Este trabalho foi financiado pela subvenção núcleo recebida do departamento de biotecnologia, governo da Índia para o Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. Endereço atual do Dr. Bhattacharjee é a divisão de Gastroenterologia, Hepatologia e nutrição, Hospital Los Angeles das crianças.

Os procedimentos apresentados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de ética institucional Animal do Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. O número de série de referência da aprovação é IAEC #319/13.
Nota: Existem excelentes recursos em procedimentos de cirurgia geral20 e protocolos específicos para a cirurgia do roedor21. Para aqueles que fazem a cirurgia animal pela primeira vez, é aconselhável extensivamente em prática procedimentos cirúrgicos em bonecos antes de operar em animais.
1. preparação
<ol><li>Antes do experimento, manter estéril tampão fosfato salino (PBS) ou salino pronto.</li>
	<li>Monte um kit de cirurgia contendo tesouras, pinças serrilhadas, fórceps do tecido, algodão, cotonetes, fios de nylon e porta agulhas micro diferentes. O kit de cirurgia de autoclave. Cuidado especial deve ser tomado se um aceno imunológico comprometido. Rato SCID é incluído no protocolo.</li>
	<li>Executar todo o procedimento experimental, desde a preparação para o fim da cirurgia, da bio-segurança classe I do armário.</li>
	<li>Pese um aceno. Rato SCID de 6-8 semanas antes da cirurgia. Ratos com peso entre 14-18 g são utilizados neste estudo.</li>
	<li>Barba superior central e hipocondríaco região abdominal do mouse com o aparador de cabelo. Aplica o cabelo removendo o creme uniformemente em toda a região com uma espátula para remover completamente os pelos aparados. Remova os pelos suavemente com a ajuda de um pedaço de algodão estéril após 2-5 min.</li>
	<li>Posicione o mouse na câmara de isoflurano e desbloquear a válvula do cilindro de oxigênio. Manter o fluxo de oxigênio à taxa de 4 L/min e a vaporização de isoflurano em 4% para induzir anestesia.<ol>
<li>Certifique-se de que o mouse tem sido anestesiado corretamente beliscando suave do dedo do pé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque uma placa de cirurgia dentro uma biossegurança do armário. Coloque o animal no quadro de cirurgia, tal que a porção ventral do mouse é voltada para cima e a porção anterior do rato é colocada dentro do cone de nariz ligado à alimentação de isoflurano e oxigênio.</li>
	<li>Reduzir a vaporização de isoflurano para 2% e mantê-lo durante todo o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Desinfectar a pele do rato e esterilize-limpando com algodão estéril embebida de etanol a 70%.</li>
</ol>2. ato cirúrgico
<ol><li>
Hepatectomy parcial
	<ol>
<li>Fazer uma incisão transversa de cerca de 1 cm na pele logo abaixo do esterno, perpendicular ao processo xifoide e paralelo da caixa torácica, com a ajuda de uma tesoura reta de funcionamento.</li>
		<li>Separe suavemente a pele anexada com a camada muscular abdominal nas imediações da zona da incisão com pinça ou dicas de algodão umedecido estéril para distinguir entre a pele e a camada muscular abdominal. Molhe a região intradérmica com PBS usando dicas de algodão estéril para evitar a dessecação.</li>
		<li>Expor a área do lobo esquerdo suavemente, fazendo uma incisão transversal através da camada peritoneal logo abaixo do xifoide. Use duas dicas de algodão umedecido para expor e levantar o lobo esquerdo do fígado.</li>
		<li>Coloque uma das pontas do algodão do lado abdominal do corte e coloque a outra ponta de algodão do lado do diafragma. Delicadamente pressione a ponta colocada para o diafragma e dar um empurrão deslizando pela outra ponta para levantar o lobo esquerdo do fígado.</li>
		<li>Passar um fio de nylon com um loop através do lóbulo esquerdo levantado e deslize o loop em direção à base do lobo esquerdo perto do hilo, com a ajuda das dicas de microfórceps ou algodão. Empurre para baixo o loop de fio de nylon na base do lobo esquerdo.</li>
		<li>Amarre duas extremidades do fio de nylon por cima do lobo esquerdo usando um porta-agulha microcirurgia e o micro fórceps. Faça dois nós adicionais do outro lado.</li>
		<li>Disse para fora o lóbulo amarrado com a ajuda de uma tesoura. Não tente cortar muito perto o thread. No caso do procedimento dura mais de 5 min, mantenha a cavidade peritoneal e órgãos úmido com PBS estéril para evitar a desidratação devido à perda de líquidos.</li>
		<li>Costure o peritônio por sutura contínua usando uma sutura de Catgut 4-0. Subsequentemente, feche a pele por sutura descontínuos tão rapidamente quanto possível.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transplante de células Nota: Os hepatócitos expressando GFP foram isolados de ratos transgénicos GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), de acordo com o procedimento descrito por Lee et al. 22 e Shen et al. 23 hepatócitos células (NeoHep) de origem humana diferenciada de monócitos24 também foram utilizadas para transplante. No entanto, as células derivadas de outras fontes podem também ser utilizadas no protocolo.<ol>
<li>Suspenda a 0,2 milhões de células viáveis em cerca de 50 µ l de modificado Dulbecco do Iscove médio (IMDM) e Aspire-lo em uma seringa de insulina 1 mL com agulha 30 G. Não deixar a seringa, colocando-o no gelo.</li>
		<li>Coloque o mouse em uma forma que a parte lateral esquerda enfrenta até em direção a pessoa que realizar a cirurgia. Identificar a área esplênica e transversalmente dissecar a pele perto da região hipocondríaca, seguida por uma incisão pequena através da camada peritoneal apenas para expor o baço.</li>
		<li>Delicadamente Levante o baço e mantenha que fora da cavidade com a ajuda de dois PBS umedecido com pontas de algodão.</li>
		<li>Segure o baço cuidadosamente com duas pontas de algodão com uma mão e coloque a agulha da seringa exatamente vertical para o baço. Delicadamente, perfuram o baço e empurra a agulha muito lentamente por dentro; a agulha não deve ter mais que 2 mm.</li>
		<li>Empurre o êmbolo da seringa lentamente para injetar as células no baço. Após transplante, manter a agulha da seringa estável e retire lentamente o baço para evitar sangramento ou perda de células.</li>
		<li>Depois de colocar o baço volta para a cavidade peritoneal com as pontas de algodão, feche a camada peritoneal por sutura contínua com uma sutura de Catgut 4-0. Costure a pele descontinuamente com a sutura do mesma. Evite usar clipes de ferida para o fechamento da pele; em vez disso, feche-a uma sutura de 4-0. Os clipes de ferida restringem o movimento natural do mouse, e muitas vezes clipes afrouxar-se e sair rapidamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. no pós-operatório cuidados
<ol><li>Depois de fechar a pele, limpe os arredores de ambos os sites de sutura com solução de iodo (betadine) usando uma ponta de algodão estéril.</li>
	<li>Injetar uma dose de antibiótica cefotaxima como 600 mg/kg de peso (tipicamente 12 mg cefotaxima em 100 µ l de solução salina/rato) de corpo intraperitonealmente com uma seringa de 1 mL.</li>
	<li>Dar doses diárias de analgésico Meloxicam como 1 mg/kg peso corporal (tipicamente 12 µ g Meloxicam em 100 µ l de solução salina/rato) ao animal intraperitonealmente, por até três dias após a cirurgia.</li>
	<li>Após a conclusão da cirurgia, interromper o fluxo de gás de isoflurano e posicione o mouse de volta na gaiola ventilada individualmente.</li>
</ol>4. eutanásia e caracterizações
<ol><li>Após os pontos experimentais (1 dia e 10 dias pós cirurgia), eutanásia os ratos de acordo com as orientações institucionais de ética animal.</li>
	<li>Colete sangue por terminal sangria dos animais, puncionando o plexo terminal ocular.</li>
	<li>Isole o soro do sangue.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nussler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+status+and+perspectives+of+cell-based+therapies+for+liver+diseases.">Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases.</a> J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).</li><li>Ponder, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hepatocytes+migrate+to+liver+parenchyma+and+function+indefinitely+after+intrasplenic+transplantation.">Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fulminant+hepatic+failure+in+rats+induces+oxidative+stress+differentially+in+cerebral+cortex,+cerebellum+and+pons+medulla.">Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla.</a> Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laennec+protects+murine+from+concanavalin+A-induced+liver+injury+through+inhibition+of+inflammatory+reactions+and+hepatocyte+apoptosis.">Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis.</a> Biol. Pharm. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+long-term+survival+of+syngeneic+hepatocytes+in+rat+peritoneum.">Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum.</a> Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).</li><li>Tang, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+donor+hepatocytes+and/or+splenocytes+pre-injection+in+reducing+islet+xenotransplantation+rejection.">The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection.</a> Hepatobiliary. Pancreat. Dis. 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(64), (2012).</li><li>Bhattacharjee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+NeoHep+Derived+from+Chronic+Hepatitis+B+Virus+Patients'+Blood+Monocytes+by+Upregulation+of+c-MET+Signaling.">Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling.</a> Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).</li><li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+sure+methodology+for+massive+hepatectomy+in+the+mouse.">Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse.</a> Ann. 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Hepatol. , 1400147 (2012).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li><li>Ahmed, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subcutaneous+and+intrahepatic+human+hepatocellular+carcinoma+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice.</a> J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).</li><li>Krikri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laparoscopic+vs.+open+abdominal+surgery+in+male+pigs:+marked+differences+in+cortisol+and+catecholamine+response+depending+on+the+size+of+surgical+incision.">Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision.</a> Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Hepatectomy parcial é uma técnica estabelecida para investigar regeneração hepática e hepatectomy excessiva é relatado para imitar o modelo de AHF. Entre modelos animais de AHF, roedores, sobretudo ratos, são o modelo mais pesquisado. Para obter um modelo de lesão hepática em ratos, até um 70% hepatectomy tem sido relatado com uma taxa de sobrevivência bom25,26. No entanto em nude e outro rato imunodeficientes, um hepatectomy 70% foi relatado como fatal e animais morreram dentro de 24 horas27.
Mitchell e Willenbring28 demonstraram um método reprodutível e bem tolerado para 2/3 hepatectomy parcial em camundongos. Para NOD. Os ratos SCID, obtivemos uma taxa de sobrevivência de 100% quando a hepatectomy era restrito até a ressecção do lobo hepático esquerdo, que é perto de 30% da massa total do fígado. Em consonância com as observações em camundongos27, observamos que qualquer aumentar ainda mais no percentual de hepatectomy na NOD. Rato SCID leva a uma redução dramática da taxa de sobrevivência. Além disso, post de lóbulos de proliferação dos hepatócitos nos restantes fígado 1 dia de hepatectomy parcial 30% confirmou a utilidade deste procedimento no transplante e enxertia estudos.
Em um estudo mais recente, Universidade Ahmed et al 29 demonstraram um procedimento para xenografts de carcinoma hepatocelular colestase em camundongos imunodeficientes. Eles têm mostrado um procedimento para o transplante de células tumorais em vários órgãos, incluindo o baço e executada hepatectomy para facilitar a enxertia de colestase.
Nos procedimentos relatados por Mitchell28 e Ahmed29, há uma oportunidade para refinamentos fazendo incisões muito menores, como pequenas incisões são geralmente preferidas em cirurgia. Não há evidência de30 que um menor incisão cirúrgica de comprimento leva à menor secreção de hormônios do estresse, como cortisol e catecolaminas. Além disso, achamos que os procedimentos que envolve uma incisão maior exigem um maior nível de habilidades e são mais difíceis de reproduzir, em comparação com procedimentos tendo duas incisões menores.
Neste trabalho, descrevemos um procedimento em que a incisão mínima é necessária para expor o lobo esquerdo do fígado e, depois de realizar uma hepatectomy de 30%, outra pequena incisão foi feita para expor o baço, onde as células foram implantadas. Este procedimento não requer nenhuma habilidade cirúrgica especializada e pode ser concluído em 5-7 min. Além disso, não encontramos nenhuma evidência de qualquer anormalidade morfológica ou anatômica na restante massa hepática, como evidenciado por estudos histológicos. Além disso, havia uma ausência de isquemia ou necrose durante o procedimento cirúrgico da semana 6-8-velho imunológico comprometido de ratos. A indução da lesão hepática após hepatectomy parcial é confirmada pelos níveis elevados de enzimas hepáticas AST, ALT e ALK-PHOSin ratos soro. Uma rota de intrasplenic foi escolhida para o transplante de células sobre outras vias venosas, porque o sistema venoso portal tem maior acessibilidade para o fígado córtex do que outros sistemas venosos. Demonstrámos que o transplante de hepatócitos isolados de um rato transgênico de GFP e NeoHep que são diferenciadas de hepatócitos células de origem humana, em parcialmente hepatectomized NOD. Animais do SCID. O procedimento não restringe o tipo de células usado para transplante.
No entanto, este procedimento não cria a condição de AHF em um rato, como é realizada apenas uma hepatectomy parcial de 30%. Esta limitada hepatectomy fornece um potencial proliferativo para hepatócitos presentes no fígado remanescente, que desse modo oferece oportunidades adicionais para hepatócitos transplantados para enxertia. Isso só demonstra a migração e a enxertia de hepatócitos e NeoHep do baço para o fígado, e nenhum dano adicional ao fígado é feito pelo procedimento de transplante.
Acima de tudo, este procedimento é simples e pode ser praticado e dominado facilmente para obter resultados reprodutíveis. O potencial regenerativo das várias fontes de celulares (células-tronco ou células hepatócito) no contexto de lesão hepática, ou o estudo de regeneração hepática, pode ser facilmente avaliado com este procedimento cirúrgico.

Atualmente, transplante de hepatócitos é proposto como uma alternativa ao transplante de órgão inteiro para tratar pacientes com distúrbios hepáticos graves. Acredita-se que ele pode ponte pacientes de transplante de órgão inteiro1. Além dos hepatócitos alogênico2, hepatócitos xenogénica3 e hepatócitos derivados de células-tronco4 também estão sendo investigados em modelos animais. Neste contexto, a orientação e enxertia potencial das células transplantadas no receptor é um critério importante para a terapia de célula com base na insuficiência hepática aguda (AHF).
Para investigar o transplante de hepatócitos ou células hepatócito5, AHF é criada em um modelo animal por cirúrgica6 ou procedimentos farmacológicos7 , seguidos de transplante de células. Tornar-se um modelo animal de AHF por reagentes farmacológicos, hepatotoxinas muitos como d-galactosamina8, paracetamol9, tetracloreto de carbono10, tioacetamida11, Concanavalina A12, lipopolissacarídeo13 , etc., têm sido utilizados. Desta lista, cada reagente gera um conjunto único de características para AHF, mas infelizmente não reagente único imita as AHF humana. Além disso, a AHF induzida por hepatotoxinas leva um longo tempo, o que coloca os animais sob estresse crônico, e obter resultados reprodutíveis são difíceis de obter.
Por outro lado, o procedimento cirúrgico de hepatectomy parcial (PHx) é dependente de habilidade, e obter resultados reprodutíveis são fáceis de obter depois de desenvolver as habilidades necessárias. Para induzir AHF por intervenção cirúrgica sozinha, ressecção de mais de 70% do fígado é necessária; no entanto, menos do que um hepatectomy 70% ainda pode ser utilizado para estudar a enxertia e proliferação de transplantadas células no fígado para analisar sua capacidade terapêutica durante dano hepático14. O transplante de hepatócitos foram realizados post hepatectomy através do peritônio15, cauda veia16, veia hepática17ou o baço18. Atualmente, infusão de veia hepática e transplante intrasplenic dos hepatócitos são os procedimentos preferenciais, porque são mais fáceis de reproduzir.
Neste trabalho, descrevemos um procedimento para uma hepatectomy parcial de 30% na NOD. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) ratos em que o lobo esquerdo do fígado é extirpado. Ele é seguido por transplante de hepatócitos de rato (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) expressando GFP 0,2 milhões, bem como origem humana NeoHep19 no baço. Este procedimento leva a enxertia das células transplantadas no fígado. Este procedimento é menos invasivo e uma técnica minimamente dolorosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1002">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:255px;">Ugo Basile; Italy</td>
			<td style="width:119px;">211000</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Weighing machine</td>
			<td style="width:255px;">Goldtech ; India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Local Procurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biological safety cabinet ( Class I)</td>
			<td style="width:255px;">Kartos international;&#160; India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Local Procurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair Trimmer</td>
			<td>Panasonic ;&#160; Japan&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ER-GY10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Straight operating scissor with sharp /sharp blades</td>
			<td style="width:255px;">Major Surgicals; India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Local Procurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps with Serrations</td>
			<td style="width:255px;">Major Surgicals; India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Local Procurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro needle holders&#160; straight &#38; curved&#160;</td>
			<td>Mercian ;&#160; England&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BS-13-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles&#160;</td>
			<td>Dispo Van; India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle</td>
			<td>BD ; US&#160;</td>
			<td>REF 303060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon Threads&#160;&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Mighty ; India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(1-0) Local Procurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture</td>
			<td style="width:255px;">Ethicon, Johnson &#38; Johnson, India</td>
			<td style="width:119px;">NW 5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture</td>
			<td>Sutures India Pvt. Ltd; India</td>
			<td>SN 5048</td>
			<td>Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cotton Buds</td>
			<td style="width:255px;">Pure Swabs Pvt Ltd ;&#160; India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Local Procurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:255px;">3M India ; India</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td>Micropore Surgical Tape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Microtome</td>
			<td style="width:255px;">Histo-Line Laboratories, Italy</td>
			<td style="width:119px;">MRS3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shandon Cryotome E Cryostat</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Electron Corporation ; US</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:255px;">Carl Zeiss ; Germany&#160;</td>
			<td style="width:119px;">LSM 510 META</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Bright Field Microscope</td>
			<td style="width:255px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:119px;">LX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:411px;">Automated analyser</td>
			<td>Tulip, Alto Santracruz, India</td>
			<td style="width:119px;">Screen Maaster 3000</td>
			<td>Biochemical analyser for liver functional test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:255px;">BD ; US&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD FACSverse</td>
			<td>Assesment of presence of cells post transplantation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Veet hair removal cream&#160;</td>
			<td>Reckitt Benckiser , India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FORANE</td>
			<td style="width:255px;">Abbott ; US</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>isoflurane USP 99.9%&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taxim</td>
			<td style="width:255px;">AlKem ; India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cefotaxime sodium injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Povidone-Iodine solution&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Win-Medicare;&#160; India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Betadine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:255px;">Himedia; India</td>
			<td style="width:119px;">GRM 3660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:411px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US</td>
			<td style="width:119px;">12200-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Sucrose</td>
			<td style="width:255px;">Sigma ; US</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:255px;">Sakura; US</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>O.C.T compound</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">DAPI</td>
			<td style="width:255px;">Himedia; India</td>
			<td style="width:119px;">MB 097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">anti-Albumin goat Polyclonal</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Scientific,Pierce, US</td>
			<td style="width:119px;">PA126081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal</td>
			<td style="width:255px;">abcam, UK</td>
			<td style="width:119px;">ab64609-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">antiGFP rabbit polyclonal&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Santa Cruz biotechnology; US</td>
			<td style="width:119px;">SC 8334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:411px;">Alexa Fluor 594 donkey anti-goat</td>
			<td style="width:255px;">&#160;Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;&#160; US</td>
			<td style="width:119px;">A11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:411px;">Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep</td>
			<td style="width:255px;">&#160;Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;&#160; US</td>
			<td style="width:119px;">A11015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:411px;">Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit</td>
			<td style="width:255px;">&#160;Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ;&#160; US</td>
			<td style="width:119px;">A21442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:411px;">Goat anti rabbit IgG HRP</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US&#160;</td>
			<td>65-6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:255px;">abcam, UK</td>
			<td style="width:119px;">ab15580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Antigen Unmasking Solution, Citric acid base</td>
			<td style="width:255px;">Vector laboratories, US</td>
			<td style="width:119px;">H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">ProLong Diamond antifade mountant</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US</td>
			<td style="width:119px;">P36966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">SGOT (ASAT) KIT</td>
			<td style="width:255px;">Coral Clinical System, India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">SGPT (ALAT) KIT</td>
			<td style="width:255px;">Coral Clinical System, India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td>
			<td style="width:255px;">Coral Clinical System, India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Hematoxylin Solution, Mayer&#39;s</td>
			<td style="width:255px;">Sigma ; US</td>
			<td style="width:119px;">MHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td style="width:255px;">Sigma ; US</td>
			<td style="width:119px;">HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">DPX Mountant&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Sigma ; US</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Melonex (Pain Killer)</td>
			<td style="width:255px;">Intas Pharmaceuticals Ltd; India</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Meloxicam injection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride</td>
			<td style="width:255px;">Sigma ; US</td>
			<td style="width:119px;">D3939</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrasplenic transplantation of hepatocytes after partial hepatectomy in nod.scid mice

Hepatectomy parcial é um método versátil e pode ser reproduzido para estudar a regeneração hepática e o efeito da terapêutica de célula com base em várias condições patológicas. Hepatectomy parcial também facilita a enxertia aumentada e proliferação das células transplantadas por neovascularização acelerada e migração de células para o fígado. Aqui, descrevemos um protocolo simples para executar hepatectomy 30% e o transplante de células no baço de um não-obesos diabéticos/grave combinado NOD imunodeficientes. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) rato.
Neste procedimento, são feitas duas pequenas incisões. A primeira incisão é expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado, e outra pequena incisão para expor o baço para o transplante intrasplenic de células. Este procedimento não requer nenhuma habilidade cirúrgica especializada, e pode ser completado em 5-7 minutos com menos estresse e dor, recuperação mais rápida e melhor sobrevivência. Nós demonstramos que o transplante de hepatócitos isolados de uma proteína verde fluorescente (GFP), expressando o rato (transgénico C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), bem como hepatócito como células de origem humana (NeoHep) em parcialmente hepatectomized NOD. Ratos SCID.

Proliferação hepatocyte após hepatectomy parcial de 30%: A proliferação dos hepatócitos nos restantes fígada após 30% hepatectomy foi examinada por imuno-histoquímica (IHC) mancha para um marcador de proliferação celular, Ki-67. Post um dia hepatectomy, os ratos foram sacrificados, os lóbulos de fígado restantes foram extirpados e cortes de parafina foram obtidos. As seções foram coradas com anticorpo Ki-67, seguido de rotulagem com anticorpo secundário conjugado de horseradish peroxidase (HRP). Di-Amino benzidina (DAB) foi usado como substrato para o desenvolvimento de cor marrom para HRP para identificar células manchadas. O núcleo foi contador corados com hematoxilina e visto sob um microscópio de objetiva X 20. A Figura 1 mostra uma imagem representativa de IHC de uma seção de fígado. Aproximadamente 13% das células (13.66 ± 0.317, N = 3) foram Ki-67 positivo, que confirmou que um hepatectomy 30% facilita a proliferação de hepatócitos no fígado do rato.
Estudo anatômico: Uma imagem representativa do fígado de um aceno. Rato SCID, 10 dias post hepatectomy é mostrado na Figura 2. Esta imagem confirmou que o fígado remanescente era saudável com nenhuma anormalidade visível.
Presença de células transplantadas durante a primeira hora de cirurgia: A orientação das células transplantadas foi confirmada com a análise de fluxo cytometric examinando a presença de hepatócitos positivos GFP 2 horas após o transplante.
Uma suspensão de célula única foi obtida o baço e o fígado do rato hospedeiro após digestão enzimática do tecido excisado borne 2 horas de transplante de hepatócitos de GFP. A porcentagem de células positivas de GFP transplantadas foi estimada utilizando um citômetro de fluxo. Um portão de dispersão foi selecionado entre o enredo de ponto correspondente do FSC-SSC para eliminar as células de detritos e gibão. O portão do quadrante da trama foi criado pela intensidade fluorocromo fundo de suspensões celulares obtidas o baço e o fígado de um rato de controle no qual não há células foram transplantadas. Cerca de 1,7% positivos hepatócitos GFP foram encontrados no baço, e nenhum hepatócitos GFP foram encontrados no fígado 2 horas após o transplante. Dados representativos são mostrados na Figura 3.
Imuno-histoquímica: Pós-operatório de dez dias, os ratos foram sacrificados e o lóbulo lateral direita, o lóbulo direito e os lóbulos medial esquerdos do fígado foram extirpados e cryo-seccionamento foi realizada para obter 5 µm de seções. Estas seções foram examinadas em seguida para o homing e enxertia das células transplantadas. A Figura 4 mostra as imagens representativas de imuno-histoquímica (IHC) mancha contra anti-GFP (vermelho) para identificar o GFP expressando hepatócitos de ratos (painel A, Be C); e contra a albumina humana (vermelha), bem como anti-humano connexin 32 (verde), para identificar os hepatócitos células (NeoHep) de origem humana (painel D, E, Fe G). O núcleo foi counterstained com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, azul) em ambos os casos. Estes painéis de imagem, alguns GFP engrafted expressando hepatócitos (painel A, Be C) e NeoHep (painel D, E, Fe G) são claramente visíveis.
Análise bioquímica do fígado secretado enzimas: Para verificar a funcionalidade do fígado após o procedimento cirúrgico, realizou-se análise bioquímica diferentes enzimas do fígado secretadas. Os gráficos de barra na Figura 5 representam o valor médio de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (fosfatase alcalina) no soro de NOD saudável. Os ratos SCID e diferentes grupos de parcialmente hepatectomized ratos. É evidente a partir do gráfico que após 1 dia de hepatectomy, os níveis das enzimas AST, ALT e fosfatase alcalina aumentaram significativamente, quando comparado com os ratos saudáveis.
Os níveis de enzima ALT e AST foram restaurados ao normal, enquanto os níveis de fosfatase alcalina permanecidos altos pós-operatório de dez dias em ratos não-transplantados. No entanto, os níveis de todas as três enzimas caiu ao normal em ratos transplantados após 10 dias.
Estudo histológico do fígado: As amostras de fígado dos ratos transplantados e hepatectomized foram processadas para análise histológica estudar o pós-operatório de alterações anatômicas. A Figura 6 mostra o campo brilhante representante imagens de hematoxilina e eosina (H e E) manchadas seções fígadas de ratinhos saudáveis sem cirurgia, dia 1 post hepatectomy parcial e 10 dias postar hepatectomy parcial e transplante de NeoHep. Nestas imagens, danos no fígado devido à proliferação suave de fibrose ou tecido conjuntivo peri-biliar foi observado após 1 dia de hepatectomy parcial e sem anomalias foram observadas pós-cirurgia de dez dias.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56018/56018fig1.jpg"> Figura 1 : Uma imagem representativa de Ki-67 coloração de NOD. Seção de SCID fígado após 1 dia de 30% hepatectomy. Seção estava manchada com anticorpo Ki-67, peroxidase de rábano (HRP) conjugado anticorpo secundário, DAB (marrom) foi usado como substrato HRP e núcleos foram counterstained pela hematoxilina (azul). As setas indicativas apontam algumas das células Ki-67 positivas (marrons). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56018/56018fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56018/56018fig2.jpg"> Figura 2 : Regenerado fígados lóbulos de um aceno. SCID rato 10 dias depois da cirurgia. R: caudado lobo (processo caudado), b: direito lóbulo lateral, c: no mesmo lóbulo, d: lóbulo, coração e:, f: restante do lobo lateral esquerdo após hepatectomy e g: lobo caudado (processo papilar). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56018/56018fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56018/56018fig3.jpg"> Figura 3 : Percentagem de GFP positivas do mouse heptatocytes no baço e no fígado de um aceno. Rato SCID. Os painéis superiores mostram o perfil de célula de um rato de controle combinado de idade em que não há células foram transplantadas. Painéis inferiores mostram o perfil de célula após 2 horas de transplante de hepatócitos GFP em um rato hepatectomized. Eixo y das parcelas denota a intensidade de fluorescência da GFP (canal FITC) medida em unidades arbitrárias em uma escala logarítmica, e o eixo x denota o forward scatter (FSC) em unidades arbitrárias em uma escala linear. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56018/56018fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56018/56018fig4.jpg"> Figura 4 : A orientação de GFP transplantado expressando hepatócitos de rato e NeoHep no fígado regenerado host. Imagens representativas de fígado seções de um parcialmente hepatectomized NOD. SCID mouse transplantado com hepatócitos de rato positivo de GFP (A-C), mostrando a enxertia de célula e de orientação. Painel r: núcleo (azul: DAPI), painel b: anti-GFP (vermelho: Alexa Fluor 594), imagem do painel c: mesclada. Painéis (D-G) mostram a seção fígada da parcialmente hepatectomized NOD. Rato SCID em qual NeoHep foram transplantadas. Painel d: núcleo (azul: DAPI), e: painel humano anti-Connexin 32 (verde: Alexa Fluor 488), f: painel humano antialbumina (vermelho: Alexa Fluor 594) e imagem mesclada de g: painel. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56018/56018fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56018/56018fig5.jpg"> Figura 5 : Análise bioquímica do fígado diferente secretados enzimas no soro de ratos. Coluna barras representam os valores médios de diferentes enzimas (AST/SGOT, ALT/SGPT, fosfatase alcalina). O ponto de tempo de estudo pós-cirurgia é mostrado no eixo X. No grupo controle, houve idade correspondido NOD. Realizou-se ratos SCID e sem cirurgia. Barras de erro significam o erro padrão da média, N = 3 e * indica p< 0.05, NS indica não-significância em p> 0,05. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56018/56018fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56018/56018fig6.jpg"> Figura 6 : Estudo histopatológico de cortes de tecido do fígado de ratos. Imagens de microscopia de campo claro representante de hematoxilina e eosina (H e E) manchadas de secções de tecido hepático de NOD. Camundongos SCID sob 20 X da lente objetiva. Painel A mostra uma seção de fígado de um aceno de cabeça saudável. Rato SCID da mesma idade sem qualquer cirurgia. Painel B mostra uma seção de fígado 1 dia post parcial hepatectomy. Nesta imagem, cabeças de seta para indicam a região de proliferação de fibrose ou tecido conjuntivo peri-billiary suave. Painel C mostra uma seção de fígado dez dias post parcial hepatectomy e célula de transplante. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56018/56018fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice at JoVE.com

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Descrevemos um protocolo para a realização de hepatectomy parcial (PHx) e transplante de células através do baço em NOD. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) ratos. Neste protocolo, uma incisão é feita para expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado seguido por outra incisão para o transplante intrasplenic de células.

Intrasplenic transplante de hepatócitos após Hepatectomy parcial na NOD. Ratos SCID

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

intrasplenic-transplantation-hepatocytes-after-partial-hepatectomy

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

13.9K visualizações.  National Institute of Immunology. Descrevemos um protocolo para a realização de hepatectomy parcial (PHx) e transplante de células através do baço em NOD. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) ratos. Neste protocolo, uma incisão é feita para expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado seguido por outra incisão para o transplante intrasplenic de células.

Vídeo: Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

Transplante mamária de células estromais e células de carcinoma em camundongos C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Medicina

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Transplante ortotópico de aorta em camundongos para o Estudo da Doença Vascular

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

Procedimentos cirúrgicos para um modelo de rato de Transplante de Fígado parcial ortotópico com reconstrução arterial hepática

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies this model by avoiding challenging suture anastomoses of small vessels thereby reducing warm ischemia time. In comparison to abdominal graft implantation the cervical model is less invasive and the implanted graft is easily accessible for further follow-up examinations. Anastomoses are performed by pulling the ascending aorta of the graft over the cuff with the recipient&#8217;s common carotid artery and by pulling the main pulmonary artery over the cuff with the external jugular vein. Selection of appropriate cuff size and complete mobilization of the vessels are important for successful revascularization. Ischemia-reperfusion (I/R) injury can be minimized by perfusing the graft with a cardioplegic solution and by hypothermia. In this article, we provide technical details for a simplified and improved cuff technique, which should allow surgeons with basic microsurgical skills to perform the procedure with a high success rate.

The cuff technique shortens and facilitates the model of heterotopic cervical heart transplantation in mice by avoiding technically challenging suture anastomoses of small vessels. The technical details shown in this video paper should allow researches to establish this model in their laboratories.

Heterotopic Cervical Transplante Cardíaco em Ratos

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the silicone compound, via a 26 G catheter, into the portal or hepatic vein. After silicone injection, organs were explanted and prepared for ex-vivo micro-CT (&#181;CT) scanning. The silicone injection procedure is technically challenging. Achieving a successful outcome requires extensive microsurgical experience from the surgeon. One of the challenges of this procedure involves determining the adequate perfusion rate for the silicone compound. The perfusion rate for the silicone compound needs to be defined based on the hemodynamic of the vascular system of interest. Inappropriate perfusion rate can lead to an incomplete perfusion, artificial dilation and rupturing of vascular trees.
The 3D reconstruction of the vascular system was based on CT scans and was achieved using preclinical software such as HepaVision. The quality of the reconstructed vascular tree was directly related to the quality of silicone perfusion. Subsequently computed vascular parameters indicative of vascular growth, such as total vascular volume, were calculated based on the vascular reconstructions. Contrasting the vascular tree with silicone allowed for subsequent histological work-up of the specimen after &#181;CT scanning. The specimen can be subjected to serial sectioning, histological analysis and whole slide scanning, and thereafter to 3D reconstruction of the vascular trees based on histological images. This is the prerequisite for the detection of molecular events and their distribution with respect to the vascular tree. This modified silicone injection procedure can also be used to visualize and reconstruct the vascular systems of other organs. This technique has the potential to be extensively applied to studies concerning vascular anatomy and growth in various animal and disease models.

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using &#181;CT and histological serial sections.

Visualização dos Vascular e parênquima regeneração após 70% hepatectomia parcial em ratos normais

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. To better understand the mechanism behind these surgical procedures, a rat partial liver transplantation (PLTx) model was established for relevant surgical studies. Because of the complexity of the rat PLTx model, a protocol with detailed descriptions is required. An article published previously reported a protocol in which ex vivo hepatectomy was used to achieve 50% rat PLTx. In contrast to this protocol, we introduced a re-arterialized PLTx with an in vivo 70% hepatectomy. An updated vessel-oriented hepatectomy was incorporated into the rat PLTx to refine the microsurgical procedure. The portal veins and hepatic arteries of the left lateral lobe and the median lobe were individually dissected and ligated before removal of the liver parenchyma, thereby decreasing the probability of bleeding in the remnant liver stump. Furthermore, an end-to-side vessel anastomosis between the common hepatic artery and the enlarged proper hepatic artery was introduced to re-arterialize the hepatic artery. By using this end-to-side vessel anastomosis technique, the diameter of the anastomosis was enlarged, thereby decreasing the difficulty of hand suture and maintaining a high rate of anastomotic patency. Moreover, the cuff anastomosis of the infrahepatic vena cava was slightly modified. A section of circumferential liver parenchyma around the vena cava of a recipient was preserved during cuff anastomosis to maintain the three-dimensional shape of the vascular lumen. This section of liver parenchyma was removed after completing the anastomosis. With this modification, the step involving placement of stay sutures was omitted, thereby further shortening the cuff anastomosis time. By using this protocol of rat PLTx, a low liver enzyme level, an intact liver lobular architecture and a high survival rate were achieved after microsurgery.

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Here, a protocol involving re-arterialized rat partial liver transplantation is presented. Specifically, 70% liver was resected in vivo by using an updated technique of vessel-oriented hepatectomy. The hepatic artery was reconstructed in an end-to-side manner. The cuff technique was modified to shorten the anastomosis time of the infrahepatic vena cava.

Re-Arterialized transplante de fígado parcial de rato com na vivo orientado a embarcação 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of clinical efficacy, they are until now imperfect solutions. Stem cell therapy using ASC sheets could provide a solution to this problem. ASCs are considered as promising candidates for promoting tissue healing because of their trophic and immunomodulatory properties. Here, we provide methods to produce high-density ASC sheets, that are transplanted onto a colorectal anastomosis in a rat model to reduce the leakage. ASCs formed cell sheets in thermo-responsive culture dishes that could be easily detached. On the day of the transplantation, a partial colectomy with a 5-suture colorectal anastomosis was performed. Animals were immediately transplanted with 1 ASC sheet per rat. ASC sheets adhered spontaneously to the anastomosis without any glue, suture, or any biomaterial. Animal groups were sacrificed 3 and 7 days postoperatively. Compared to transplanted animals, the incidence of anastomotic abscesses and leakage was higher in control animals. In our model, the transplantation of ASC sheets after colorectal anastomosis was successful and associated with a lower leakage rate.

The preparation and transplantation of adipose tissue derived stem cell (ASC) sheets onto insufficiently sutured colorectal anastomoses in a rat model is presented. This novel application shows that ASC sheets can reduce colorectal anastomosis leakage.

Transplante de células-tronco derivadas de tecido adiposo folha para reduzir o vazamento após colectomia parcial em um modelo do rato

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the treatment of many hematopoietic diseases in humans, as their use offers stable transgene expression due to the vector&#39;s ability to integrate into the host genome. This method demonstrates the application of ex vivo gene therapy of hepatocytes to a large animal model of hereditary tyrosinemia type I. This process consists of 1) isolation of primary hepatocytes from the autologous donor/recipient animal, 2) ex vivo gene delivery via hepatocyte transduction with a lentiviral vector, and 3) autologous transplant of corrected hepatocytes via portal vein injection. Success of the method generally relies upon efficient and sterile removal of the liver resection, careful handling of the excised specimen for isolation of viable hepatocytes sufficient for re-engrafting, high-percentage transduction of the isolated cells, and aseptic surgical procedures throughout to prevent infection. Technical failure at any of these steps will result in low yield of viable transduced hepatocytes for autologous transplant or infection of the donor/recipient animal. The pig model of human type 1 hereditary tyrosinemia (HT-1) chosen for this approach is uniquely amenable to such a method, as even a small percentage of engraftment of corrected cells will lead to repopulation of the liver with healthy cells based on a powerful selective advantage over native-diseased hepatocytes. Although this growth selection will not be true for all indications, this approach is a foundation for expansion into other indications and allows for manipulation of this environment to address additional diseases, both within the liver and beyond, while controlling for exposure to viral vector and opportunity for off-target toxicity and tumorigenicity.

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

This protocol is intended to describe porcine hepatocyte isolation and ex vivo gene delivery to cure models of metabolic diseases via autologous cell transplantation. Although this particular model enjoys unique advantages that favor successful therapy, the application is a relevant foundation to address additional diseases and indications.

Particulas de Lentivirus terapia gênica mediada por vetor de hepatócitos Ex Vivo para transplante autólogo em suínos

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen

Acute liver failure (ALF) is a clinical condition caused by various etiologies resulting in the loss of metabolic, biochemical, synthesizing, and detoxifying functions of the liver. In most irreversible liver damage cases, orthotropic liver transplant (OLT) remains the only available treatment. To study the therapeutic potential of a treatment for ALF, its prior testing in an animal model of ALF is essential. In the current study, an ALF model in rats was developed by combining 70% partial hepatectomy (PHx) and injections of acetaminophen (APAP) that provides a therapeutic window of 48 h. The median and left lateral lobes of the liver were removed to excise 70% of the liver mass and APAP was given 24 h postsurgically for 2 days. Survival in ALF-induced animals was found to be severely decreased. The development of ALF was confirmed by altered serum levels of the enzymes alanine amino transferase (ALT), aspartate amino transferase (AST), alkaline phosphatase (ALP); changes in prothrombin time (PT); and assessment of the international normalized ratio (INR). Study of the gene expression profile by qPCR revealed an increase in expression levels of genes involved in apoptosis, inflammation, and in the progression of liver injury. Diffused degeneration of hepatocytes and infiltration of immune cells was observed by histological evaluation. The reversibility of ALF was confirmed by the restoration of survival and serum levels of ALT, AST, and ALP after intrasplenic transplantation of syngeneic healthy rat hepatocytes. This model presents a reliable alternative to the available ALF animal models to study the pathophysiology of ALF as well as to evaluate the potential of a novel therapy for ALF. The use of two different approaches also makes it possible to study the combined effect of physical and drug-induced liver injury. The reproducibility and feasibility of current procedure is an added benefit of the model.

The acute liver failure animal model developed in the current study presents a feasible alternative for the study of potential therapies. The current model employs the combined effect of physical and drug-induced hepatic injury and provides a suitable time window to study the potential of novel therapies.

Geração de um modelo de rato de insuficiência hepática aguda, combinando 70% hepatectomia parcial e paracetamol

Acute liver failure (ALF) is a clinical condition caused by various etiologies resulting in the loss of metabolic, biochemical, synthesizing, and ...

Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation of human liver transplantation due to the absence of arterial reconnection. Described here is a modified transplantation procedure that includes the incorporation of hepatic artery (HA) reconnection, leading to a marked improvement in transplant outcomes. With a mean anhepatic time of 12 min and 14 s, HA reconnection results in improved perfusion of the transplanted liver and an increase in long-term recipient survival from 37.5% to 88.2%. This protocol includes the use of 3D-printed cuffs and holders to connect the portal vein and infrahepatic inferior vena cava. It can be implemented for studying multiple aspects of liver transplantation, from immune response and infection to technical aspects of the procedure. By incorporating a simple and practical method for arterial reconnection using a microvascular technique, this modified rat OLT protocol closely mimics aspects of human liver transplantation and will serve as a valuable and clinically relevant research model.

The goal of this study is to modify the rat orthotopic liver transplant model to better represent human liver transplantation and improve recipient survival. The presented method reestablishes hepatic arterial inflow by connecting the donor liver&#39;s common hepatic artery to the recipient liver&#39;s proper hepatic artery.

Complicações reduzidas após reconexão arterial em um modelo de rato de transplante de fígado ortotópico

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation ...