia de polissacarídeo, revela um redução final que pode então ser quimicamente derivatizado, neste caso com uma etiqueta fluorescente. A mesmo porção da amostra é processada portanto indetectável por esse método. Oligossacarídeos etiquetados são então separados em um gel do acrilamido do grande-formato por eletroforese. Isso dá excelente resolução de moléculas muito semelhantes, por exemplo, os trissacarídeos Glc-homem-homem e homem-Glc-Glc terá um diferente Rf.
RITMO tem sido amplamente utilizado para caracterizar estruturas de xilana diferentes em toda a espécie de planta8, para identificar os mutantes glycosyltransferase em Arabidopsis6,9,10,11 , para realizar ensaios de glycosyltransferase9e para caracterizar o romance GH atividades12,13. Recentemente, também usamos isso para caracterizar Medeiros de parede celular de levedura (Mahboubi e Mortimer, em preparação). Aqui nós descrevemos um método para caracterizar a estrutura de glucomannan da parede celular vegetal, com base em anteriores relatórios11,14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oligosaccaharide Standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 3458-28-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannobiose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 14417-51-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannotriose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 28173-52-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannotetraose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 51327-76-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannopentaose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 70281-35-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannhexaose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 70281-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-GLCML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other specialty chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td>
			<td>(Molecular probes) Thermo</td>
			<td>A350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-picoline borane</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel casting kit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE660 kit</td>
			<td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling recirculating water bath&#160;</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>RCB20-plus 115v</td>
			<td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td>
			<td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage Power Pack</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EC1000XL</td>
			<td>1000V&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SPD131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycosyl hydrolases</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging software ( Genesys)</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

Polissacarídeos de parede celular de plantas são notoriamente difíceis de analisar, e a maioria dos métodos requerem equipamento caro, operadores qualificados e grandes quantidades de material purificado. Aqui, descrevemos um simples método para obter um polissacarídeo estrutural informações detalhadas, incluindo resolução de isômeros. Para análise de polissacarídeo por eletroforese em gel (PACE), material de parede celular vegetal é hidrolisado com glycosyl hidrolases específicas para o polissacarídeo de interesse (por exemplo, mannanases de Medeiros). Géis de poliacrilamida de grande formato são usados para separar lançados oligossacarídeos, que tem sido rotulados fluorescente. Géis podem ser visualizados com um gel modificado sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais). Digitais de oligossacarídeo resultante também podem ser comparadas qualitativamente ou, com replicação, quantitativamente. Enlace e ramificação de informações podem ser estabelecidas usando hidrolases glycosyl adicionais (por exemplo, mannosidases e galactosidases). Enquanto este protocolo descreve um método para analisar a estrutura de glucomannan, pode ser aplicado a qualquer polissacarídeo para os quais existem glycosyl caracterizadas hidrolases. Alternativamente, pode ser usada para caracterizar o romance glycosyl hidrolases utilizando substratos de polissacarídeo definidos.

Aqui, nós mostramos um gel de ritmo de exemplo executado por protocolo, juntamente com descrições para ajudar com a interpretação de dados e solução de problemas, e este é seguido por um guia geral para sucesso ritmo gel de interpretação13,16. Um gel representativo de um ritmo padrão ensaio do conteúdo de parede celular Medeiros é mostrado na Figura 2e é descrito a faixa por faixa.
Normas Faixas 1, 2 e 3 mostram uma escada de oligossacarídeos adquiridos comercialmente (homem1- homem6) em 5 (S1), 10 (S2) e 50 (S3) pmol concentração. Ao receber um lote novo de um oligossacarídeo comercial, é importante verificar a pureza em um gel. Muitos oligossacarídeos, particularmente tetrasacccharides e mais, pode ter uma contaminação significativa com oligossacarídeos de outros graus de polimerização (DPs), como mostrado aqui para homem6 (marcados com *). Enquanto dosar um gel, é importante ter pelo menos 3 concentrações dos padrões, uma vez que é necessário para calcular a curva padrão. Cálculo da curva padrão também pode ser útil para garantir que a reação de derivatização é essencialmente na conclusão. Padrões de concentrações conhecidas permitem comparações entre géis e são um controle útil para separação de qualidade e qualidade de derivatização.
Controlo positivo Lane 4 mostra uma digestão mananase de glucomannan konjac. Glucomannan konjac é disponível comercialmente, e enquanto não tem a mesma estrutura que, por exemplo, encontrados em Arabidopsis, serve dois propósitos. Em primeiro lugar, é um controle importante para a digestão enzimática. O pesquisador deve estabelecer como um substrato comercial digerido com seus GHs de escolha parece quando digerido a conclusão (ou seja, um grande excesso de GH é adicionado para a reação). Se no futuro as experiências altera o padrão, isso pode indicar uma perda de atividade ou contaminação da unidade populacional de GH. Em segundo lugar, ele serve como um controle para a reação de derivatização na presença de sais de enzima e o tampão. Se as normas de boas aspecto, mas o controle positivo é pobre, então isso pode indicar que um componente da reação de hidrólise é inibitório para a derivatização.
Haste de Arabidopsis tipo selvagem (WT) ar + mananase cocktail (GH5 + GH26) 5 Lane mostra a impressão digital de ritmo de um tronco de Arabidopsis WT (compare com referências11,14).
csla9 Haste de Arabidopsis ar + mananase cocktail (GH5 + GH26) 6 Lane mostra mostra a impressão digital de ritmo da haste de um Arabidopsis plantar falta o major Medeiros sintase11-tronco. Compare o WT e controlo negativo impressões digitais. Enquanto a maioria do Medici está ausente nesta fábrica, permanece uma quantidade pequena, como evidenciado pelas intensidades de banda reduzida para todos os derivados de mananase oligossacarídeos isto é sintetizado pelas sintases Medeiros adicionais (CSLA2, 3)11.
Controle negativo - enzima apenas 8 Lane mostra bandas no gel que não são específicas de que derivam dos contaminantes o mananase cocktail e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Controle negativo - WT somente AIR 9 Lane mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Controle negativo- csla9 Somente AIR 10 Lane mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Pinho de madeira ar + mananase cocktail (GH5 + GH26) Lane 7 mostra a impressão digital de ritmo de madeira de pinho, que contém galactoglucomannan. Isto claramente tem um padrão diferente de oligossacarídeos liberados de Arabidopsis, devido à sua estrutura diferente.
Controle negativo - pinho somente AIR Lane 11 mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Interpretar um gel de ritmo é relativamente simples, mas requer a conscientização dos pontos seguintes. De dados robusto, é recomendável efectuar ritmo pelo menos 3 independentemente crescido biológica Replica, e recomenda-se realizar pelo menos 2 repetições de técnicas em cada replicar biológica. Os controles descritos são essenciais para a interpretação, como faixas não específicas devam ser excluídos. Também recomendamos carregar amostras em uma ordem diferente em replicar geles, para excluir os efeitos que resultam de iluminação desigual pelo transiluminador. Exata interpretação requer análise das bandas que não estão saturados. Como algumas impressões de oligossacarídeo podem conter ambos os polissacarídeos abundância muito alta e baixa, recomendamos analisar várias exposições do gel mesmo. Os padrões podem ser usados para normalizar entre diferentes imagens.
Para alguns tipos de experimentos, pode ser desejável para quantificar a quantidade de polissacarídeo em preparação o ar. Enquanto é possível quantificar de um gel de ritmo, exige o conhecimento da identidade molecular exata de cada oligossacarídeo lançado pelo GHs e onde ele está localizado no gel o ritmo. Isso atualmente não é totalmente conhecido por Medeiros, mas foi determinado para outros polissacarídeos , por exemplo, xilana3. Os padrões fornecem uma maneira de normalizar entre géis, mesmo quando a quantificação não está sendo executada e assim ajudará em qualquer análise qualitativa ou semi-quantitativa.
Identificar a estrutura de oligossacarídeos individuais pode ser conseguido usando coquetéis de GHs. Sequential adição de mais GHs pode revelar detalhes sobre o estabelecimento de vínculos e substituições dos oligossacarídeos liberados (por exemplo, adição de β - 1,4 - glicosidase que age na extremidade não redutora irá revelar quais oligossacarídeos na mistura contenham esse recurso). As enzimas disponíveis incluem galactosidases, glucuronidases e glucosidases (consulte o banco de dados CAZy16 para obter informações adicionais); Ver Hogg, d. et al . 17 como exemplo.
O protocolo acima pode ser usado para caracterizar a atividade do GHs desconhecidos. Neste caso, uma biomassa definida, tais como Arabidopsis haste ou konjac glucomanano, deve ser usada para a tela o GHs desconhecido13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
Figura 1 : Isto mostra o esquema para o fluorescente derivatização de oligossacarídeos com formigas. Modificado da Goubet2.<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"target = blank" &gt; clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
Figura 2 : Gel de ritmo representativo mostrando a impressão digital Medeiros de Arabidopsis, pinheiros e um mutante de Arabidopsis (csla9) que tem comprometido a biossíntese de Medeiros. AlR foi hidrolisada com um cocktail de mananase e oligossacarídeos liberados foram derivatizados com um fluoróforo. Os oligossacarídeos foram separados por eletroforese em gel com base no tamanho, forma e carga. Uma escada de manno-oligossacarídeos (Man1-6) é mostrada para ajudar a identificar mobilidades relativas dos oligossacarídeos, lançados, e uma hidrólise de Medeiros purificado (derivado de konjac) é mostrada como um controle positivo. * = faixas não específicas. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Um protocolo para a análise estrutural de polissacarídeos por eletroforese em gel (PACE), usando Medeiros como um exemplo, é descrito.

Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K visualizações.  Joint BioEnergy Institute. Um protocolo para a análise estrutural de polissacarídeos por eletroforese em gel (PACE), usando Medeiros como um exemplo, é descrito.

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LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in human pathology and other biochemical contexts. In order to perform characterization of protein deamidation, we have recently developed a novel long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method which can separate the glutamine (Gln) and asparagine (Asn) isoform products of deamidation from model compounds to highly complex biological samples. LERLIC-MS/MS is, therefore, the first shotgun proteomics strategy for the separation and quantification of Gln deamidation isoforms. We also demonstrate, as a novelty, that the sample processing protocol outlined here stabilizes the succinimide intermediate allowing its characterization by LERLIC-MS/MS. Application of LERLIC-MS/MS as shown in this video article can help to elucidate the currently unknown molecular arrays of protein deamidation. Additionally, LERLIC-MS/MS provides further understanding of the enzymatic reactions that encompass deamidation in distinct biological backgrounds.

Here we present a step-by-step protocol of the long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method. This is a novel methodology that enables for the first time quantification and characterization of the glutamine and asparagine deamidation isoforms by shotgun proteomics.

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Bioquímica

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content is rather low in all organisms, amounting in plants to about 0.009% of dry weight. To date, one of the most accurate methods for measuring iron concentration in plant tissues is flame absorption atomic spectroscopy. However, this approach is time-consuming and expensive and requires specific equipment not commonly found in plant laboratories. Therefore, a simpler, yet accurate method that can be routinely used is needed. The colorimetric Prussian Blue method is regularly used for qualitative iron staining in animal and plant histological sections. In this study, we adapted the Prussian Blue method for quantitative measurements of iron in tobacco leaves. We validated the accuracy of this method using both atomic spectroscopy and Prussian Blue staining to measure iron content in the same samples and found a linear regression (R2 = 0.988) between the two procedures. We conclude that the Prussian Blue method for quantitative iron measurement in plant tissues is precise, simple, and inexpensive. However, the linear regression presented here may not be appropriate for other plant species, due to potential interactions between the sample and the reagent. Establishment of a regression curve is thus needed for different plant species.

We present a simple and reliable protocol for measuring iron content in plant tissues using the colorimetric Prussian Blue method.

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and how the domains are oriented/positioned. Here, a protocol with the potential for elucidating which specific domains mediate interactions in multicomponent system through ab initio modeling is described. A method for calculating solution structures of macromolecules and their assemblies is provided that involves integrating data from small angle X-ray scattering (SAXS), chromatography, and atomic resolution structures together in a hybrid approach. A specific example is that of the complex of full-length nidogen-1, which assembles extracellular matrix proteins and forms an extended, curved nanostructure. One of its globular domains attaches to laminin &#947;-1, which structures the basement membrane. This provides a basis for determining accurate structures of flexible multidomain protein complexes and is enabled by synchrotron sources coupled with automation robotics and size exclusion chromatography systems. This combination allows rapid analysis in which multiple oligomeric states are separated just prior to SAXS data collection. The analysis yields information on the radius of gyration, particle dimension, molecular shape and interdomain pairing. The protocol for generating 3D models of complexes by fitting high-resolution structures of the component proteins is also given.

Here, we present how Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) can be utilized to obtain information on low-resolution envelopes representing the macromolecular structures. When used in conjunction with high-resolution structural techniques such as X-Ray Crystallography and Nuclear Magnetic Resonance, SAXS can provide detailed insights into multidomain proteins and macromolecular complexes in-solution.

Estudos estruturais de macromoléculas em solução usando o pequeno ângulo de espalhamento de raios-x

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for even the most challenging projects in structural biology. However, most facilities still require the presence of a scientist on site to perform the experiments. A new generation of automated beamlines dedicated to the fully automatic characterization of, and data collection from, crystals of biological macromolecules has recently been developed. These beamlines represent a new tool for structural biologists to screen the results of initial crystallization trials and/or the collection of large numbers of diffraction data sets, without users having to control the beamline themselves. Here we show how to set up an experiment for automatic screening and data collection, how an experiment is performed at the beamline, how the resulting data sets are processed, and how, when possible, the crystal structure of the biological macromolecule is solved.

Here, we describe how to use the automated screening and data collection options available at some synchrotron beamlines. Scientists send cryocooled samples to the synchrotron, and the diffraction properties are screened, the data sets are collected and processed and, where possible, a structure solution is carried out&#8212;all without human intervention.

Caracterização totalmente autónoma e coleta de dados de cristais de macromoléculas biológicas

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination of the high-specificity separation technique IEX with the accurate molar mass analysis achieved by MALS allows the characterization of heterogeneous protein samples, including mixtures of oligomeric forms or protein populations, even with very similar molar masses. Therefore, IEX-MALS provides an additional level of protein characterization and is complementary to the standard size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) technique.
Here we describe a protocol for a basic IEX-MALS experiment and demonstrate this method on bovine serum albumin (BSA). IEX separates BSA to its oligomeric forms allowing a molar mass analysis by MALS of each individual form. Optimization of an IEX-MALS experiment is also presented and demonstrated on BSA, achieving excellent separation between BSA monomers and larger oligomers. IEX-MALS is a valuable technique for protein quality assessment since it provides both fine separation and molar mass determination of multiple protein species that exist in a sample.

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

This protocol describes the use of high-specificity ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering for an accurate molar mass determination of proteins, protein complexes, and peptides in a heterogeneous sample. This method is valuable for quality assessment, as well as for the characterization of native oligomers, charge variants, and mixed-protein samples.

Cromatografia de troca iónica (IEX) acoplada ao multi-ângulo espalhamento de luz (MALS) para caracterização e separação de proteínas

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These amyloid fibrils can sequester endogenous metastable proteins as well as components of the proteostasis network (PN) and thereby exacerbate protein misfolding in the cell. There are a limited number of tools available to assess the aggregation process of amyloid proteins within an animal. We present a protocol for fluorescence lifetime microscopy (FLIM) that allows monitoring as well as quantification of the amyloid fibrilization in specific cells, such as neurons, in a noninvasive manner and with the progression of aging and upon perturbation of the PN. FLIM is independent of the expression levels of the fluorophore and enables an analysis of the aggregation process without any further staining or bleaching. Fluorophores are quenched when they are in close vicinity of amyloid structures, which results in a decrease of the fluorescence lifetime. The quenching directly correlates with the aggregation of the amyloid protein. FLIM is a versatile technique that can be applied to compare the fibrilization process of different amyloid proteins, environmental stimuli, or genetic backgrounds in vivo in a non-invasive manner.

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescence lifetime imaging monitors, quantifies and distinguishes the aggregation tendencies of proteins in living, aging, and stressed C. elegans disease models.

Caracterização de estruturas amilóides em Envelhecimento C. Elegans usando imagem de fluorescência ao longo da vida

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...