This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Animal Welfare Act e da Política de Serviços de Saúde Pública dos EUA na Humane Cuidado e Uso de Animais de Laboratório após revisão pelo Animal Care e Use Committee do NIEHS. 1. Preparação de K. Cultura pneumoniae Cuidado: Executar todas as etapas de um 2 (BSL2) capô nível de segurança biológica ou outro BSL2 área designada e descartar resíduos por diretrizes BSL2 instituto. <ol><li> Para uma suspensão de crescimento de K. pneumoniae, descongelar um stock de glicerol de bactérias e inocular uma cultura de trabalho, transferindo 1 ml de K. pneumoniae estoque para 50 ml de caldo de soja tríptica (TSB) em um balão de 500 ml ou maior. </li><li> Faça stocks de glicerol pela adição de 900 ul de fase log cultivadas K. pneumoniae de 100 ul de glicerol estéril e congelação a -20 ° C ou -80 ° C. Para armazenamento a longo prazo, a -80 ° C é recomendável. </li><li> cultura de bactérias de step 1,1 balão por agitação durante a noite (14-18 horas) a 37 ° C a 200-225 rpm.In fim de promover o crescimento de fase logarítmica, diluída 1-5 ml desta cultura durante a noite para um frasco contendo 50 ml de TSB e na manhã lugar de volta a 37 ° C com agitação durante ~ 2,5 horas. </li><li> Transferir 1 ml de K. cultura pneumoniae a partir do último passo para um tubo de 1,5 mL e centrifugação a 7500 xg durante 2 min. A pelota branca deve ser visível. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento, suavemente ressuspender as bactérias com pipeta em 1 ml de soro fisiológico estéril, e roda de novo em 7500 xg durante 2 min. <ol><li> Executar este passo de lavagem 2x, elevando-se o sedimento final, lavadas em 1 ml de solução salina estéril. </li></ol></li><li> Realizar diluições em série log-wise desta inóculo arrumado. Por exemplo, adicionar 400 uL do inoculo em 3,6 ml de solução salina estéril em série para fazer uma série de 10 -1 -10 -9 diluição. </li><li> Determinar a OD 600 de K. lavada pneumoniae, colocando 1 ml de1:10 e 1: 100 diluições em cuvetes descartáveis e medindo a OD 600, limpando primeiro com solução salina estéril. Meça duplicados para garantir a precisão. Um OD 600 de 1,0 é equivalente a 4-7 x 10 8 UFC / ml. Note-se que a relação entre a OD e CFU / ml não podem ser lineares. <ol><li> Utilizar a DO 600 das diluições para calcular a concentração de K. pneumoniae, aplicando-se a OD: conversão CFU / mL acima, e Levando em conta a diluição. </li></ol></li><li> Use a K. concentração pneumoniae para preparar a dose de inoculo CFU desejado num &lt;volume de 100 ul para a entrega de ratinhos (ver abaixo). </li><li> Plate, também 100 ul de 10 -10 -9 -6 diluições e 100 ul de solução salina estéril em placas individuais de ágar de soja tríptico (TSA) à TA. Incubar a 37 ° C durante a noite e enumerar as colónias bacterianas, a fim de calcular a concentração exacta de que foi usada na experiência e para controlar a contaminação. NOTA: concentração bacteriana real de inóculo final pode ser ± 500 UFC / ml que o previsto pela absorção. Experimentadores devem, idealmente, confirmar a OD 600: UFC / ml relação em estudos-piloto antes do uso in vivo em ratinhos, empiricamente reajustar a OD 600: UFC / ml de conversão com base na sua experiência pessoal. </li></ol> 2. Murino intratraqueal (IT) Aspiração de K. pneumoniae da orofaringe <ol><li> Certifique-se de que os ratos são identificados exclusivamente pela marca de cauda, ​​tatuagem, ou outro identificador aprovado. </li><li> Elaborar dosagem de inóculo de bactérias usando pipeta P200 antes de remover os ratos de isoflurano a fim de acelerar procedimento. Para obter os melhores resultados com ele aspiração, utilizar um volume de &lt;100 ul para evitar transbordamento. Nisto, usar 2000 CFU / 50 ul de K. pneumoniae. </li><li> Anestesiar ratos numa câmara clara com gás isoflurano (por exemplo, 2% de isoflurano a um caudal de 1 L / min) ou como por Institorientações utional. O número de ratos para anestesiar conjunto é determinado pelo nível de conforto do experimentador, tipicamente 1-2 de cada vez. Observe a respiração e confirme nível de anestesia, uma vez respirações profundas são visíveis e 2-3 seg pode ser contado entre as respirações. NOTA: Se não houver preocupação com possíveis efeitos de confusão de anestésicos voláteis (inalados), a anestesia pode ser alcançado vez com injeção intraperitoneal de cetamina / xilazina. Com o método descrito acima, anestesia profunda, dura apenas alguns minutos. Se a anestesia é induzida mais prolongada, unguento para os olhos deve ser utilizado para prevenir a dessecação ocular. </li><li> Uma vez que o mouse é anestesiado, posicioná-lo em uma posição supina semirecumbent, suspenso pelos incisivos superiores de um elástico esticado entre pinos em uma placa de Plexiglas inclinado (Figura 1). </li><li> Com cuidado, puxe a língua mouse para o lado com um par de fórceps não sulcadas sem corte e dosagem de depósito na cavidade oral com uma pipeta P200e. Exercer grande cuidado para evitar induzir trauma, quer da língua ou da orofaringe. </li><li> Mantendo a língua retraída, gentilmente ocluir o nariz com um dedo de luva até que o mouse inala. Continue-se a cobrir o nariz até o rato tenha tomado duas ou mais inalações, e o líquido não é visível na cavidade oral. Cobrindo o nariz ajuda a garantir que o mouse vai inalar as bactérias nos pulmões, como os ratos são respiradores nasais obrigatórios. </li><li> Remover o rato da placa de inoculação e voltar para sua gaiola, colocando o mouse sobre as suas costas para evitar a cama ou detritos de bloquear as narinas, enquanto o rato está a recuperar da anestesia. </li><li> Uma vez que todos os ratos foram dosados e acordaram da anestesia, Casa de ratos em um cubículo / sala contendo apenas os ratos que foram doseados com K. pneumoniae. Monitorar os ratos diariamente, incluindo pesos corporais se ir além de 48 horas após a infecção. </li><li> Use puré diária e / ou calor suplementar, se permitindo que os ratos ir além de 48h. </li></ol> 3. Lavagem Broncoalveolar Fluid (LBA) Recolha e Análise <ol><li> Euthanize camundongos acordo com as diretrizes institucionais. Aqui, utilizar uma injecção letal de 150 mg / Kg de pentobarbital de sódio ou dose equivalente de solução comercial a eutanásia por exsanguinação seguida, como este evita complicações possíveis para os pulmões associadas com inalação de CO2 e deslocamento cervical. </li><li> rato posição nas costas e esterilizar rato por pulverização de pele com 70% de etanol em particular sobre a área do peito e pescoço. </li><li> Faça um corte longitudinal logo abaixo do esterno, em seguida, segurando o esterno com uma pinça, entalhe do diafragma, permitindo que o pulmão a cair de volta para a cavidade torácica. Corta-se através da cavidade torácica em ambos os lados da vasculatura e, em seguida, para cima através do pescoço, expondo a traqueia. </li><li> À medida que a traqueia é rodeada pelos músculos longitudinais em ambos os lados, cuidadosamente cortados pelo meio e empurrar o tecido para os lados, conformeisto evita o corte da vasculatura circundante, a qual pode introduzir sangue na traqueia. Se a vasculatura é cortado, limpe a área circundante com gaze antes de acessar a luz traqueal. </li><li> Use tesouras cirúrgicas ou para uma agulha de nick da traqueia cerca de ¼ do caminho para baixo a partir da cabeça e inserir uma cânula ligada a uma seringa de 1 ml de pré-carregado com 1 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) caudalmente para a traqueia. Se utilizando murganhos &lt;8 semanas de idade ou fêmeas, reduzir o volume lavaging de 600-800 ul. </li><li> Empurre o volume para o pulmão lentamente, permitindo que todos os lobos para inflar e puxe o volume de volta para fora com a seringa, repetindo 3x. Se PBS está saindo das narinas a cânula não foi empurrada para dentro da traqueia ou a inflação está ocorrendo muito rapidamente. Em alternativa, se os pulmões não são bem inflar, a cânula foi empurrado demasiado para dentro, de modo retirar ligeiramente. </li><li> Recolha lavagens reunidas em um tubo de 15 ml em gelo. </li><li> Giraro espaço aéreo de fluido de lavagem a 1.200 xg durante 5 minutos, recolher o sobrenadante para um tubo de 1,5 mL e congelar a -80 ° C. Subsequentemente, utilizar-se o sobrenadante (isto é, BALF) para a medição de proteínas, citoquinas, e para vários outros ensaios bioquímicos. O sedimento de células representa o espaço de broncoalveolar. </li><li> Se as células vermelhas do sangue (RBCs) são evidentes na pelete de células com base na cor, lise com 1 ml de tampão de lise ACK durante 1 min, seguido por adição de 5 ml de 1x PBS para parar a reacção e diluir a lise tampão. Manusear todas as amostras de forma idêntica, seja tratada ou não com tampão de lise ACK. </li><li> células giram a 1200 xg durante 5 minutos, decanta-se o sobrenadante, e trazem-se as células em 1 ml de PBS 1x. </li><li> células Vortex e contar com um hemocitômetro para contagem de células totais do espaço aéreo. </li><li> Com base na densidade de células adicionar cerca de 80-150 ul (~ 80 mL de um rato infectado e ~ 150 para um rato ingênuo) para uma câmara de slides em uma centrífuga Cytospin. célula de trefilagems em lâminas de microscópio para a coloração subsequente para determinar as populações de células diferenciais. </li><li> Permitir que as células secar durante a noite em lâminas. Células mancha com tri-mancha (por exemplo, Hema 3 [ver tabela]) mergulhando as lâminas 7 vezes em fixador, 9 vezes em mancha de 1 e 7 vezes em mancha 2 (sem lavagens entre manchas), e deixe secar. Após mancha secou, ​​lâminas lamela e manualmente contar diferenciais por microscópio. Geralmente, neutrófilos e monócitos / macrófagos são facilmente distinguidos pelo seu tamanho e morfologia nuclear. </li></ol> 4. Determinar a carga bacteriana no pulmão e nos tecidos periféricos <ol><li> Antes de começar: preparar tubos de diluição com 900 mL de 1x PBS para pulmão e baço e 90 ul de 1x PBS para sangue. placas de etiqueta para a cultura de bactérias e definir a temperatura ambiente; Portanto, o tempo uma vez que o tecido tenha sido recolhida vai ser minimizado entre homogeneização e plaqueamento para crescimento bacteriano. Nota: Devido à deposi heterogêneoção de bactérias nos pulmões que podem ocorrer com aspiração, recomenda-se que os ratos individuais ser utilizado para análise de qualquer celularidade total das vias respiratórias ou de carga total (bilateral) pulmonar bacteriana. </li><li> Euthanize o mouse como por passo 3.1 e recolher posteriormente sangue do ventrículo esquerdo, colocando em um tubo heparinizado para evitar a coagulação. Remove todos os lobos pulmonares e lugar em um tubo de 15 ml contendo 5 ml de PBS 1x, seguido por remoção do baço e colocação em 2 ml de PBS 1x. Coloque os tubos em gelo. Tome cuidado para limpar instrumentos com etanol entre cada tecido / mouse. </li><li> Homogeneizar o tecido em gelo, de preferência com homogeneizadores descartáveis ​​que podem ser alterados entre cada amostra. dicas homogeneizador descartáveis ​​podem ser autoclavados para reutilização entre os experimentos. </li><li> Uma vez que o tecido foi homogeneizado, realizar diluições em série e placa. Amostras de placa de um tecido dada / diluição em duplicado em uma única placa de TSA por traçar uma linha divisória no plástico. Chapeamento e dilução sugestões são mostrados abaixo (em todos os casos, 10 ul de amostra é espalhada sobre placa) e baseiam-se numa 24 h pós-infecção necropsia. Se analisando amostras 48-72 hr, um maior número de diluições podem precisar de ser banhado devido ao aumento da carga bacteriana em pontos de tempo posteriores. <ol><li> Para Sangue - diluir 1:10 por adição de 10 ul de sangue em 90 ul de PBS estéril 1x. Placa limpo e 1:10 amostras diluídas em duplicado. Uma vez que o sangue foi banhado, girar o sangue residual a 9300 xg durante 10 minutos para extrair o plasma para a medição de citoquinas e quimioquinas. </li><li> Para Pulmão - diluir 1:10 - 1: 100 por adição de 100 ul de homogeneizado de pulmão em 900 ul de PBS estéril 1x em série. Placa puro homogeneizado e todas as diluições em duplicado. </li><li> Para Baço - dilua 1: 10-1: 100 por adição de 100 ul de baço homogeneizado em 900 pi de PBS estéril 1x em série. Placa puro homogeneizado e ambas as diluições em duplicado. </li></ol></li><li> Deixar as amostras de propagação para secar brevemente. </li&gt; <li> Inverta placas de TSA e coloque em uma estática de 37 ° C incubadora durante a noite. </li><li> Determinar o número de bactérias que colonizam a média das colónias de bactérias a partir de ambos os lados da placa e a partir de cada diluição. Fator nas diluições iniciais de 5 ml de pulmão e 2 ml de baço para determinar UFC tecido totais. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Modelos murinos de pneumonia bacteriana, em parceria com o gene alvo e nas intervenções biológicas e farmacológicas in vivo, têm fornecido insights críticos sobre a resposta de defesa do hospedeiro pulmonar. Grandes avanços foram feitos, em particular, no nosso entendimento das quimiocinas e moléculas de adesão que regulam o recrutamento de neutrófilos para o espaço aéreo infectada 10,11. Modelos in vivo de pneumonia, ao contrário de abordagens baseadas em células ou alternativas, também forneceram informações importantes sobre endócrino comunicações que ocorrem entre o pulmão infectado e outros órgãos, tais como o fígado (resposta de fase aguda) 12 e as glândulas supra-renais (glucocorticóides stress) 13. Finalmente, um ponto crítico e clinicamente muito relevante que é revelado por in vivo modelos pneumonia é que a depuração patógeno bem sucedido não é o mesmo que o sucesso do hospedeiro. Em muitos casos, uma resposta imunitária overexuberant podem levar a morte do hospedeirodevido a lesão pulmonar espectador excessivo, mesmo em face da bem sucedida apuramento patógeno 8,14. Dado isto, medições paralelas de depuração agente patogénico e da resposta imune são geralmente mais informativos, e podem em última análise, ser necessários estudos de sobrevivência para revelar a resistência integrado do hospedeiro. Aqui, nós descrevemos um método simples e não invasivo para a administração de bactérias para o pulmão murino através de aspiração. Em comparação com dispersão em aerossol, este método acarreta um menor risco potencial para a exposição respiratória do pessoal do estudo, fornece para a entrega de inoculo mais elevada concentrou-se para o pulmão profundo, e evita o efeito de confusão por oculares e das vias aéreas superiores respostas imunes. Intranasal inoculação realiza também a preocupação potencial confusão de infecção das vias respiratórias superiores, incluindo a possibilidade de infecção localmente invasivo do sistema nervoso central 4, e também tem sido relatada como resultando em inóculos altamente variável no pulmão5. Em comparação com a intubação endotraqueal quer por via perorai ou via transcutânea, este método requer o mínimo de formação, é mais rápida (~ 1 min por ratinho), e, pelo menos em comparação com o último método, tem uma menor morbidade. Desvantagens potenciais do método aspiração orofaríngea - alguns dos quais são partilhadas por outros métodos - incluem a necessidade de anestesia geral, a probabilidade de irregular (isto é, assimétrica e heterogénea) a entrega de agentes patogénicos, infecção predominante dos lobos inferiores 15, e a incapacidade para dirigir o patógeno unilateralmente a um único pulmão. Devido à distribuição desigual nos pulmões após a aspiração (dados não mostrados) - um resultado que é encontrado com todos os outros do que aerosolization 15 métodos de infecção de pulmão - que geralmente não realizar ensaios pulmonar unilateral em camundongos infectados. Ambos os pulmões ou são lavados em conjunto para avaliar a resposta imune, ou necropsiados juntos por quant bacteriana poolitation e / ou análise molecular (por exemplo, a expressão do gene, o ensaio de mieloperoxidase, citocinas ELISA). Passos particularmente críticas do protocolo são passo 1,8 -confirming a 600 OD: relacionamento UFC / mL antes da infecção in vivo e também confirmando a concentração de inóculo através de plaqueamento em cada experiência; bem como o passo 3.6 - assegurar uma lavagem não traumática das vias aéreas com boas volume volta para a seringa. Apesar de co-infecção com flora oral (ou seja, pneumonia polimicrobiana) é uma preocupação teórica, não temos encontrado colônias bacterianas polimórficas em homogeneizados de pulmão de ratos infectados com K. pneumoniae ou S. pneumoniae. Por causa investigadores sobre esta possibilidade, contudo, os ratinhos de controlo podem ser expostas a veículo aspirado (ou seja, tampão), se desejado. Embora alguma contaminação do lúmen do estômago através de deglutição (unaspirated de bactérias residuais) é possível saberh o método que descrevemos, nós nunca encontrou sinais ou mudanças na patologia grave clínicos gastrointestinais. Além disso, esta possibilidade é comum para os métodos de tratamento por aerossol e intranasal, e pode até ocorrer a seguir a tosse no método de inoculação intratraqueal. Algumas preocupações metodológicas são universais a todos os modelos de pneumonia. Os grupos de controle e mouse experimental deve ser idealmente dentro de 2-3 semanas um do outro com a mesma idade. Embora não tenhamos encontrado diferenças de género evidentes na depuração patógeno ou inflamação das vias aéreas no K. modelo pneumoniae, os ratos devem ser pareados por sexo, como diferenças significativas entre os sexos na resposta imune inata foram relatados 16. Deve ser dada uma consideração cuidadosa para a origem do controle camundongos. controlos da mesma ninhada são geralmente preferidas em relação aos controlos adquiridos comercialmente como retrocruzamento incompleta, diferenças relacionadas com o microbioma nas populações de células imunitárias, e outra epigenetdiferenças ic são todos fatores de confusão possíveis que podem afetar a resposta imune 17,18. Atenção especial deve ser dada ao sorotipo específico e história cultura da bactéria infectar como diferenças substanciais na virulência podem ser vistos. Com base em nossa experiência com K. pneumoniae, recomendamos a realização de estudos-piloto iniciais, utilizando uma gama de infectar inóculos (por exemplo, 500-2.000 CFU) como da morbilidade / mortalidade de doses bacterianas específicos relatados na literatura - mesmo com o mesmo sorotipo bacteriana e mouse estirpe - não pode traduzir bem ao próprio laboratório, provavelmente devido a uma variedade de técnicas discrepâncias. diferenças inter-grupos entre controle e ratos experimental nos resultados inflamatórias e de acolhimento de defesa pode ser dependente de inóculo. Devido às realidades logísticas de criação de animais e de pessoal, que muitas vezes conduzir experimentos com 5-6 ratinhos por grupo experimental. Embora este ocasionalmente fornece poder estatístico adequado para CFU e contagem de células resultados, descobrimos que muitas vezes precisa repetir um estudo desta dimensão uma ou mais vezes, a fim de alcançar o poder adequada. Para alguns ratinhos em uma dada experiência, nenhum crescimento bacteriano detectável no sangue e baço podem ser encontradas 24 horas pós-infecção (Figura 5). Nós interpretamos isso para indicar que 24 horas pode estar perto do limite cinética para a disseminação extrapulmonar detectável. Se baixo crescimento / indetectável no sangue / baço é observada, pulmão CFUs a partir do mesmo rato deve sempre ser examinado para tratar a possibilidade de um erro técnico (isto é, infecção muito baixo / indetectável pulmão, possivelmente indicando um erro na dosagem do rato). No fechamento, o método de entrega aspiração orofaríngea de pneumonia bacteriana em ratos é uma técnica robusta que é relativamente fácil de adquirir a partir de um custo, formação e equipamento de ponto de vista, e é realista mesmo para laboratórios sem extensa experiênciaem processos pulmonares. O método pode ser facilmente acoplado a ensaios microbiológicos e imunológicos jusante da resposta de defesa do hospedeiro, e podem além disso, ser utilizado como um método de entrega pulmonar para uma vasta gama de riscos não cáustico.

Pneumonia adquirida na comunidade continua a ser a principal causa de morte por infecção em os EUA, com pouca mudança global nas taxas de mortalidade nos últimos 40 anos, apesar de melhorias na vacinação e estratégias de antibióticos 1,2. Apesar da falta de progresso perceptível ao nível da saúde pública, nos últimos anos avanços dramáticos foram feitos em nosso entendimento da patogênese molecular e celular de pneumonia, com muitos desses passos em frente possibilitadas pelo uso de modelos de ratos com infecção pulmonar. A rastreabilidade genética do rato, a semelhança do murino e sistema imunológico humano, e a vasta gama de reagentes imunológicos alvo de murino que se tornaram disponíveis comercialmente, em conjunto, facilitou o progresso rápido do campo. mouse modelos de pneumonia bacteriana descrita na literatura em geral invocada uma das quatro rotas técnicas de inoculação: i) aerosolization; ii) intrentrega anasal; iii) a entrega por via oral; e iv) a injecção intratraqueal cirúrgica (ou seja, traqueotomia) 3. Todas as vias de infecção têm vantagens e desvantagens 3. Em particular, a exposição, relativa das vias aéreas superiores, o potencial para a mistura da flora oronasal requisitos para anestesia geral, a variabilidade do inoculo entregue ao pulmão distai, distribuição lobar dos agentes patogénicos entregues, os requisitos de peritagem técnica, e morbidade processual variam amplamente entre estes abordagens. Comumente técnicas de infecção por via oral usados incluem endotraqueal (translaríngea) canulação, quer através de uma abordagem &quot;cega&quot; (não visualizado), ou sob visualização direto da laringe 3-5. Ambos os métodos, ao mesmo tempo robusta, requer treinamento substancial e também carregam risco de trauma na via aérea superior. No presente relatório, nós descrevemos um método tecnicamente não-intensivo, não-invasivo, barato e rápido da infecção por via oral, wdeclara bactérias Klebsiella pneumoniae (no exemplo apresentado) pipetada para a orofaringe de um rato anestesiado são entregues para os pulmões por meio de aspiração (isto é, por inalação). Nós e outros autores utilizaram a técnica de pneumonia aspirativa com êxito 6-9. Este método de pulmão de entrega versátil e facilmente aprendido pode ser estendido para a entrega de muitos agentes não cáustico adicionais para os pulmões, incluindo citoquinas e outras proteínas, moléculas associadas a agentes patogénicos (por exemplo, lipopolissacarídeo), células (isto é, a transferência adoptiva), e toxinas (por exemplo, bleomicina). Além de discutir as considerações técnicas importantes, nós também descrevem uma abordagem integrada, quantitativa para avaliar a resposta do hospedeiro após a pneumonia, incluindo a medição a jusante da depuração bacteriana (ou seja, unidades formadoras de colônia [UFC] quantificação nos órgãos do pulmão e periféricos) e leucócitos acumulação no espaço aéreo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Klebsiella pneumoniae, serotype 2</td>
			<td style="width:169px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">43816</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tryptic soy broth</td>
			<td style="width:169px;">Becton Dickenson</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4&#34;</td>
			<td>Claflin Medical Equipment</td>
			<td style="width:119px;">MEDC-031122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hema 3 Solution 1</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23-122-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hema 3 Solution 2</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23-122-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hema 3 Fixative</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23-122-929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">27&#189; gauge tuberculin syringes</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-826-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Lithium heparin plasma collectors</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2675187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">L-shaped disposable spreaders</td>
			<td style="width:169px;">Lab Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:243px;">1x PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:169px;">prepared in-house</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:243px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:169px;">prepared in-house</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive and technically non-intensive method for induction and phenotyping of experimental bacterial pneumonia in mice

Embora a pneumonia adquirida na comunidade continua sendo um grande problema de saúde pública, modelos murinos de pneumonia bacteriana recentemente facilitada avanços pré-clínicos significativos em nossa compreensão da patogênese celular e molecular subjacente. Modelos in vivo rato capturar a fisiologia integrada e resiliência da resposta de defesa do hospedeiro em uma forma não revelada por, simplificado vivo abordagens alternativas ex. Vários métodos foram descritos na literatura para a inoculação de bactérias intrapulmonar em ratinhos, incluindo o tratamento com aerossóis, administração intranasal, endotraqueal canulação perorai sob condições &quot;cegas&quot; e visualizadas, e canulação endotraqueal transcutânea. Todos os métodos têm méritos e limitações relativas. Aqui, nós descrevemos em pormenor um método não-invasivo, tecnicamente não intensiva, de baixo custo, e para a entrega rápida intratraqueal de bactérias que envolve a aspiração (isto é, por inalação) pelo mousede um inoculo infeccioso pipetados para a orofaringe, enquanto sob anestesia geral. Este método pode ser utilizado para a administração pulmonar de uma grande variedade de agentes químicos e biológicos não cáustico, e é relativamente fácil de aprender, mesmo para laboratórios com o mínimo de experiência anterior com procedimentos pulmonares. Além de descrever o método de pneumonia por aspiração, nós também fornecemos procedimentos passo-a-passo para ensaio subsequente in vivo resposta imune inata pulmonar do rato, em particular, métodos de quantificação de apuramento bacteriana e resposta imune celular das vias aéreas infectado. Esta abordagem integrada e simples para avaliação da pneumonia permite a avaliação rápida e robusta do efeito de manipulações genéticas e ambientais sobre a imunidade inata pulmonar.

Ratinhos C57BL / 6 foram infectados com 2,000 CFU de K. pneumoniae 43816 (serótipo 2) por meio de aspiração da orofaringe para dentro dos pulmões. Nesta dose, os ratos normalmente começam a mostrar sintomas clínicos 12-24 h pós-infecção, incluindo letargia, pele enrugadas, e perda de peso de 5-10% (Figura 2A). Dentro de 48-72 horas após a infecção, muitos dos murganhos apresentam sintomas de doença e de morbilidade que é tipicamente precedido por uma média de perda de peso de 20% e os resultados de posturas curvados com actividade diminuída e diminuição da capacidade de resposta à estimulação. Estudos de maior duração pode necessitar de uma dose mais baixa de K. pneumoniae. A infecção com 500 CFU de K. pneumoniae resulta em doença mais suave com um pico 3-5 d pós-infecção que é caracterizada por uma perda de peso de 10-15% de recuperação com o ganho de peso e por dia começando 5-6 (Figura 2B). O peso corporal é muitas vezes preditivo de sobrevivência, com uma perda de peso de 20% raraly associada com a recuperação. O sucesso da resposta do hospedeiro pode ser melhor indicado por estudos de sobrevivência, em que ratos são monitorados por 10-14 dias, e sacrificados (por diretrizes institucionalmente aprovados) para os sinais de estado moribundo, como a mínima capacidade de resposta à estimulação táctil e / ou perda de peso &gt; 20%. Estudos de sobrevivência são muitas vezes mais eficaz se um inoculo infectante como alvo um que se aproxima de 50% de letalidade (isto é, a dose LD50) no grupo de controlo (Figura 2C). Uma dose LD50 permite a detecção de ambos relativamente aumentada e diminuição da sobrevivência no grupo experimental. sobrevivência diferencial pode estar dependente de inoculo, de modo que várias doses de infecção pode por vezes ser necessário para detectar um fenótipo alterado de defesa do hospedeiro. Infecção do trato respiratório inferior, com K. pneumoniae é caracterizada por um fluxo forte de Leukocytes para a via aérea. Enumeração de células imunitárias e a diferenciação através da coloração do sedimento de células BAL demonstra um aumento das células imunitárias das vias aéreas dentro 6H pós-infecção (Figura 3A). Picos celularidade por 24 h, com neutrófilos sendo a célula imunitária predominante nas vias respiratórias (Figura 3A-B). Ambos os sexos de ratinhos C57BL / 6 demonstram leucocitose equivalente das vias aéreas em resposta a K. pneumoniae às 24 h e 48 h pós-infecção (Figuras 3C-D). pneumonia bacteriana induz local (intrapulmonar) e sistémicas mediadores pró-inflamatórios incluindo citocinas e quimiocinas. os níveis de citocina / quimiocina local pode ser detectado no BALF com uma ELISA convencional ou utilizando um sistema multiplex de citocina. As citocinas, incluindo IL-6, a RANTES, o TNFa, G-CSF, e os outros são detectável em ambas as 24 h e 48 h pós-infecção com K. pneumoniae e fornecer insights sobre o lung microambiente e o seu recrutamento de células imunitárias (Figura 4). Coleção de pulmão, sangue e tecidos periféricos (s), tais como baço permite a quantificação da carga bacteriana tecido, fornecendo informações sobre as taxas de clareamento pulmonar local de micróbios, bem como a disseminação extrapulmonar de bactérias. A diluição em série e a cultura do pulmão demonstra expansão da carga microbiana entre 24 h e 48 h pós-infecção (Figura 5A). Descobertas similares são observados no sangue e do baço (Figura 5B - C). De nota, a carga bacteriana bimodal pode ser observado no sangue e baço às 24 h pós-infecção, com alguns ratos com disseminação bacteriana de alto grau, e outros, mesmo em face da carga bacteriana de alto grau no pulmão, exibindo nenhuma bactérias detectáveis no sangue ou baço. K. a carga bacteriana pneumoniae em ratinhos C57BL / 6 não é Gend-er específica, como machos e fêmeas demonstrar peso equivalente em vários tecidos pós-inoculação (Figura 5D-F). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54508/54508fig1.jpg" /> Figura 1:. Conselho Procedimento de pneumonia por aspiração em Ratos Estudo ratos são posicionados, cabeça para cima e de volta à placa (ou seja, semirecumbent), suspenso pelos incisivos de um elástico esticado entre dois pinos montado em uma Plexiglas ou painéis semelhantes. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54508/54508fig2.jpg" /> Figura 2: Avaliação da perda de peso e Morbidade Após aspiração pulmonar de K. pneumoniae. Ratinhos C57BL / 6 (n = 10-20 por condição) foram infectados por aspiração de K. pneumoniae 43816 (serotipo 2). (A) Pesos diários, indexada peso de pré-infecção, a partir de camundongos infectados com 2.000 CFU. Neste estudo, não ratos sobreviveram dia 6. Infecção (B) passado com 500 CFU resulta em perda de peso diário através dia 4 pós-infecção com uma transição para o ganho de peso começando por dia 5. curvas (C) Sobrevivência de 150 CFU, 500 CFU, e infecções por 2000 unidades de formação de colónias (CFU), indicando que 500 CFU aproxima da DL50. Dados em painéis A e B são a média ± SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54508/54508fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54508/54508fig3.jpg" /> Figura 3: A infecção com K. pneumoniae Resultados nas dependente Time-Airway leucocitose. camundongos C57BL / 6 foram dadas infecção intrapulmonar a 2000 CFU de K. pneumoniae. (A) quantificação de leucócitos (WBC) totais, neutrófilos (PMN) e macrófagos (MO) em fluido do espaço aéreo em vários pontos de tempo após a infecção. (B) Após a coloração, PMN e macrófagos pode ser facilmente identificado por morfologia e tamanho nuclear em campos de Cytospin e contadas. (C - D) A infecção em homens e mulheres resulta em um número semelhante de células inflamatórias recrutadas às 24 horas e pós-infecção de 48 horas. Os dados derivam de 6-25 / ratos por condição e são a média ± SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54508/54508fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54508/54508fig4.jpg" /> Figura 4: citocinas e quimiocinas são induzidas no espaço aéreo em resposta à infecção bacteriana camundongos C57BL / 6 foram dadas intrapulmon.infecção ary a 2000 CFU de K. pneumoniae. BALF citocinas e quimiocinas foram quantificados por ensaio multiplex às 24 h pós-infecção e 48 horas. Os dados derivam de 5-15 ratos / condição e são a média ± SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54508/54508fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54508/54508fig5.jpg" /> Figura 5:. A expansão dependente do tempo de carga bacteriana nos pulmões e nos tecidos periféricos durante Pneumonia ratinhos C57BL / 6 foram dadas infecção intrapulmonar com 2,000 CFU de K. pneumoniae. parenquimatosa carga bacteriana (A) Pulmão foi medida por plaqueamento de diluies em sie de homogeneizado de pulmão em TSA 24 h pós-infecção e 48 horas. (B) Corrente sanguínea e (C) da carga bacteriana do baço foram igualmente quantificados. ( <strong&gt; D - F) da carga bacteriana em vários tecidos é equivalente em ratinhos macho e fêmea, após a indução da pneumonia. Os dados derivam de 10 ratinhos / condição e são a média ± SEM. Zero valores em painéis B, C, E, e F foram atribuído um valor de 0,1 para permitir gráficos em uma escala log. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54508/54508fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

a-non-invasive-technically-non-intensive-method-for-induction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K visualizações.  National Institutes of Health.  Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados. 

Vídeo: A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Imunologia e Infecção

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Um método para Etiquetagem Vascularização no embrião do rato

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infecção no Rato Neonatal

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...