This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).

A biópsia do músculo quadriceps é retirado de um porco anestesiado, a partir do qual as mitocôndrias são isoladas por centrifugação diferencial. O porco é usado depois para uma outra experiência. O estudo é realizado de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório e com a aprovação do Comitê de Cuidados Animal do cantão Berna, Suíça. 1. A homogeneização músculo esquelético e mitocondrial Isolamento <ol><li> Excise 5-10 espécime g músculo quadríceps de um porco anestesiado. No presente ensaio, utilizam porcina músculo esquelético. Este protocolo pode também ser utilizada para isolar as mitocôndrias a partir de outras espécies (por exemplo, ratazanas, ratos, humanos, etc.). NOTA: Este passo é realizado por um médico especialista com experiência em cirurgia. <ol><li> sedar porcos com cetamina intramuscular (20 mg / kg) e xilazina (2 mg / kg), antes da anestesia é induzida com intramidazolam venoso (0,5 mg / kg, mais atropina 0,02 mg / kg). Manter a anestesia com infusões contínuas intravenosas de propofol (4-8 mg / kg por hora) e fentanilo (30 ug / kg por hora) durante a cirurgia. </li></ol></li><li> Mergulhar imediatamente a amostra de tecido em um copo contendo 20 ml de tampão de isolamento arrefecido em gelo mitocondrial (Tabela 1). NOTA: Os tampões utilizados durante a homogeneização e centrifugação deve ser frio e têm um pH fisiológico relevante com uma força iónica e osmótica compatível com citosol. </li><li> Pesa-se a amostra de tecido no béquer tarado numa balança analítica. Tarar a balança com o copo contendo 20 ml de tampão de isolamento. </li><li> Colocar o copo em um balde de gelo. Observação: executar todos os próximos passos para o processo de homogeneização a uma temperatura de balde de gelo e manter todos os buffers no balde de gelo. </li><li> Picar o músculo esquelético no copo (manter em gelo) em pequenos pedaços de 1-2 mm para 3-4 min usando sciss finaRUP. </li><li> Lavar o tecido moído no copo duas vezes com tampão de isolamento arrefecido em gelo (20 mL de cada passo de lavagem). </li><li> Suspende-se o tecido em 10 volumes do tampão de isolamento por peso de tecido (g), contendo 5 mg de protease / g de tecido. </li><li> Colocar o copo num banho de gelo sobre o agitador magnético e agitou-se durante 10 min. </li><li> Dilui-se a suspensão no recipiente com mais 10 volumes do tampão de isolamento por peso de tecido (g), suplementado com 0,2% (peso / volume) de albumina de soro bovino a desengordurada (BSA). </li><li> Decantar todo o tampão de isolamento completado com 0,2% de BSA e enxaguar o tecido no copo duas vezes com tampão de isolamento arrefecido em gelo suplementado com 0,2% de BSA (20 mL de cada passo de lavagem). </li><li> Ressuspender o tecido em 10 volumes de tampão de isolamento por peso de tecido (g), suplementado com 0,2% de BSA com desengordurada. </li><li> Homogeneizar o tecido com um homogeneizador de vidro semi-automático (mantido em gelo) com um pilão folgada (10 golpes). NOTA: HomogenizÊ O tecido sempre da mesma forma (o mesmo número de acidentes vasculares cerebrais, por exemplo, 10 cursos). Um maior número de acidentes vasculares cerebrais podem danificar e desacoplar as mitocôndrias. De um modo preferido, homogeneizar o tecido utilizando um homogeneizador automatizado. Manualmente (e subjetivamente) amostras de tecido homogeneizado em homogeneizadores de vidro podem produzir diferentes qualidades de mitocôndrias isoladas. </li><li> Centrifugar o tecido homogeneizado a 4 ° C durante 10 min a 10.000 x g. NOTA: Todos os passos de centrifugação são realizados em centrífugas com rotores de ângulo fixo. </li><li> Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica e ressuspender o sedimento em meio de isolamento arrefecido em gelo suplementado com BSA (10 ml / g de tecido). </li><li> Centrifugar a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 350 x g. </li><li> Reservamo-nos o sobrenadante utilizando uma pipeta sorológica e descartar o pellet (restos celulares). </li><li> Filtra-se o sobrenadante para uma proveta (mantido em gelo) por meio de duas camadas de gaze (17 fios / cm 2) para remover células debré. </li><li> Centrifugar a suspensão foi filtrada a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto no tampão de isolamento (5 mL / g de tecido) suplementado com 0,2% (peso / volume) de BSA e centrifugar a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto em tampão de lavagem (Tabela 1). Centrifugar novamente a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto em tampão de lavagem e centrifugar novamente a suspensão a 4 ° C durante 10 min a 7000 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento mitocondrial em bruto em 1,0 ml de tampão de lavagem. </li><li> Determinar a concentração de proteína da suspensão mitocondrial e manter a suspensão mitocondrial concentrado em gelo. NOTA: A concentração de proteína pode ser medido utilizando qualquer método padrão. </li><li> Somente o interiorpara Respirometria ensaios, ressuspender a suspensão mitocondrial no buffer de respiração para uma concentração final de 0,4 mg de proteína mitocondrial / mL. </li></ol> 2. High-resolution Respirometria <ol><li> Pipetar 2,1 mL de tampão de respiração (Tabela 1) 16 para dentro de uma câmara de oxygraph de alta resolução e agita-se o tampão continuamente usando uma barra de agitação magnética presente na câmara (700 rpm) a 37 ° C durante 1 h até que um sinal de fluxo de oxigénio estável de o sensor de oxigénio é obtido polarográfica. NOTA: eletrodos de oxigênio Polarográfico dentro de cada câmara oxygraph medir a concentração de oxigênio e calcular o consumo de oxigênio (fluxo) dentro de cada câmara. A concentração de oxigénio e as taxas de consumo de oxigênio (de fluxo) são exibidos em tempo real on-line em um computador utilizando o software para aquisição e análise de dados. Além disso, a fim de garantir resultados precisos e fiáveis, oxigénio instrumental correcção de fundo deve serrealizada de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: com exactidão 2,1 ml de tampão de respiração é adicionado para dentro da câmara para a calibração de um volume de câmara de final de 2,0 ml depois de fechar as rolhas. </li><li> Executar uma calibração de ar do sensor de oxigénio polarográfico de acordo com os protocolos do fabricante 17. Nota: Durante a calibração do ar, com uma fase de gás presente, a concentração de oxigénio meios irá equilibrar na ordem de 15-20 minutos. Dependendo da temperatura, a pressão barométrica e a solubilidade da concentração dos meios -oxygen pode ser calculada. </li><li> Após a calibração de ar, aspirar o meio da respiração da câmara oxygraph e adicionar 2,1 ml de suspensão mitocondrial isolado (0,4 mg de proteína mitocondrial / mL) do passo 1,24 para uma câmara do oxygraph. NOTA: O volume de tampão respiração depende do instrumento criado e fabricante. Para respirometria de alta resolução, os 2,1 ml de bu respiraçãoffer é adicionado para dentro da câmara para a calibração de um volume de câmara de final de 2,0 ml depois de fechar as rolhas. </li><li> Fechar a câmara de oxygraph por inserção da rolha. </li><li> Agita-se a suspensão mitocondrial continuamente usando uma barra magnética de agitação presente na câmara (700 rpm) a 37 ° C e ficha respiração celular na linha de base para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. NOTA: A concentração de oxigênio e sinal de fluxo de oxigênio são exibidos em tempo real on-line em um computador utilizando o software para aquisição e análise de dados 17. </li><li> Em seguida, injectar substratos e inibidores para a respiração mitocondrial através dos orifícios de injecção de titânio das rolhas, utilizando os seguintes protocolos padrão. </li></ol> 3. Complexo Respiração-I dependente <ol><li> Prepara-se uma câmara de oxygraph contendo o isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nos passos e 2,1-2,5esperar por um sinal estável. </li><li> Injectar 12,5 mL de 0,8 M malato (5 mM de concentração final) e 10 uL de 2 M de glutamato (10 mM de concentração final) para a câmara de oxygraph contendo suspensão mitocondrial isolado (0,4 mg / mL) através da porta de injecção de titânio da rolha câmara e gravar respiração celular para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. NOTA: Todas as injeções nas seguintes etapas são realizadas através dos portos de injeção de titânio de rolhas usando seringas. </li><li> Injectar 10 mL de 0,05 M de ADP (0,25 mM) para a câmara de oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha câmara e a respiração mitocondrial gravar até que o sinal aumenta o fluxo de oxigénio, em seguida, diminui e estabiliza (3-5 min). NOTA: O planalto da respiração após a adição de ADP indica que a concentração de ADP foi elevada e saturação. Dependendo da quantidade de mitocôndrias utilizados durante a respiração, concentração de ADP deve ser tituladapara um consumo de oxigênio estado 3 estável (respiração máxima). A adição de ADP para a suspensão mitocondrial irá induzir um aumento no consumo de oxigénio e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar (estado 3 da respiração). Após o ADP é consumido, o sinal de fluxo de oxigénio irá diminuir (estado 4 da respiração). </li></ol> 4. Respiração II-dependente Complexo <ol><li> Prepara-se uma câmara contendo oxygraph isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nas etapas 2,1-2,5 e esperar por um sinal estável. </li><li> Injectar 2 mL de rotenona 0,2 mM (0,2 uM) &#39;CUIDADO &quot;para dentro da câmara oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha de câmara usando uma seringa e gravar a respiração celular para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. NOTA: rotenona é um veneno perigosa e pode ter um impacto significativo na saúde humana. </li><li> Injectar 20 mL de 1 M de succinato (10 mM) em CH oxygraphâmbar e registro respiração mitocondrial para 3-5 min até que um sinal de fluxo de oxigênio estável seja alcançado. </li><li> Injectar 10 mL de 0,05 M de ADP (0,25 mM) para a câmara de oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha câmara e gravar até que a respiração celular sinal aumenta o fluxo de oxigénio, estabiliza, em seguida, diminui e estabiliza (3-5 min). NOTA: A adição de ADP para a suspensão mitocondrial irá induzir um aumento no consumo de oxigénio e o sinal de fluxo de oxigénio irá aumentar (estado 3 da respiração). Após o ADP é consumido, o sinal de fluxo de oxigénio irá diminuir (estado 4 da respiração). </li></ol> 5. Respiração Complexo-dependentes IV <ol><li> Preparar uma câmara de oxygraph contendo isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nos passos 2.1 a 2.5 do protocolo e esperar por um sinal estável. </li><li> Em seguida, injectam 2,5 mL de ascorbato 0,8 mM (1 mM). Imediatamente depois injectar 2,5 mL de 0,2H TMPD (0,25 mM) e 10 uL de 0,05 M de ADP (0,25 mM) para dentro da câmara e oxygraph ficha respiração celular até que os sinais de fluxo de oxigénio aumenta e estabiliza (3-5 min). </li><li> Finalmente injectar 10 mL de azida de sódio 1 M (5 mM) &quot;CUIDADO&quot; para dentro da câmara oxygraph e gravar a respiração celular até que as diminuições de sinal de fluxo de oxigénio e estabiliza. NOTA: A azida sódica é um veneno perigoso e pode ter um impacto significativo sobre a saúde humana. </li></ol> 6. citocromo C Teste <ol><li> Preparar uma câmara de oxygraph contendo isolado suspensão mitocondrial (0,4 mg / mL) seguindo o procedimento descrito nos passos 2.1 a 2.5 do protocolo e esperar por um sinal estável. </li><li> Injectar 12,5 mL de 0,8 M malato (5 mM de concentração final) e 10 uL de 2 M de glutamato (10 mM de concentração final) para a câmara de oxygraph contendo suspensão mitocondrial isolado (0,4 mg / mL) através da porta de injecção de titânio da rolha câmarae gravar a respiração celular para 3-5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. </li><li> Injectar 10 mL de 0,5 M de ADP (2,5 mM) para a câmara de oxygraph através da porta de injecção de titânio da rolha e câmara de registo respiração mitocondrial até sinal aumenta o fluxo de oxigénio, em seguida, diminui e estabiliza (3-5 min). </li><li> Finalmente, injectar 5 mL de 4 mM de citocromo c (10 pM) para a câmara de oxygraph e gravar a respiração celular durante 5 min, até que um sinal de fluxo de oxigénio estável é alcançada. </li></ol>

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	<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li><li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li><li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation.">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells.">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li><li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle:+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs.">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li><li>Corr&#234;a, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+in+septic+shock:+effects+on+tissue+perfusion,+organ+function,+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis.">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li><li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro.">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics. 3, (2002).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gnaiger, E., M&#233;ndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia.">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers.">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation.">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig:+a+study+using+top-down+elasticity+analysis.">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para isolar de alta qualidade, intactas e fortemente acoplados mitocôndrias do músculo esquelético através de centrifugação diferencial, que podem ser utilizadas para estudos funcionais tais como ventilometria de alta resolução. Para isolar mitocôndrias intactas e fortemente acoplados, há alguns pontos críticos a serem considerados no presente protocolo. Após a colheita do tecido esquelético, deve ser imediatamente imersas em tampão de isolamento arrefecido em gelo mitocondrial. Todos os passos de centrifugação deve ser realizado a 4 ° C e a suspensão mitocondrial deve ser mantido sempre em gelo durante o isolamento. O processo de isolamento deve ser realizado tão rapidamente quanto possível. O homogeneizado deve ser centrifugada em tubos de centrífuga limpo sem detergente. No final do processo, a suspensão deve ser mantida mitocondrial e concentrado ser diluído imediatamente antes de Respirometria. Como os dados de respirometria são expressos como pmol por segundo peR miligrama de proteína mitocondrial, é importante utilizar uma boa técnica para medir com precisão a concentração de proteína mitocondrial após o isolamento. Em alguns procedimentos de isolamento mitocondrial, pode acontecer que as mitocôndrias são desacoplada ou não consomem oxigênio corretamente usando de alta resolução respirometria. Para superar estes problemas, o tecido deve sempre ser homogeneizada na mesma forma (o mesmo número de acidentes vasculares cerebrais), utilizando o homogeneizador com o pilão folgada (passo 1.12). Aqui, nós sempre homogeneizar o tecido muscular esquelético usando um homogeneizador automatizado com 10 tacadas. Um maior número de acidentes vasculares cerebrais podem danificar e desacoplar as mitocôndrias. Manualmente (e subjetivamente) amostras de tecido homogeneizado em homogeneizadores de vidro podem produzir diferentes qualidades de mitocôndrias isoladas. Congelação das mitocôndrias também pode resultar em mitocôndrias desacoplados e deve-se certificar de que são feitas as centrifugações a 4 ° C, e não inferior a esta temperatura. A integridade mitocondrial pode ser comprometida, bem como se o pH das soluções tampão é incorrecta ou os tubos de centrifugação não são limpos. Um deve certificar-se de que os tubos de centrifugação são livres de detergente e devidamente lavados. Um dos primeiros fatores importantes a serem considerados durante o isolamento é para homogeneizar tecidos de uma forma suave. tecidos moles requerem forças mecânicas suaves aplicadas durante a homogeneização, enquanto que tecidos duros exigem forças mecânicas muito mais fortes. Buffers usados ​​durante a homogeneização e centrifugação deve ser frio e têm um pH fisiológico relevante com uma força iónica e osmótica compatível com citosol. Para tecidos duros tais como o músculo esquelético, após homogeneização mecânica, proteases tais como a tripsina pode ser adicionado para desagregar ainda mais o tecido 4, 5. Algumas das limitações de mitocôndrias isoladas, com base em dcentrifugação ifferential são: i) as mitocôndrias possivelmente danificados durante o procedimento de homogeneização e isolamento 19, ii) as grandes quantidades de amostras de tecido necessárias para o isolamento mitocondrial, iii) a possível perda e alterações em certos complexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial subunidades durante a homogeneização e centrifugação os passos 18, e iv) o aumento da produção de espécies reactivas de oxigénio durante as etapas de homogeneização e centrifugação, o que pode interferir com a função mitocondrial 18. As vantagens da homogeneização de Dounce e o método de centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias em bruto para experiências respiratórias em relação a métodos existentes, tais como a centrifugação em gradiente de densidade 20, são que o método é rápido e mitocôndrias são isoladas dentro de um curto período de tempo. Portanto experiências respiratórias pode ser realizada dentro de umh. Além disso, o processo é barato, muito eficiente e as mitocôndrias obtidos por centrifugação diferencial pode ser utilizada para ensaios de ventilometria. A investigação do consumo de oxigênio mitocondrial utilizando mitocôndrias isoladas oferece várias vantagens sobre fibras ou células permeabilizadas: nenhuma interferência significativa com proteínas citosólicas que podem interferir com a função mitocondrial e bioenergética; não há necessidade de permeabilização celular; e substratos de os complexos da cadeia respiratória mitocondrial pode ser adicionado directamente às mitocôndrias isoladas. Um dos métodos alternativos para medir músculo esquelético respiração mitocondrial é o uso permeabilizadas fibras musculares 9. Algumas das vantagens das fibras musculares permeabilizadas sobre mitocôndrias isoladas são i) nenhum passo de homogeneização mecânica é necessária e, ii) são necessárias quantidades muito pequenas de tecido (algumas mg) em ensaios ventilometria. A desvantagem de pfibra muscular ermeabilized é a difusão de oxigênio inferior para as mitocôndrias do feixe de fibras. Esta restrição de difusão requer grandes quantidades de ADP durante ensaios de respirometria. Outro método alternativo é a utilização de homogenatos de tecido integrais 22, que é um método muito rápido e não necessita de passos de centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias. A utilização de todo homogeneizado de tecido pode evitar a perda de algumas mitocôndria durante o seu isolamento, mas podem existir outros factores citosólicas presentes, que podem interferir com a análise das funções mitocondriais, tais como o consumo de oxigénio. Depois de dominar a centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias bruto para ensaios respiratórias, uma aplicação futuro é investigar as capacidades respiratórias de mitocôndrias isoladas através de técnicas emergentes, tais como a utilização de membrana externa mitocondrial anti-TOM22 (translocase de mitocondrial externa da membrana 22 homólogo) anticorpo-coupled esferas magnéticas 21.

bioenergética mitocondrial e capacidades respiratórias pode ser estudado, não só em células permeabilizadas ou fibras, mas também em mitocôndrias isoladas. No presente estudo, nós descrevemos um protocolo para isolar mitocôndrias de músculo esquelético intactas utilizando centrifugação diferencial para medições de respirometria de alta resolução. Para isolar mitocôndrias intactas para ventilometria, o tecido é homogeneizado e mitocôndrias são isoladas por um método de centrifugação diferencial convencional. O método de centrifugação diferencial baseia-se centrifugações sequenciais (em uma série de aumentar a velocidade) de homogeneizados de tecido foi introduzido pela primeira vez por Pallade e colegas de trabalho há quase 70 anos 1. O tecido é primeiro picada com uma tesoura e homogeneizada mecanicamente em um homogeneizador de vidro com um pilão folgadas. Em seguida, o homogeneizado é centrifugado a baixa velocidade e o sedimento resultante que contém o tecido intacto, celulardetritos e núcleos é descartado. Em seguida, o sobrenadante é centrifugada várias vezes a alta velocidade e a fracção enriquecida mitocondrial é recolhido. As vantagens do método de centrifugação diferencial para isolar as mitocôndrias são que: i) o método é rápido e mitocôndrias pode ser isolado dentro de 1-1,5 horas (experiências respiratórias deve ser feito tão rápido quanto possível); ii) é barato; e iii) é muito eficiente e as mitocôndrias obtidos por centrifugação diferencial são suficientemente puro para ensaios de respirometria. As desvantagens do método de centrifugação diferencial para isolar mitocôndrias são de que i) mitocôndrias podem ficar danificados e desacoplados durante a homogeneização; ii) a contaminação da mitocôndria com outros componentes celulares (poderia ser resolvido por lavagem adicional com o sedimento mitocondrial passos de centrifugação adicionais); iii) a possibilidade de selecionar diferentes subpopulações mitocondriais, por exemplo, durante centrifugações diferenciais etapas, mitochondria com menor densa pode ser excluída 7; e iv) a envolvente celular está ausente e só a respiração teórica máxima mitocondrial pode ser medido. Outro método para isolar as mitocôndrias para ensaios ventilometria é a densidade do gradiente de centrifugação 2. Nesta técnica, o extracto de tecido é colocado em camadas sobre uma solução de sacarose ou de um gradiente de Percoll (com uma densidade mais elevada na parte inferior do tubo de centrifugação) e centrifugou-se a uma determinada velocidade, fazendo com que as mitocôndrias para ser isolado a partir de outros componentes celulares de acordo com os seus densidades. Este método é frequentemente usado para isolar as mitocôndrias do cérebro com muito pouca contaminação por sinaptossomas. No entanto, as mitocôndrias isoladas de fígado de rato por centrifugação de gradiente de densidade são altamente contaminado com outros organelos celulares 3. Uma das limitações deste método é que o gradiente de sacarose presente no tubo de centrifugação pode romper tãome mitocôndrias (choque osmótico). Dependendo do tipo de tecido; existem alguns fatores importantes a considerar para o isolamento de mitocôndrias intactas por centrifugação diferencial. A primeira necessidade é para homogeneizar tecidos de uma forma suave. tecidos moles, como rim, cérebro e fígado requerem forças mecânicas suaves aplicadas durante a homogeneização. Isto contrasta com os tecidos duros tais como o músculo cardíaco e esquelético que requerem forças mecânicas muito mais fortes. O tecido moído é geralmente tratada com proteinase antes da homogeneização para amaciar o tecido. Todos os tampões usados durante a homogeneização e centrifugação deve ser frio e têm um pH fisiológico relevante com uma força iónica e osmótica compatível com citosol 4, 5. Uma das vantagens de estudar isoladas bioenergética mitocondrial é que membranas plasmáticas celular não precisa ser permealized com detergentes, tais como digitonina ou saponina 4, 6, o que pode comprometer a integridade mitocondrial externa da membrana. Outra vantagem da mitocôndria isolada é a ausência de outros factores citosólicas, que podem interferir com a análise das funções mitocondriais, tais como o consumo de oxigénio. As desvantagens de usar as mitocôndrias isoladas são a possível selecção de determinadas populações mitocondriais durante os passos de centrifugação, os danos para a mitocôndria durante a homogeneização, e o requisito de grandes quantidades de amostras biológicas a fim de obter um bom rendimento de mitocôndrias isoladas 7, 8. Após o procedimento de isolamento, as taxas respiratórias de complexos mitocondriais I-, II- e IV-dependentes (estados 2, 3 e 4) são determinados utilizando-alta resolução respirometria. Para complexo impulsionado-I respiração, glutamatoe malato são adicionados seguindo-se adenosina difosfato (ADP). Para complexo respiração impulsionado-II, succinato é adicionado, seguido pela ADP. Para complexo impulsionado-IV respiração, ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD) são adicionados, seguidos pela ADP 9, 10, 11, 12. Estado 2 refere-se ao consumo de oxigénio, na presença de substratos sozinho. Estado 3 se refere ao consumo de oxigénio, na presença de substratos e ADP. Estado 4 refere-se ao consumo de oxigênio após a depleção ADP. A relação de controle respiratório (RCR) é um índice de acoplamento da produção de ATP consumo de oxigênio e é calculado como a relação entre o estado 3 e 4 estado 13, 15. Em resumo, nós descrevemos um protocolo para isolar mitocôndrias musculares esqueléticas e funcionais intactos por centrifugação diferencial e utilizá-los mitochon isoladodria para estudos funcionais e bioenergéticos como respirometria de alta resolução.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00127</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 7699</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>fluka</td>
			<td>3779</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma,</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-lactobionate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L 2398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06129</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase, bacterial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 8038</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser&#160;</td>
			<td>schuett-biotec GmbH</td>
			<td>3.201 011</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Complexo I-dependente respiração Taxas isoladas complexo mitocondrial dependente da I respiratórias (estados 2, 3 e 4) são determinados utilizando respirometria de alta resolução (Figura 1, um diagrama representativo). substratos complexo I mitocondrial, glutamato e malato, são adicionados, seguidos pela adição de ADP. Estado 2 refere-se ao consumo de oxigénio, na presença de só os substratos. Estado 3 se refere ao consumo de oxigénio, na presença dos substratos e ADP. Estado 4 refere-se ao consumo de oxigênio após a depleção ADP. RCR é um índice do acoplamento do consumo de oxigénio para produção de ATP e é calculado como a razão entre o estado 3 e o estado 4. Como mostrado na Figura 1, após a adição de ADP, a taxa de respiração mitocondrial aumenta imediatamente (estado 3 da respiração), e em seguida, diminui (estado 4 da respiração) a níveis muito similar ao de estado 2. Isto indica uma alta RCR e que a integridade mitocondrial é bem preservada durante o procedimento de isolamento. A Figura 2 é um diagrama representativo da medição de uma baixa taxa de respiração e o estado 3 RCR, com um elevado estado de 4 a taxa de respiração, indicando inadequado e vencida mitocondrial isolamento. A alta taxa de respiração de estado 4 é um indicador de prótons mitocondrial leakiness 15. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig1.jpg" /> Figura 1: Bem sucedido isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade está bem preservada durante o procedimento de isolamento. Os traçados da ventilometria de alta resolução, utilizando o glutamato e malato como substratos (complexo de respiração-dependente I). A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). o oxiconcentração gen diminui ao longo do tempo como mitocôndrias isoladas de usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig2.jpg" /> Figura 2: sem êxito isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade não é bem preservada durante o procedimento de isolamento indicando inadequado mitocondrial isolamento. Os traçados da ventilometria de alta resolução, utilizando o glutamato e malato como substratos (complexo de respiração-dependente I). A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo como mitocôndrias isoladas de usar o available oxigênio. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Respiração complexa dependente da II Isolado mitocondrial complexos taxas respiratórias II-dependentes (estados 2, 3 e 4) são determinados utilizando respirometria de alta resolução (Figura 3, um diagrama representativo). Para este ensaio, o complexo I mitocondrial é inibida pela adição de rotenona, e depois succinato (substrato complexo II) é adicionado seguido pela ADP. A Figura 3 mostra que após a adição de ADP, os aumentos da respiração mitocondrial imediatamente, e, em seguida, diminui para níveis muito semelhantes à do estado 2, indicando mitocôndrias bem acoplados e queintegridade mitocondrial é bem preservada durante o procedimento de isolamento. O valor RCR calculada para esta experiência típica é 4,23, o que está em estreita concordância com os valores apresentados na literatura disponível 10, 11, 23). A Figura 4 é um diagrama representativo da medição de uma baixa taxa de respiração e o estado 3 RCR, com um elevado estado 4 ritmo respiratório indicando inadequado de isolamento. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig3.jpg" /> Figura 3: Sucesso isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade está bem preservada durante o procedimento de isolamento. Traçados da respirometria de alta resolução usando succinato como substrato (complexo respiração II-dependente). A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação deconcentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo como mitocôndrias isoladas de usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig4.jpg" /> Figura 4: sem êxito isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade não é bem preservada durante o procedimento de isolamento indicando inadequado isolamento. Traçados da respirometria de alta resolução usando succinato como substrato (complexo respiração II-dependente). A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo como Mitoc isoladohondria usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Complexo IV-dependente respiração Isoladas mitocondrial complexos taxas respiratórias dependente de IV (estados 2, 3) são determinados utilizando respirometria de alta resolução (Figura 5, um diagrama representativo). Para este ensaio de ascorbato / TMPD e ADP são adicionados, seguido de azida de sódio para inibir o complexo IV. A diferença entre o consumo de oxigénio antes e depois da adição de azida de sódio é interpretado como a respiração complexo IV real. A Figura 5 é um diagrama representativo de MEASURement de um elevado estado 3 taxa de respiração dependentes do complexo IV indicando que a integridade mitocondrial é bem preservada durante o procedimento de isolamento. Em contraste, a Figura 6 é um diagrama representativo da medição de um estado de baixo 3 indicando inadequado de isolamento. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig5.jpg" /> Figura 5: sucesso isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade está bem preservada durante o procedimento de isolamento. Os traçados da ventilometria de alta resolução utilizando ascorbato / TMPD como substrato (respiração complexo dependente de IV). Complexo IV respiração (estado 3) é interpretado pela subtracção do consumo de oxigénio antes e depois da adição de azida de sódio. A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo como mitocho isoladondria usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig6.jpg" /> Figura 6: sem êxito isolamento mitocondrial: mitocondrial integridade não é bem preservada durante o procedimento de isolamento indicando inadequado isolamento. Os traçados da ventilometria de alta resolução utilizando ascorbato / TMPD como substrato (respiração complexo dependente de IV). Complexo IV respiração (estado 3) é interpretado pela subtracção do consumo de oxigénio antes e depois da adição de azida de sódio. A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). O conce oxigêniontration diminui ao longo do tempo como mitocôndrias isoladas de usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Avaliação da integridade da membrana mitocondrial externa usando citocromo c Para avaliar a qualidade da preparação mitocondrial, ensaio do citocromo c é realizado para determinar a integridade da membrana mitocondrial externa, por medição da respiração mitocondrial após a subsequente adição de glutamato e malato, ADP e citocromo C (ADP estimulado complexo II dependente de estado 3 da respiração no presença de citocromo c). Como mostrado na Figura 7, o citocromo c não aumenta complexo dependente do estado eu 3 re<html> spiration do mitocôndrias isoladas, o que indica que não houve perda de citocromo c a partir da membrana exterior mitocondrial e integridade mitocondrial é preservada. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig7.jpg" /> Figura 7: Citocromo c não melhora a respiração do mitocondrial isolado: a integridade mitocondrial é bem preservada durante o procedimento de isolamento. Os traçados da ventilometria de alta resolução usando glutamato / malato como substrato (complexo de respiração-dependente I). A linha azul representa a concentração de oxigênio. A linha vermelha representa o fluxo de oxigênio (inclinação da concentração de oxigênio). A concentração de oxigénio diminui ao longo do tempo como mitocôndrias isoladas de usar o oxigênio disponível. O consumo de oxigênio é expressa como / (sx mg proteína mitocondrial) pmol.m / files / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Tampão de isolamento mitocondrial </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ácido sulfónico morfolinopropano (MOPS) </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> ácido etilenodiaminotetraacético (EGTA) </td><td> 1,0 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1,1 mm </td></tr><tr><td colspan="2"> pH 7,4 </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> Tampão de lavagem mitocondrial </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td colspan="2"> pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> A respiração mitocondrial tampão 16 </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> sacarose </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 3,0 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 80 mM </td></tr><tr><td> K-lactobionato </td><td> 60 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> taurina </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Hepes </td&gt; <td> 20 mM </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,0 g / L </td></tr><tr><td colspan="2"> pH 7,1 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: A composição de buffers.

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Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

isolation-intact-mitochondria-from-skeletal-muscle-differential

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K visualizações.  Inselspital, Bern University Hospital. Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Vídeo: Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Biologia

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...