Agradecemos a Jeff Tucker, Erica Scappini, e Agnes Janoshazi por sua ajuda com a microscopia, Ligon Perrow por sua gestão da colônia rato, e Jun Chen e Michael Sanderson para obter ajuda com o cortador de tecido, e Michael Fessler e Derek Cain para a leitura crítica o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo ramo intramural do NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09), que por sua vez é patrocinado pelo Departamento de Saúde e Serviços Humanos.

procedimentos experimentais animais descritos no presente documento foram aprovados pelo Comité de Cuidados e NIEHS animal Uso (IACUC). 1. Preparação do pulmão <ol><li> ratos de casa entre 6 e 12 semanas de idade em condições específicos isentos de agentes patogénicos, de acordo com as orientações fornecidas pelos Comitês de Cuidado e Uso Institucional animais. NOTA: Imaged ratos pode ser ingênuo, ou tratados, dependendo dos interesses específicos de cada pesquisador. Aqui, nós descrevemos a localização celular imune em ratinhos ncios e em ratos tratados com 100? G de ovalbumina (OVA) e 0,1 ug de lipopolissacárido (LPS), utilizando tampão fosfato salino (PBS) como veículo em um volume total de 50 uL. Para infundir oropharyngeally OVA / LPS para as vias aéreas, os animais foram anestesiados com inalação de isoflurano e verticalmente suspensas pelos seus dentes com uma banda de borracha. A língua foi gentilmente apreendido com uma pinça e segurou para um lado para evitar engolir, e 50 &amp; #181; L da solução de OVA / LPS depositada na parte posterior da cavidade oral, como previamente descrito 17. </li><li> Eutanásia do ratinho com injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (100 mg / kg), e fixar o animal a uma base de poliestireno. </li><li> Abrir a cavidade abdominal com uma tesoura, cortando a pele e peritônio do meio do abdômen até a mandíbula. Puxe os intestinos de lado com fórceps ou a borda maçante da tesoura e cortar a vena cava inferior para drenar o sangue para fora dos pulmões. Perfurar o diafragma com a ponta afiada da tesoura para permitir a expansão da caixa torácica, tomando cuidado para não cortar os pulmões. </li><li> glândulas salivares claras e outro tecido para longe da traqueia, agarrando o tecido e manualmente puxando-o para longe da traqueia subjacente com uma pinça. Fazer uma pequena incisão na traquéia na face anterior da banda mais espessa da cartilagem usando uma pinça fina ou tesouras, tomando cuidado para não cortar todo o caminho que o trachea. A incisão será apenas suficientemente grande para permitir que uma agulha de 20 G a passar através. </li><li> Deslize de 1,5 polegada, 20 L de agulha para uma secção de tubo de polietileno, deixando cerca de 1 cm de tubo para além da extremidade da agulha. Cortar o tubo com um ângulo de aproximadamente 45 ° para chanfrar a extremidade, colocar a agulha para uma seringa de 1 mL, e carregar a seringa por desenho 0,8 mL de água morna (40 ° C) 2% de baixo ponto de fusão de agarose-se através da agulha. </li><li> Coloque a extremidade do tubo para a incisão da traqueia e lentamente injectar a agarose para dentro dos pulmões. Sem mover a agulha ou seringa, a seringa fita adesiva à base de poliestireno para assegurar que a agulha permanece na traqueia. NOTA: Após a injeção, os pulmões serão maiores e inflado dentro do peito. Os lobos direito expandir primeiro, depois o lobo esquerdo. Se apenas um lóbulo expande, a agulha foi inserida muito profundamente (passado o brônquio), e será necessário retirá-lo um pouco antes de continuar. Esta parte doprocedimento precisa ser feito de forma relativamente rápida, antes da agarose começa a solidificar. </li><li> Colocar o rato, com a base e a seringa ainda inserido na traqueia, num quarto frio ou um refrigerador por pelo menos 10 min. Se necessário, o animal pode ser mantido lá por várias horas, mesmo se proceder à migração de células de imagem por microscopia de vídeo. </li><li> Uma vez que o rato é frio, cuidadosamente excisar os pulmões inflado-agarose com uma tesoura, e colocá-los num prato 3 cm, com PBS gelado. Manter em gelo. </li><li> Escolha do lóbulo desejado para corte de tecidos (por exemplo, o lobo superior direito). Certifique-se a parte interior do pulmão (onde ele se conecta a traqueia) está virado para baixo no prato. NOTA: O lóbulo usada e a sua orientação no êmbolo irá determinar o tamanho de vasos e vias aéreas que serão visíveis. A orientação aqui descrita é ideal para a visualização de grandes vias aéreas, e parênquima. Os ratos têm um grande lóbulo esquerdo e quatro lobos menores à direita. Paraimagiologia PCLS seguinte introdução de alérgenos para os pulmões através da orofaringe ou aspiração intranasal, o lobo superior direito está normalmente em corte, em parte, porque é um tamanho conveniente, mas também porque os agentes inalados dispersar uniformemente dentro dele. No entanto, outros lobos, especialmente o lobo esquerdo, também pode ser estudado. Ao comparar estirpes de ratinho ou tratamentos, é importante para comparar o mesmo lobo. </li></ol> 2. Lung Slicing NOTA: fazer fatias utilizando um cortador de automatizado, de metal arrefecimento bloco, e êmbolo da seringa metálica, de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> Colocar uma pequena gota de todos os fins, não-funcionamento supercola gel sobre o êmbolo e espalhar a cola em um movimento circular, tendo o cuidado de não permitir que a cola de contacto com os lados da seringa de metal. Se a cola toca os lados da seringa, que vai colar a seringa e o êmbolo juntos. </li><li> Imediatamente depois de cobrir o êmbolo com cola, o agarrar suavementelóbulo excisado com uma pinça com o lado da traqueia para baixo, DAB-lo sobre um tecido para remover o excesso de líquido, e cuidadosamente colocá-lo na parte superior do êmbolo. Aparar qualquer tecido extra que se estende para além do bordo do êmbolo. </li><li> Mover o êmbolo para baixo de modo que os lados da seringa de metal, e mover-se ao longo do tecido, criando um poço com o pulmão colado na parte inferior, não mais do que alguns centímetros de profundidade. Fita em torno do fundo da seringa de metal para manter esta posição no lugar. </li><li> Cuidadosamente verter 2% de agarose de baixa de fusão a 40 ° C no poço de modo que apenas cobre a parte superior do lóbulo. </li><li> Cercar a seringa de metal, com o bloco de arrefecimento arrefecido com gelo e arrefecer o lóbulo e agarose para 1-2 min. NOTA: Um arrefecimento de tempo mais curto do que a agarose em torno do tecido poderia conduzir à desintegração da agarose durante o corte, o que pode resultar num corte PCLS desigualmente. </li><li> Carregar a seringa espécime para o fatiador automatizado e encher o tanque tampão com PBS gelado. Alinhe a<html> a etapa de accionamento do motor, com a seringa de amostra e remover o pedaço de fita adesiva a partir do fundo. Rode o interruptor para a posição de avanço rápido (FF) até que a unidade de motor passo apenas toca a parte de trás do êmbolo. </li><li> Alinhar a lâmina fresco com a seringa espécime. Conjunto espessura do tecido, contínua / única fatia, oscilação e velocidade no fatiador. Por exemplo, a espessura do tecido: 150? M, de corte contínua (cont.), Oscilação: 9, e a velocidade: 3 - 4. Pressione início. As configurações acima necessitar de ser ajustada com as especificações slicer automatizados específicos. </li><li> Usando uma espátula fina ou pincel, recolher o PCLS um de cada vez enquanto caem para o tanque tampão e colocá-los em uma placa de 24 pos contendo PBS gelado. NOTA: É importante manter as fatias, a fim de manter a consistência entre os experimentos. Embora cada pulmão é diferente, dependendo da idade, sexo e peso, a 10 de fatia, por exemplo, geralmente origina similarmente dimensionados vias aéreas. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 3. Coloração de anticorpos <ol><li> Conceber um painel de anticorpos marcados por fluorescência com base no tipo de cula de interesse, tendo em conta o potencial sobreposição espectral fluorescente e as capacidades de detecção do microscópio. NOTA: Como um exemplo, um painel para a detecção subconjunto de DC é como se segue: CD11c / alfa X integrina - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitação: 405 nm, pico de emissão: 605 nm), CD324 / E-caderina - Alexa 488 (AF488 ) (Excitação: 488 nm, do pico de emissão: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Ficoeritrina (PE) (Excitação: 561 nm, do pico de emissão: 578 nm), CD103 / alfa E integrina - aloficocianina (APC) (Excitação: 633 nm , do pico de emissão: 660 nm). Fluorescência ferramentas espectador espectrais (ver Lista de Materiais) são úteis para projetar painéis. </li><li> Realizar uma mistura de anticorpos que contêm os anticorpos desejados. <ol><li> Para imagiologia PCLS estático, adicionar 800 de tamp de colorao, 100 uL Fc blocker, 50 uL de soro normal de rato, e 50 uL de soro normal de rato a uma mL microcentrifu 1,5gação tubo para um volume total de 1 mL. Para imagem de células vivas, utilizar 800 uL de meio de Leibovitz (1x) contendo 10% de FBS (Leibovitz-10) em vez de tampão de coloração. </li><li> Adicionar anticorpos para ajustar uma concentração final desejada de cada anticorpo. Transferir a solução de anticorpo a um prato de 3 centímetros, e manter-se no escuro até estar pronto para usar. NOTA: As concentrações finais têm de ser optimizada para cada indivíduo anticorpo (geralmente 1-5 ug / ml). </li></ol></li><li> Escolher um PCLS com uma área anatómica de interesse, tais como grandes vias respiratórias ou periferia do pulmão, e colocar no prato 3-cm contendo uma solução de anticorpo mL. </li><li> PCLS mancha no escuro, em gelo, de balanço lentamente durante 30 ou 60 min. </li><li> Para imagens PCLS estático, vá para a seção 4. Para imagens de células vivas, avance para a secção 5. </li></ol> 4. estática de imagem de PCLS <ol><li> Após 60 min de incubação de PCLS com anticorpos, remover a solução de anticorpo a partir do prato e enxaguar tque corta duas vezes com 1 mL de PBS gelado. </li><li> Pipetar 50 mL de PBS para um 3 cm rodada prato de vidro de fundo. Usando uma espátula ou pincel, transferir os PCLS coradas para a gota, manipulando suavemente a fatia até que seja plana e se espalhar. Remover o PBS com uma pipeta. A fatia deve situar-se o mais plano possível. Os procedimentos acima referidos necessitam de ser realizadas rapidamente para evitar a fotodegradação. </li><li> Colocar uma gota de meio de montagem à temperatura ambiente para a fatia e suavemente gota uma lamela de vidro para dentro do poço da placa. Manter PCLS no escuro a 4 ° C durante até uma hora antes de imagem. </li><li> Ao visualizar em um microscópio confocal, use um objetivo 20X (ver Lista de Materiais). Use a ferramenta &quot;telha&quot; para localizar e marcar as bordas do tecido na configuração &quot;casco convexo&quot;. Isso ajudará a reduzir o tempo da varredura telha. </li><li> Durante o ajuste do intervalo z-pilha, verificar em várias áreas da fatia, especialmente ao longo das extremidades, que as gamas conjuntosão adequados. NOTA: O z-range provavelmente terá de ser maior do que a espessura do tecido em si, porque é muito difícil obter o tecido para colocar completamente plana. Por exemplo, com um PCLS espessura de 150 um, na gama de z-pilha vai provavelmente precisar de ser ajustada para 200-250? M para acomodar obstáculos e curvas no fatia. Dependendo do intervalo de z-pilha e o tamanho do tecido, cada varrimento de pulmão total levará entre 7-12 h com uma objectiva 20X. Cada pulmão é único e as definições devem ser ajustadas para cada experimento. </li></ol> 5. Imagens de células vivas de PCLS <ol><li> Após 30 min de incubação de PCLS com anticorpos, remover a solução de anticorpo a partir do prato e enxaguar as fatias duas vezes com 1 ml de solução fria Leibovitz-10. </li><li> Pipetar 50 mL fresco Leibovitz-10 em um slot de uma lamela câmaras (8 slots). Usar uma espátula para transferir os PCLS para a forma, manipulando-a suavemente até que a fatia é plana e se espalhar. Os procedimentos acima referidosprecisam ser realizadas rapidamente para evitar a fotodegradação. </li><li> Remover o meio 50 ul usando uma pipeta. A fatia é para ser deitada tão plana quanto possível. NOTA: É aceitável, se as bordas da fatia são viradas para cima verticalmente contra a parede da câmara. Além disso, se disponível, um peso de metal platina pode ser utilizado para o ancorar a fatia antes de prosseguir para o próximo passo. Ver a Lista de Materiais ligado para um exemplo de fio de platina que pode ser cortado e dobrado em pequenos pesos. </li><li> Numa 4 ° C quarto frio, misturar 100 ul de crescimento reduzida-fator, fenol matriz extracelular livre de vermelho com 100 uL Leibovitz-10. Utilize pontas de pipeta pré-resfriada para isso, ou a matriz extracelular vai solidificar na ponta. NOTA: O rácio da matriz e média (1: 1) cria um gel suficientemente denso para manter os PCLS para baixo em condições de cultura de tecidos. </li><li> Pipeta suavemente a matriz para misturar, e pipeta com cuidado em cima dos PCLS, certificando-se que o gel vai em cima da lung de fatia, e que a fatia não flutuar no topo do gel. O gel deve funcionar como um peso, ancorando as PCLS para baixo para o fundo da placa. </li><li> transferir cuidadosamente as câmaras lamela para uma incubadora a 37 ° C e deixar a matriz para solidificar ~ 5 min. </li><li> Transferir todo o lamela septadas para a fase pré-aquecido de um microscópio confocal. Manter a câmara a 37 ° C ao longo de imagiologia. Fornecimento de CO 2 não é necessário durante a incubação de células quando se utiliza meio de Leibovitz. </li><li> Definir o intervalo de gama-z pilha e telha com base no intervalo desejado entre os quadros. Ao visualizar em um microscópio confocal, use um objetivo 20X (ver Lista de Materiais). Utilizar a ferramenta &quot;telha&quot; para denotar a área de interesse no tecido, usando a configuração de &quot;rede&quot; centrado (por exemplo, uma grade de 2x2 centrado). </li><li> Durante o ajuste do intervalo z-pilha, verificar em várias áreas da fatia que os intervalos definidos são adequados. NOTA: O zrange provável será igual à espessura do tecido. Cada pulmão é único e as definições devem ser ajustadas para cada experimento. telhas 2x2 e 10 z-pilhas irá geralmente resultar em ~ um quadro / 2 min. Assegurar a função de auto-foco é activado antes de iniciar o experimento para minimizar XY e Z-tração durante o período de imagem. </li></ol>

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Os autores não têm qualquer conflito de interesses a declarar.

O protocolo aqui descrito foi originalmente desenvolvido para visualizar os locais de dois subconjuntos de CDCs dentro do pulmão. No entanto, este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar muitos tipos de células diferentes, mantendo ao mesmo tempo a viabilidade celular e a arquitectura tridimensional do pulmão. A última característica é uma vantagem importante em relação aos sistemas de cultura de células e facilita a identificação de tipos de células raras. O método baseia-se na geração de PCLS do pulmão, e de uma combinação adequada de anticorpos para identificar tipos específicos de células, enquanto minimiza a coloração de fundo. Em grande medida, este é um exercício empírico porque os anticorpos que funcionam bem em outras aplicações, incluindo citometria de fluxo, não necessariamente funcionam bem para a coloração PCLS. Já fizemos progressos consideráveis ​​a este respeito, mas os investigadores que desejam estudar os tipos de células não tratadas aqui pode ter que testar diferentes anticorpos e otimizar fluorocromos e concentrações. </p&gt; Usando o protocolo aqui descrito, verificou-se que CD103 + CDCs e CD11b CDCs hi residir em localizações distintas no pulmão. No estado estacionário, CD103 + CDCs foram detectados em torno das vias aéreas e na região subpleural, enquanto que CD11b CDCs hi foram encontrados principalmente no parênquima. Embora o protocolo aqui descrito não é adequado para a coloração de moléculas intracelulares, que é útil para marcadores de superfície celular de imagem, bem como moléculas de secreção. Assim, nós fomos capazes de detectar o quimiocinas, CCL21 e CCL19, em PCLS (dados não mostrados). Se os sinais fluorescentes fracos única são vistos usando anticorpos primários, é possível a utilização de anticorpos secundários para amplificar os sinais. Um desafio importante na condução da célula de vídeo de imagens ao vivo de PCLS era suficientemente para fixar o tecido no meio de cultura para evitar a significativa XY e Z-tração durante o período de microscopia de 4 h. Para resolver isso, nós experimentamoscom diferentes relações de meio de Leibovitz a matriz extracelular, que é sólido à temperatura ambiente, e uma determinada proporção de 1: 1 mantido, de uma estrutura 3D estável com a viabilidade celular. Durante o processamento pós-imagem, que também utilizada uma série de ImageJ plug-ins, chamado TurboReg e StackReg que eliminam qualquer xy incidental ou z-deslocamento adicional (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx? ID = 18226). Usando a ferramenta de auto-foco do microscópio confocal, a região de interesse foi mantido em foco, especialmente no z-range, durante todo o período de digitalização. Outro desafio durante a imagens de células vivas de PCLS estava utilizando a digitalização azulejo, z-stack, séries temporais, e as funções de focagem automática do microscópio. Para minimizar o tempo entre cada quadro, um equilíbrio deve ser atingido entre o tempo gasto a digitalização de cada telha. Para otimizar o tempo de verificação em cada projeto de pesquisa, o número de z-stack, azulejos, e velocidades de digitalização precisam ser ajustadas.

Após a inalação de estímulos pró-inflamatórios, tais como lipopolissacáridos (LPS), há um movimento coordenado de células imunes para, dentro de, e do pulmão. Por exemplo, os neutrófilos são rapidamente recrutados para o parênquima pulmonar e das vias aéreas. Além disso, algumas células apresentadoras de antigénios profissionais conhecidos como células dendríticas convencionais (CDCs) sofrem um padrão de migração relativamente complexo 1, 2. CDCs podem ser identificados por citometria de fluxo, com base, em parte, a sua exposição do marcador de superfície, CD11c. Subconjuntos distintos de DCs pode ser distinguida pela expressão de superfície diferencial de CD103 e CD11b 3. Após a aquisição de antigénio inalado, algumas CDCs sair do pulmão e migram através dos vasos linfáticos de drenagem pulmonares Nódulos Linfáticos (LNs) onde apresentam péptidos de antigénio-específica de células T 4. Este é um evento precoce crítico na iniciação de r imune adaptativaesponses. Por razões desconhecidas, no entanto, nem todos os CDCs que adquirem antígenos inalados deixar o pulmão, e muitas destas células permanecem nesse órgão durante vários meses 5, 6. Esta observação pode ser parcialmente explicado pela ascendência desenvolvimento destas células porque CD11c + células sem o receptor de quimiocina, CCR7 derivadas de monitos, são incapazes de migrar para LNs regionais 7, 8. Parece provável que o potencial de migração de CDCs também é determinado, pelo menos em parte, pela sua posição anatômica dentro do pulmão. No entanto, a localização exacta destas diferentes populações de CDCs no pulmão não está completamente caracterizada. Um melhor conhecimento de localização de células imunitárias no interior do pulmão, e das moléculas que dirigem-lo, é necessário para uma melhor compreensão de como o sistema imune do pulmão torna-se activado. PCLS estão sendo cada vez maiorly usado como uma abordagem ex vivo para visualizar posicionamento celular e interacções célula-célula, enquanto mantém a integridade estrutural da arquitectura pulmonar 9, 10. PCLS têm sido usadas para estudar os pulmões de muitas espécies, incluindo ratos, gado, macacos, ovelhas, cavalos e seres humanos 11. Uma importante vantagem desta técnica é que cerca de 20 fatias pode ser preparado a partir de um único lóbulo do pulmão do rato, reduzindo assim o número de animais necessários para as experiências individuais. Virtualmente todos os tipos de células imunitárias, incluindo as DCs, macrófagos, neutrófilos e células T, estão presentes em PCLS e manter as suas estruturas normais. PCLS também pode ser utilizado para estudar a sinalização de cálcio e a contractilidade de células das vias respiratórias e do músculo liso após o tratamento com 12 ou acetilcolina metacolina 13. Nesta abordagem, apenas uma pequena porção do pulmão é umalyzed microscopicamente, mas um estudo relatou que as medições de contracção das vias aéreas em PCLS variar apenas cerca de 10% a partir de fatia a fatia, e esta variação é comparável à observada usando testes da função pulmonar em animais intactos 14. Outros investigadores têm utilizado PCLS como uma abordagem ex vivo para estudar alterações na expressão de citoquinas e marcadores de superfície celular após incubação com LPS 15. PCLS também têm sido utilizados num modelo ex vivo de vasoconstrição pulmonar hipóxica em pequenas artérias intra-acinares. Estes vasos estão localizados na parte do pulmão que não pode ser alcançado utilizando outros processos, incluindo gravações de segmentos ou análise de vasos arteriais subpleurais 16 dissecados. O nosso laboratório tem usado principalmente PCLS para visualizar a localização de células imunitárias em tecidos de pulmão vivo no estado estacionário e na sequência de um estímulo inflamatório in vivo. Os procedimentos que desenvolvemos para isso são as seguintes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1-TdTomato transgenic mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>018128</td>
			<td>B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>004194, 006617</td>
			<td>B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rag1 knock-out mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>002216</td>
			<td>B6.129S7-Rag1tm1Mom/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin, Low Endo, Purified</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>L2630-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td>427421</td>
			<td>0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3112-125</td>
			<td>2% solution dissolved in PBS at 70 &#176;C and held at 40 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome VF-300</td>
			<td>Precisionary Instruments, Inc.</td>
			<td>VF-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td>Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue All Purpose Instant Gel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500033-484</td>
			<td>Commonly available for $3/tube in local drugstores&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>012-000-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Mouse Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>015-000-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer</td>
			<td>Made in House</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)</td>
			<td>Made in House</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b eFluor 450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0112-80</td>
			<td>Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101237</td>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c Phycoerythrin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0114-82</td>
			<td>PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c Allophycocyanin</td>
			<td>BD Phamingen</td>
			<td>550261</td>
			<td>APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD88 Phycoerythrin</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>135806</td>
			<td>PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD103 Allophycocyanin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1031-82</td>
			<td>Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0902-82</td>
			<td>Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-1721-82</td>
			<td>Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564188</td>
			<td>BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>53-3249-82</td>
			<td>Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>51-3249-82</td>
			<td>Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass</td>
			<td>MatTek Corperation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>155411PK&#160;</td>
			<td>Pack of 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness</td>
			<td>MatTek Corperation</td>
			<td>PCS-1.5-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bare Platinum Wire</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PTP201</td>
			<td>0.020&#34; (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an &#34;L&#34; shape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Keep at 4 &#176;C, warm to room tempterature before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420650-9901-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells

A inalação de alérgenos e agentes patogénicos elicia várias alterações em uma variedade de tipos de células imunitárias no pulmão. Citometria de fluxo é uma técnica poderosa para a análise quantitativa das proteínas da superfície celular em células do sistema imunológico, mas não fornece nenhuma informação sobre os padrões de localização e de migração destas células dentro do pulmão. Do mesmo modo, ensaios de quimiotaxia pode ser realizada para estudar o potencial das células para responder a factores quimiotáticos in vitro, mas estes ensaios não reproduzem o ambiente complexo do pulmão intacta. Em contraste com estas técnicas acima mencionadas, a localização de tipos de células individuais dentro do pulmão pode ser facilmente visualizado através da geração de precisão de corte fatias de pulmão (PCLS), manchando-os com anticorpos comercialmente disponíveis, marcados por fluorescência, e visualizando as secções por microscopia confocal. PCLS pode ser utilizado tanto para viver e fixa o tecido pulmonar, e as fatias pode abranger áreas tão grandes como uma secção transversal de um lobo inteiro. Nós temos utilizado este protocolo para visualizar com sucesso o local de uma ampla variedade de tipos de células no pulmão, incluindo tipos distintos de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T e células B, assim como células estruturais tais como linfático, endotelial e células epiteliais. A habilidade de visualizar as interacções celulares, tais como aquelas entre as células dendríticas e as células T, no tecido pulmonar vivo, tridimensional, pode revelar como células se movem no interior do pulmão e interagir uns com os outros no estado estacionário e durante a inflamação. Assim, quando usado em combinação com outros procedimentos, tais como citometria de fluxo e PCR quantitativa, PCLS pode contribuir para uma compreensão abrangente de eventos celulares que fundamentam as doenças alérgicas e inflamatórias do pulmão.

Para identificar a localização de dois subconjuntos de DC, CD11b CDCs hi e CD103 + CDCs, PCLS de ratinhos C57BL / 6 foram cortadas e coradas com anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para CD11c, CD88, CD103, CD324 e (E-caderina). Os anticorpos para as células epiteliais das vias respiratórias, CD324 mancha e CD88 é apresentado sobre os macrófagos e neutrófilos, mas não CDCs 8. Isto permitiu-nos distinguir CDCs de CD11c + macrófagos, e de observar a relação espacial de cada tipo celular para as vias aéreas (Figura 1). Descobrimos que CD11b CDCs hi localizar no parênquima, enquanto CD103 + CDCs residem principalmente em torno das vias aéreas e da área subpleural. Embora CD103 + CDCs foram facilmente detectadas através de coloração directa de CD103 superfície celular nesta experiência, a detecção de CD11b oi CDCs baseou-se na ausência de CD88 e CD103 coloração. Para identificar diretamente CD11boi CDCs, primeiro tentaram PCLS mancha usando um mAb anti-CD11b (clone M1 / 70), que é amplamente usado em imuno-histoquímica e citometria de fluxo. No entanto, este mAb tinha um fundo elevado e baixa especificidade neste pedido, independentemente de qual fluorocromos foram conjugados com o mAb (Figura 2A, e dados não mostrados). Em contraste, os anticorpos para CD172a (SIRP1α) corado CD11b oi CDCs 18, mas as células não estruturais ou CD103 + CDCs (Figura 2B, e dados não mostrados). Por conta própria, anticorpos para CD172a não podiam discriminar entre CDCs e monócitos ou macrófagos. No entanto, por co-coloração com anticorpos contra CD88 e CD172a, fomos capazes de distinguir os macrófagos alveolares (CD172a - CD88 +) a partir de macrófagos intersticiais (CD172a + CD88 +), e CD11b CDCs hi (CD172a + CD88 -), e demonstram que as últimas células preferencialmente localizar noparênquima, não a área sub-epitelial (Figura 2C - F), em acordo com os nossos resultados obtidos por coloração indirecta destas células. Estudo de migração intra-tecido de leucócitos requer a visualização de células estruturais, incluindo os dos vasos linfáticos, através do qual o tráfego de DC a partir de tecidos periféricos para LNs regionais. Na pele e linfonodos, vasos linfáticos são muitas vezes identificados utilizando mAbs para LYVE-1 ou podoplanina. No entanto, verificou-se que em PCLS, os mAbs para LYVE-1 e podoplanina manchar uma variedade de outros tipos de culas, incluindo endotio vascular e epitélio alveolar (dados não mostrados). Estes mAbs são, portanto, de utilização prática limitada para a identificação de vasos linfáticos especificamente em PCLS. No entanto, os mAbs para CD90.2 (Thy1.2), um marcador de célula T conhecido, estruturas linfáticas marcados, como se mostra anteriormente em outros tecidos 19, 20 (Figuras 3A, B </strong&gt;), Assim como TdTomato proteína fluorescente codificada por um transgene sob o controlo transcricional do promotor Prox1 21 (Figura 3A, C). PROX1 é um factor de transcrição mestre que é necessário para a linfangiogénese 22. Prox1 TdTomato ratinhos transgénicos que exibem vasos linfáticos fluorescentes brilhantemente nos pulmões e outros tecidos tais como o fígado, lentes, o giro dentado e neuroendócrinos células da medula supra-renal 21. Com efeito, estes dois métodos de marcação deu padrões de coloração de sobreposição (Figura 3D). Usando estas abordagens de rotulagem, fomos capazes de determinar que CD103 + CDCs estavam presentes em várias áreas anatómicas, incluindo CD324-expressando epitélio das vias respiratórias, os vasos linfáticos, e a área subpleural (Figura 3A, E). Além de imagem estática, movimento celular e celular para cell interacções podem ser gravados utilizando imagem de células vivas de PCLS (Filme 1). PCLS foram recentemente preparada a partir de ratinhos que tinham recebido injeces de células AT-II T-expressam GFP e instilao de OVA e LPS, coradas com mAbs contra CD103 (vermelho) e o epitélio das vias respiratórias (CD324, azul), e foram fotografadas para controlar a movimento de células CD103 + CDCs e T 16 h após a OVA / LPS instilação. Ao longo do vídeo (4 h), o movimento dinâmico de CD103 + DCs (vermelho) e as células T específicas de OVA adoptivamente transferidos (verde) e da sua interacção são claramente visíveis (Filme 1). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55465/55465fig1.jpg" /> Figura 1. Locais anatómicas distintas de CDC Subconjuntos como revelado por PCLS de coloração e microscopia confocal. A) PCLS inteiro de um C57BL / 6 não tratado de pulmão de rato corados com anticorpos diferentes. A cor da<html> cada molécula é indicado pela sua cor da fonte (superior direito). Coloração individual e combinatória dá as seguintes cores para tipos de células de interesse: CD103 + CDCs (CD103 + CD11c + CD88 -; brancas), CD11b oi CDCs (CD11c + CD103 - CD88 -; vermelho), macrófagos (CD11c + CD88 +; amarelo ), neutrófilos (CD11c - CD88 +; verde) e células epiteliais das vias respiratórias (CD324 +; azul). B - D) Maior ampliação das inserções em A. B) CD11b CDCs hi localizar no parênquima. C) CD103 + CDCs redor das vias aéreas. D) CD103 + CDCs sob a pleura visceral. As barras brancas representam 50 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55465/55465fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> tenda&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55465/55465fig2.jpg" /> Figura 2. Coloração de DCs e macragos. A) Coloração de PCLS com anticorpos contra CD11b (azul) dá um fundo elevado no PCLS. B) Os anticorpos para CD172a (verde) tem um fundo relativamente baixa em PCLS e maior especificidade para culas CD11b +. C) PCLS Total de ratinhos C57BL / 6 coradas com mAbs cuja cor é indicado pela cor da fonte (superior direito). CD11c (vermelho), CD88 (ciano), CD172a (verde) e CD324 (azul). CD11b CDCs hi (CD11c + CD88 - CD172a +; amarelo), os macrófagos alveolares (CD11c + CD88 + CD172a -;-de-rosa), macrófagos intersticiais (CD11c + CD88 + CD172a +; branco), neutrófilos (CD11c - CD88 +; ciano) e das vias respiratórias (CD324 +; azul). D - F) Maior ampliação das inserçõesdescrito em C. D) Sub-pleural área. E) Sub-epitelial área. F) interstício. macrófagos intersticiais localizar no parênquima, e macrófagos alveolares estão em alvéolos. barras brancas não marcados denotar 50. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55465/55465fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55465/55465fig3.jpg" /> Figura 3. marcação de células estruturais no PCLS. A) PCLS inteiros preparados a partir de Prox1 tdTomato rato, e coradas com mAb para CD90.2 (verde), CD103 (branco) e CD324 (azul). células que expressam Prox1 (vermelhas) são geneticamente marcado com TdTomato sob a regulação do promotor Prox1 (Prox1-TdTomato). B - E) Maior ampliação da inserção no <strong&gt; A. B) CD90.2 (verde), C) Prox1-TdTomato (vermelho), e D) combinação de CD90.2 e Prox1-TdTomato. E) Combinação de CD90.2 (verde), CD103 (vermelho) e CD324 (azul). barras brancas não marcados denotar 50. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55465/55465fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="filme 1" src="/files/ftp_upload/55465/55465vid1.jpg" /> Filme 1. T células interagem com CD103 + CDCs no pulmão. Imagem de células vivas de CD103 + CDCs (vermelho) que interagem com células T (verde). As células T CD4 + isoladas a partir de murganhos GFP OVA específicas-OT-II Nur77 foram estimulados com DC esplénicas e OVA in vitro, e adoptivamente transferidos para Rag - / - de ratinho. wit 2 h mais tarde, o rato receptor foi tratadah OVA / LPS instilação para as vias respiratórias. 16 h após o tratamento OVA / LPS, PCLS foram feitas, coradas e fotografada durante 4 h a 37 ° C. a gravação de imagem (min) Tempo é mostrado. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55465/55465JoVE_Movie_1.avi" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Direito-clique para baixar).</a>

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Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Descreve-se um método para a geração de corte de precisão pulmonar fatias (PCLS) e imunocoloração-los para visualizar a localização de vários tipos de células imunitárias no pulmão. Nosso protocolo pode ser estendido para visualizar a localização e função de muitos tipos diferentes de células sob uma variedade de condições.

Rato pulmão Slices para Visualize células vivas pulmonar dendríticas precisão de corte

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

precision-cut-mouse-lung-slices-to-visualize-live-pulmonary-dendritic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K visualizações.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH.  Descreve-se um método para a geração de corte de precisão pulmonar fatias (PCLS) e imunocoloração-los para visualizar a localização de vários tipos de células imunitárias no pulmão. Nosso protocolo pode ser estendido para visualizar a localização e função de muitos tipos diferentes de células sob uma variedade de condições. 

Vídeo: Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Imunologia e Infecção

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Análise da maturação das células dendríticas e migração pulmonar durante a inflamação alérgica das vias aéreas

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

Sistólica do ventrículo direito Medição de Pressão em combinação com colheita de amostras de tecido pulmonar e imunológica em ratos

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Células Humanas Lung dendríticas: distribuição espacial e fenotípica Identificação em endobrônquica Biópsias imunohistoquímica e citometria de fluxo

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...