Somos gratos pela excelente assistência técnica de Janine Becker, Caroline Bickelmann e Ruth Nickels. Este estudo foi financiado por uma concessão do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Fundação Alemã de Pesquisa) - LA 2682 / 7-1.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Instituto Nacional de diretrizes de saúde para o uso de animais de laboratório e seguindo as orientações institucionais (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Alemanha). 1. Preparação de Instrumentos Cirúrgicos <ol><li> Manter prontas as tesouras de dissecação, pinças cirúrgicas, uma tesoura pequena de preparação, uma pinça fina e uma placa de Petri estéril com meio de Eagle modificado por 15 ml de Dulbecco (DMEM, 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 U / mL de penicilina, 0,1 mg / mL de estreptomicina ) para a colheita de almofadas de gordura epididimal. </li><li> Expor os instrumentos cirúrgicos para uma solução desinfectante para 5 min. Alternativamente, esterilizá-los (esterilização a vapor; 121 ° C, 20 min). </li></ol> 2. Animais e Anestesia <ol><li> Escolher cuidadosamente a estirpe de ratinhos, tal como indicado para o estudo e o<html> assunto sob investigação. Nota: Neste estudo foi utilizada macho de tipo selvagem ratinhos C57BL / 6 como dadores para a colheita de gordura epididimal. De interesse, ad-MVF pode ser também isolado a partir de transgénicos proteína fluorescente (GFP) animais dadores -positivas verdes (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. Isto leva a grande vantagem de que os fragmentos são facilmente detectáveis por coloração imuno-histoquímica de GFP após a implantação em ratinhos de tipo selvagem GFP-negativo 14. </li><li> Anestesiar os animais com uma injecção intraperitoneal de xilazina (15 mg / kg) e cetamina (75 mg / kg). Certifique-se de que os animais estão profundamente anestesiados através da realização de uma pitada dedo do pé sem resposta. lubrificante olho não é indicada como os animais dadores são sacrificados após a colheita de gordura. NOTA: Certifique-se de que a analgesia e esterilidade cirúrgica estão de acordo com as respectivas diretrizes do país e instituição onde estão previstos os experimentos. </li></ol>le &quot;&gt; 3. colheita de gordura epididimal Pads <ol><li> Transferir o animal a uma mesa de operação. Colocar o animal em decúbito dorsal sob uma lupa cirúrgica e confirmar anestesia profunda usando toe pitada. </li><li> Imobilizar as patas gravando-los para um campo cirúrgico e desinfectar o abdome com solução desinfetante. </li><li> Separar a pele abdominal livre da camada muscular subjacente com a tesoura de dissecção. </li><li> Executar uma laparotomia na linha média com as tesouras de dissecação e lateralmente desdobrar as abas da parede abdominal. </li><li> Bilateralmente identificar testículo, epidídimo e a gordura epididimal usando os fórceps finos (Figura 1). Não prejudicar as estruturas intestinais para evitar a contaminação fecal das bolsas de gordura. </li><li> Colher as almofadas de gordura epididimal com as pequenas tesouras de preparação e as pinças finas sob o microscópio estereoscópico. Manter uma margem de segurança de vários mm entre o epidídimo e a gordurareduzir o risco de colheita epididimal acidental. NOTA: Este procedimento também pode ser realizado sem um microscópio estereoscópico. No entanto, isto pode aumentar ainda mais o risco de lesão acidental do epidídimo e cabos espermático. </li><li> Transferir as almofadas de gordura epididimal em uma placa de Petri contendo 15 ml de DMEM pré-aquecida a 37 ° C durante o transporte para o laboratório de células. </li><li> Sacrificar o animal por incisão da aorta abdominal ou luxação cervical. </li></ol> 4. Isolamento de ad-MVF <ol><li> Prepare três placas de Petri estéreis com 15 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), estéril de polipropileno de 14 mL tubos (PP), uma de 50 mL estéril, Erlenmeyer estéreis de 1,5 ml cónico de tubos de microcentrífuga e tesouras finas esterilizados. </li><li> Lavam-se as almofadas de gordura três vezes em placas de Petri com 15 mL de PBS sob uma câmara de fluxo laminar. </li><li> Transferir a gordura para um tubo de 14 mL PP. Determinar o volume de tecido adiposo colhido (em ml), por meio de tele escala tubo. Picar o tecido adiposo mecanicamente com as tesouras finas, até uma suspensão de tecido homogénea. </li><li> Transferir o tecido triturado com dois volumes de colagenase NB4G (0,5 U / mL de PBS) em um balão de 50 mL Erlenmeyer por meio de 10 mL de medição pipeta. O volume total torna-se três vezes o volume de tecido adiposo medida no passo 4.3. Realizar a digestão do tecido em um incubador durante 10 min, sob agitação vigorosa por meio de um agitador automatizado (tamanho da barra de agitação magnética: 25 mm) a 37 ° C e as condições atmosféricas húmida com 5% de CO 2. </li><li> Observar uma pequena fracção (10 pL) do tecido digerido sob um microscópio para julgar se a digestão pode ser parada. Verificar que o digerido contém principalmente &quot;livre&quot; ad-MVF lado de células individuais, indicando o ponto apropriado para interromper o processo de digestão enzimática (Figura 2). NOTA: Este passo exige experiência com o procedimento e é fundamental para a qualidadede isolado ad-MVF. Prolongada resultados digestão de gordura em uma suspensão de uma única célula, sem ad-MVF. </li><li> Neutraliza-se a enzima com dois volumes de PBS / FCS a 20%. O volume total torna-se três vezes o volume da suspensão de células-vaso no passo 4.4. Transferir a suspensão de células-vaso de volta para novos tubos PP. </li><li> Incubar a suspensão durante 5 minutos a 37 ° C para separar ad-MVF de gordura restante por gravidade. Em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante principal gordura com uma pipeta de precisão, 1-mL. Repetir este ciclo várias vezes com uma pipeta de precisão de 100 uL até a suspensão parece ser isento de gordura. </li><li> Colocar um filtro de 500? M por cima de um tubo de centrífuga cónico de 50 ml. Transferir a suspensão de células-embarcação com uma pipeta de medição de 10 ml dos 14 ml tubos PP na membrana de filtro para remover o restante coágulos de gordura. Transferir a suspensão filtrada para novos tubos de 14 mL de PP de acordo com o número de individual ad-MVF isolados para as experiências planeadas. NOTA: Para em vitrO ensaios de focagem sobre a formação da rede microvascular, pode ser benéfico para purificar ainda mais a suspensão de células-navio para melhorar a qualidade da imagem durante a análises microscópicas. Para este fim, a suspensão pode ser, adicionalmente, uma vez filtrada com um filtro de 20 mícrons para remover as células individuais do ad-MVF recolhidas no filtro. </li><li> Centrifugar a suspensão de células-reservatório (600 xg, 5 min, temperatura ambiente) para obter um pelete contendo ad-MVF. </li><li> Após centrifugação, remove-se o sobrenadante até 1 ml é deixado. Ressuspender o sedimento com ad-MVF neste 1 mL e transferir a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml cónico. </li><li> Centrifugar a suspensão ad-MV F no tubo de microcentrífuga (600 xg, 5 min) para obter um pelete. </li><li> Remover o sobrenadante para ressuspender o sedimento no volume final requerido de PBS / FCS a 20%. NOTA: O número de ad-MVF por isolado pode ser avaliada por contagem microscópica. Para esta finalidade, 1/10 da célula-vesse definitival suspensão foi diluída a 1:10 em PBS e 100 ul desta diluição é transferida para um poço de uma placa de 96 poços. Todo o número de ad-MVF exibindo uma morfologia vaso semelhante é então contado e extrapolado para todo o isolado. A concentração ad-MVF necessário e a purificação pode ser adaptado individualmente ao respectivo in vitro ou in vivo de aplicação do ad-MVF. Isto pode incluir a incorporação de ad-MVF em géis de colagénio para a análise in vitro de formação de rede microvascular ou a semeadura de ad-MVF em andaimes para implantação in vivo em defeitos de tecidos. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste estudo apresentamos um protocolo bem estabelecido para o isolamento de ad-MVF. Obtenção ad-MVF do tecido adiposo murino é um procedimento simples com alguns passos críticos. Os ratinhos exibem diferentes subcutânea e depósitos de gordura intra-abdominais. Como anteriormente descrito para os ratos, a fonte de gordura mais adequado para o isolamento de ad-MV F são as almofadas de gordura epididimal devido ao seu tamanho, estrutura homogénea e contaminação mínima com os vasos sanguíneos maiores 11, 12. Em contraste, os depósitos de gordura subcutânea em ratinhos são muito menores e mais aderentes ao tecido circundante. No entanto, a excisão de bolsas de gordura epididimais suporta o risco de lesão acidental do epidídimo e cabos espermáticas, resultando na contaminação do tecido colhido com espermatozóides. Portanto, a identificação do epidídimo, testículo e cabos espermáticas é de grande importância neste procedimento. Além disso, as bolsas de gordura deve ser rapidly processadas após a colheita para minimizar ex vivo danos nos tecidos. Finalmente, deve-se considerar que existem grandes variações dependentes da idade na vascularização do epidídimo murino bolsas de gordura 23. Na nossa experiência, a utilização de ratinhos dadores do sexo masculino com 6 a 12 meses de idade fornece quantidades suficientes de ad-MVF para in vitro e estudos in vivo. No entanto, também pode ser possível isolar ad-MV F de ratos mais jovens, os quais exibem almofadas de gordura mais pequenas mas altamente vascularizados 24. A digestão enzimática das bolsas de gordura do epidídimo colhidas crucialmente determina a qualidade final do isolado ad-MVF. Muito curta exposição a colagenase leva à separação incompleta de ad-MVF dos adipócitos circundantes. Por outro lado, a digestão prolongado resulta na destruição de ad-MVF para uma suspensão de células individuais, a fracção vascular chamado estroma (SVF). O SVF é uma população de células heterogénea contendo mcélulas esenchymal estaminais, células endoteliais, pericitos, macrófagos e muitos outros tipos de células com potencial de regeneração através parácrinos e diferenciação mecanismos 25. O uso de ad-MVF apresenta vantagens consideráveis ​​quando comparadas com as abordagens baseadas em SVF. A morfologia de microvasos totalmente funcional de ad-MVF permite a sua implantação imediata para experiências in vivo, sem demorado e complexo de cultivo in vitro. Além disso, o isolamento do SVF geralmente requer a digestão do tecido com colagenase até 90 min 26. Em contraste, a degradação do tecido não deve exceder os 10 minutos para o isolamento de ad MVF. Isto apoia a ideia de aplicações intra-operatórias de uma etapa de ad-MVF 9. Para este fim, ad-MVF pode ser automaticamente isolado lipoaspirates autólogos e transferido de volta para um defeito do tecido do paciente sem sair da sala de cirurgia. Esta é uma goa realistal, considerando o facto do isolamento automatizado de SVF de lipoaspirates já é um procedimento clinicamente estabelecido em cirurgia plástica 27, 28, 29. Recentemente, temos demonstrado um forte efeito de ad-MVF na vascularização in vivo do osso 14 e da pele 15 suplentes. De interesse, descobrimos que é benéfico não para remover as células individuais do ad-MVF isolar, porque eles podem proporcionar um ambiente mais fisiológico que contribui para a alta capacidade de vascularização do ad-MVF 13. Portanto, apenas utilizado um filtro de 500? M durante o isolamento de ad-MVF para a remoção de coágulos não digerido de gordura maiores. Além disso, descobrimos que linfangiogênese ad-MVF induzir em pele implantado substitui 15. Assim, ad-MVF também podem ser promissores blocos de construção para lymphatic a engenharia de tecidos e terapia de linfedema. Para a tradução bem sucedida destes resultados experimentais para a prática clínica, o próximo passo lógico é para esclarecer se tecido adiposo humano é igualmente adequado para o isolamento de ad-MVF como gordura roedor. Neste contexto, uma questão crítica é a quantidade de gordura necessário para isolar grandes quantidades de ad-MVF. O protocolo aqui descrito resultou em aproximadamente 40.000 ad-MVF por tecido adiposo mL. Por conseguinte, 3 mL tecido adiposo seria necessário para prevascularize de 1 cm2 de pele dérmica substituto 15. Assim, esta abordagem pode não ser viável para o tratamento de feridas maiores ou doentes gravemente doentes, devido a uma quantidade limitada de tecido de gordura disponível para isolamento ad-MVF. Ao lado de um amplo espectro de potencial em aplicações in vivo em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, ad-MV F também são adequados para modelar in vitro de proc angiogénicocessos. Por exemplo, rato ad-MVF foram cultivadas em três dimensões hidrogéis de colágeno para estudar a formação de novas redes microvasculares 30. Abordagens semelhantes foram usadas para avaliar técnicas de imagem sofisticado para a visualização de crescimento neovessel 13 ou remodelação da matriz intersticial 31 durante a angiogénese. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que ad-MVF não são apenas prometendo vascularização e unidades linfangiogênicas para futuras estratégias terapêuticas, mas também para a pesquisa básica no campo da angiogênese e fisiologia vascular.

A engenharia de tecidos centra-se na fabricação de tecidos e de órgãos substitutos que manter, aumentar ou restaurar a função de inoperável em homólogos in vivo 1, 2. O destino de construções de engenharia de tecidos depende essencialmente uma vascularização adequada 3. Redes microvasculares dentro dessas construções devem ser hierarquicamente organizado com arteríolas, capilares e vênulas para permitir perfusão sanguínea eficiente após inosculation a vasculatura do destinatário 4. A geração de tais redes é um dos principais desafios em engenharia de tecidos. Para isso, um amplo espectro de estratégias de vascularização experimentais foi introduzido ao longo das últimas duas décadas 5, 6. abordagens angiogénicos estimular o crescimento de microvasos em receptores tiss engenhariaues por meio de modificação estrutural andaime ou físico-químicas, tais como a incorporação de factores de crescimento 7. No entanto, a vascularização de grandes construes tridimensionais, estratégias dependentes da angiogénese são marcadamente limitados por baixas taxas de crescimento de microvasos a desenvolver 8. Em contraste, o conceito de prevascularization tem como objectivo para a geração das redes microvasculares funcionais dentro do tecido constrói antes da sua implantação 9. Prevascularization convencional envolve a co-cultura de células formadoras de vasos, tais como células endoteliais, células mural ou células-tronco 10, dentro de andaimes. Após a formação da rede microvascular, as construções prevascularized pode então ser implantado num defeitos de tecidos. Contudo, tal abordagem prevascularization é difícil de aplicar em um ambiente clínico, porque se baseia no complexo e demorado in vitro &lt;/ em&gt; procedimentos, que são restritos por grandes obstáculos regulatórios 9. Por conseguinte, existe ainda uma necessidade para o desenvolvimento de novas estratégias prevascularization que são mais adequados para uma aplicação clínica ampla. Tal estratégia prevascularization pode ser a aplicação de fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo (ad-MVF). ad-MVF representam unidades de vascularização potentes que podem ser colhidas em grandes quantidades a partir do tecido adiposo de ratos 11, 12 e 13 ratinhos. Eles consistem de arteríolas, capilares, e segmentos de vasos venulares, que exibem uma morfologia de microvasos fisiológico com um lúmen e estabilizantes células perivasculares 14, 15. Esta característica única permite a implantação imediata de andaimes ad-MVF-semeado em defeitos de tecido sem pré-cultura. Lá, o ad-MVF remontar rapidamente ema redes microvasculares funcionais. Além disso, ad-MVF representam uma rica fonte de células-tronco mesenquimais 16, que pode ainda contribuir para a sua capacidade de regeneração impressionante. Por conseguinte, ad-MV F são cada vez mais utilizado em diferentes campos da engenharia de tecidos 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21. O isolamento de ad-MVF foi estabelecida originalmente em ratos 11, 12. Aqui, nós descrevemos um protocolo, que permite o isolamento padronizado de murino ad-MVF de almofadas de gordura epididimal. Isto pode facilitar uma melhor compreensão sobre os mecanismos moleculares subjacentes à função de ad-MVF usando modelos de ratinhos transgénicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL conical microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR, Kelsterbach, Germany</td>
			<td>700-5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-&#181;L precision pipette</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>4920000059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL measuring pipette</td>
			<td>Costar, Corning Inc., New York, USA</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14-mL PP tubes</td>
			<td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>187261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL precision pipette</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>4920000083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500-&#181;m filter (pluriStrainer 500 &#181;m)</td>
			<td>HISS Diagnostics, Freiburg, Germany</td>
			<td>43-50500-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR, Kelsterbach, Germany</td>
			<td>214-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell detachment solution (Accutase)</td>
			<td>eBioscience, San Diego, CA USA</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River, Cologne, Germany</td>
			<td>027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA</td>
			<td>003291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117-FITC</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>553373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>553354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase NB4G&#160;</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>17465.02</td>
			<td>Lot tested by manufacturer for enzymatic activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Braun Aesculap AG &#38;CoKG, Melsungen, Germany</td>
			<td>BC 601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>PAN Biotech, Rickenbach, Germany</td>
			<td>P04-03600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>S&#38;T AG, Neuhausen, Switzerland</td>
			<td>FRS-15 RM-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>503261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermal skin substitute (Integra)</td>
			<td>Integra Life Sciences, Sain Priest, France</td>
			<td>62021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany</td>
			<td>7005294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-IgG2akAL488&#160;&#160;</td>
			<td>eBioscience, San Diego, CA USA</td>
			<td>53-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm (disinfecting solution)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayer, Norderstedt, Germany</td>
			<td>118211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza Group, Basel, Switzerland</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20-&#181;m (20 &#181;m filter)</td>
			<td>HISS Diagnostics, Freiburg, Germany</td>
			<td>43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-IgG2akFITC</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>553988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-IgG2akPE</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>553930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small preparation scissors</td>
			<td>S&#38;T AG, Neuhausen, Switzerland</td>
			<td>SDC-15 R-8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>Braun Aesculap AG &#38;CoKG, Melsungen, Germany</td>
			<td>BD510R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm</td>
			<td>Fink &#38; Walter GmbH, Mechweiler, Germany</td>
			<td>1671801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine&#160;</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-SMA-AL488</td>
			<td>eBioscience, San Diego, CA USA</td>
			<td>53-9760-82</td>
			<td>Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering

Uma rede microvascular funcional é de importância crucial para a sobrevivência e integração de construções de tecido de engenharia. Para isso, várias estratégias angiogênicos e prevascularization foram estabelecidas. No entanto, a maioria das abordagens com base em células in vitro incluem passos que consomem tempo para a formação de uma rede microvascular. Assim, eles não são adequados para procedimentos de uma etapa intra-operatórios. Adiposos fragmentos microvasculares derivadas de tecido (ad-MVF) representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser facilmente isolados a partir de tecido gordo e exibem uma morfologia de microvasos funcional. Além disso, eles rapidamente remontar em novas redes microvasculares após implantação in vivo. Além disso, ad-MVF foram mostrados para induzir linfangiogênese. Finalmente, eles são uma fonte rica de células-tronco mesenquimais, que pode ainda contribuir para o seu alto potencial de vascularização. Em estudos anteriores que demonstraram a vascularizati notávelna capacidade de ad-MVF em substitutos ósseos e pele de engenharia. No presente estudo, são descritos em um protocolo padronizado para o isolamento enzimático de ad-MVF de tecido adiposo murino.

No presente estudo foi realizada seis procedimentos de isolamento ad-MVF com tecido adiposo a partir de 7- ao macho de tipo selvagem de 12 meses de idade C57BL 6 ratinhos / (peso corporal médio: 35 ± 1 g). A Figura 1 ilustra a colheita das almofadas de gordura epididimal de murino com subsequente isolamento mecânico e enzimática ad-MVF. O tempo necessário para a colheita de gordura foi de 30 minutos e para o isolamento de ad MV F foi de 120 min. No total, o processo levou 150 minutos. Colhemos 1,2 ± 0,1 ml de tecido adiposo por animal dador. Esta quantidade de gordura permitiu o isolamento de 42000 ± 2000 ad-MVF por mL. O comprimento médio do isolado ad-MV F foi de 42 ± 1 um (Figura 2A). A duração da digestão enzimática foi determinada através de um controlo microscópico como se mostra na Figura 2B. ad-MV F exibiram uma morfologia típica de microvasos com ves hierárquicossegmentos sel (Figura 2c). Nós também caracterizou o ad-MVF por meio de citometria de fluxo. Para esta finalidade, ad-MVF foram ainda digeridas em solução de separação celular durante 30 min em células individuais 15. As análises de citometria de fluxo revelou que ad-MVF contém 26 ± 2% de células CD31-positivas endoteliais, 17 ± 2% actina de músculo liso-α (SMA) células perivasculares -positivas, e células de 9 ± 1% positivas para o marcador de células estaminais mesenquimais CD117 (Figura 3A-C). Após sementeira em um substituto de pele dérmica, o qual foi fixada e seccionados imediatamente para análises histológicas, maior ad-MVF estavam localizados principalmente na superfície do implante (Figura 3D). No entanto, os segmentos dos vasos capilares também poderiam ser detectados dentro dos seus poros. a coloração imuno-histoquímica de semeadas ad-MVF revelou configuração adicional de microvasos fisiológico com arteriolar, venulare fragmentos semelhantes a capilares (Figura 3E). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig1.jpg" /> Figura 1: ad-MVF isolamento. A) Após laparotomia na linha média, as almofadas de gordura epididimal (asteriscos) estão identificados. O tecido adiposo é colhida com uma pequena tesoura de preparação e o animal é sacrificado por incisão da aorta abdominal (ponta de seta). B) picagem mecânica das almofadas de gordura com tesouras finas, até a suspensão de tecido parece homogénea. C) Para a digestão enzimática, a colagenase é adicionada à suspensão de tecido. D) A suspensão de células é incubada-vaso e a camada sobrenadante de gordura é descartado. E) Depois da centrifugação, o sedimento contendo ad-MVF é ressuspenso e pode ser utilizado em diferentes aplicações, tais como a análise in vitro de Microvasca formação da rede ular ou a semeadura de ad-MVF em andaimes para implantação in vivo em defeitos de tecidos (F). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55721/55721fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig2.jpg" /> Figura 2: características morfológicas de ad-MVF. A) Comprimento de distribuição isolada de fresco ad-MVF. Média ± erro padrão da média (n = 6). B) Imagem microscópica de um esfregaço de suspensão de células-recipiente com grande (seta), (setas duplas de tamanho médio) e pequenas (pontas de seta pretas) ad-MV F, bem como células individuais (pontas de seta brancas). Barra de escala = 110 pm. Maior ampliação revela que exibem ad-MVF uma morfologia de microvasos maduro com segmentos de microvasos hierárquica (C, <strong&gt; inserida de B). Barra de escala: = C 50? m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55721/55721fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig3.jpg" /> Figura 3: Citometria de Fluxo, características histológicas e imuno-histoquímica de ad-MVF. CA) Fluxo de análises de citometria de isolado de fresco ad-MVF ilustrando CD31-positivo das células endoteliais (A), α-SMA positivos célula perivascular (fracções de células estaminais mesenquimais CD117-positivo (C) B) e. controlos de isotipo-idênticas apropriadas foram utilizados para ajustar os níveis de limiar. Média ± erro padrão da média (n = 6). D) e hematoxilina-eosina secção corada de um substituto de pele dérmica semeado. Alguns segmentos de vasos capilares estão localizados no implante &amp;# 39; s poros (setas). microvasos maiores com venular (seta dupla) ou arteriolar (seta) morfologia está localizada na sua superfície. Escala da barra = 40 m. linha quebrada = fronteira implante. E) Caracterização de ad-MV F por meios de detecção imunohistoquímica do marcador celular endotelial CD31 (vermelho) e o marcador de culas perivasculares α-SMA (verde). núcleos de células foram marcadas com um corante fluorescente de ligação ao ADN (azul). ad-MVF (seta) arteriolar são caracterizadas por uma camada de células α-SMA positivos mais espessa quando comparada com venular fragmentos com um lúmen de maiores dimensões (seta dupla). Pontas de seta = ad-MVF capilar. Escala da barra = 25 m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55721/55721fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos.

Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

isolation-murine-adipose-tissue-derived-microvascular-fragments-as

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K visualizações.  Saarland University.  Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos. 

Vídeo: Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Bioengenharia

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Processamento de pós-produção de Fibras electrospun para Engenharia de Tecidos

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Os tecidos músculo esquelético de engenharia a partir de células progenitoras mioblastos murinos e Aplicação da estimulação elétrica

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Preparação de Thermoresponsive nanoestruturados Surfaces para Engenharia de Tecidos

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa<em&gt; In Vivo</em&gt; Câmara Engenharia de Tecidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Dois métodos para Decellularization de tecidos vegetais para aplicações de engenharia de tecidos

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...