Este trabalho foi financiado em parte por doações do NIH (HL118532, HL120142, CA187692), o Packard Fundação David &amp; Lucile, a Camille &amp; Dreyfus Fundação Henry, eo Burroughs Bem-vindo Fundo. ASP foi apoiado em parte por um Charlotte Elizabeth Procter honorífico Fellowship.

1. Preparação de Soluções <ol><li> Para preparar uma solução a 5 mg / ml de insulina, dilui-se a base de insulina em pó com ácido clorídrico a 5 mM (HCl) em dH 2 O (500 mg de insulina em 100 ml de solvente). Preparação de 100 ml de solvente por adição de 50 ul de HCl concentrado a 100 ml de água destilada (dH2O). </li><li> Para fazer uma solução de PBS 1x, dilui-se a solução de reserva 10x de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para 1x com dH2O sob condições estéreis. </li><li> Prepara-se o (PDMS) elastómero solução de polidimetilsiloxano como segue: misturar a pré-polímero de PDMS, juntamente com o agente de cura numa proporção de 10:: 1 (w w). </li><li> Prepara-se o meio de cultura celular como se segue: a 500 ml de estoque de Dulbecco Modified Eagle Médium: Mistura Nutriente F-12 (DMEM / F-12), adicionam-se 10 ml de soro fetal de bovino estéril (FBS), 500 ul de reagente de gentamicina, e 500 uL de 5 mg / ml de insulina. </li><li> Para preparar a albumina de soro bovino 1% (BSA) em solução de PBS 1x, adicionar 1% (w: V) solução de pó de BSA para 1x PBS e misture bem. </li><li> Para preparar uma solução de 4 mg / ml de bovino tipo neutralizada I colágeno, adicionar 50 ul de 10 x solução salina equilibrada de Hank (HBSS) de tampão, 30 ul de 0,1 N de hidróxido de sódio (NaOH), meio de cultura celular de 30 ul e 400 ul de colagénio estoque para um tubo de microcentrífuga de 1.5 ml fresco. Misture devagar pipetando cima e para baixo; evitar a introdução de bolhas. Para remover quaisquer bolhas, Centrifugar brevemente a mistura a 4 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução fixadora por diluição de 16% de paraformaldeído a 1: 4 (v: v) em PBS 1x. </li><li> Prepara-se uma solução de etiquetagem núcleos por diluição da solução núcleos banco de rotulagem 1: 1000 (v: v) em PBS 1x. </li><li> Prepara-se uma solução salina tamponada com fosfato 0,3% e solução de detergente (PBST) através da mistura de 1x PBS com 0,3% (v: v) de detergente. </li><li> Preparar o tampão de bloqueio por diluição de soro de cabra a 01:10 (v: v) em 0,3% de PBST. </li><li> Prepara-se uma solução de anticorpo primário para uma determinada proteína de interesse por diluição priMaria anticorpo (por exemplo, de coelho anti-quinase de adesão focal (FAK)) 1: 200 (v: v) em tampão de bloqueio. </li><li> Prepara-se uma solução de anticorpo secundário diluindo um anticorpo conjugado sonda-fluorescente (por exemplo, anticorpo de cabra anti-coelho) 1: 1000 (v: v) em tampão de bloqueio. </li></ol> 2. Preparação de elastoméricos selos para micropatterning 3D Nota: selos elastoméricos são feitos com PDMS. <ol><li> Adicione uma solução de PDMS na mesma proporção que a descrita no passo 1.3 e homogeneiza-se. Coloque a mistura em uma câmara de vácuo durante 15-30 min para remover quaisquer bolhas de ar que foram introduzidas durante o processo de mistura. </li><li> Despeje a solução desgaseificado em um plástico pesam barco ou placa de Petri contendo um mestre de silício que é lithographically modelada com características de geometria desejada. Para melhores resultados, curar o PDMS solução a 60 ° C durante ~ 12 horas. Nota: Os mestres de silício são altamente personalizável; este protocolo utiliza estruturas retangulares, com dimensões de 50um x 200 um x 50 um espaçadas 200 um aparte. Os mestres de silício pode ser feita usando técnicas de fotolitografia padrão. Resumidamente, um foto-resistente é à base de epoxi-girar revestida em cima de uma pastilha de silício. Uma máscara que detalha as características desejadas selo é colocado no topo da pastilha revestida-foto-resistente, que é então exposta à luz UV. As características desejadas não bloqueados pela máscara são expostos à luz e o fotorresistente nesses locais se torna reticulado, enquanto que o restante do revestimento foto-resistente é solúvel e pode ser lavado. </li><li> Depois de o PDMS tem curado em torno das características desejadas no mestre de silício, remover o PDMS e mestre a partir do recipiente plástico. Cuidadosamente separar o PDMS da bolacha de silício e remover o excesso de PDMS em torno das características impressas utilizando uma lâmina de barbear limpo. </li><li> Agora corte os PDMS estampados com características impresso no interior selos retangulares individuais (~ 8 mm x 5 mm) com uma lâmina de barbear. Armazená-los longa-side-up em um cleum de 100 mm de diâmetro placa de Petri. </li><li> Além disso, utilizar a solução PDMS descrito no passo 1.3 para fazer suportes para os carimbos rectangulares. </li><li> Utilizando um revestidor de rotação, espalhar ~ 2-3 g da solução de PDMS uniformemente em um de 100 mm de diâmetro, uma placa de Petri e curar o PDMS durante ~ 12 h a 60 ° C como no passo 2.1. Em seguida, utilizando uma lâmina de barbear, cortar a fina camada de PDMS em rectângulos (aproximadamente 5 mm x 2 mm). Nota: Dois suportes são necessários para cada selo PDMS feita no passo 2.3. Os suportes podem ser armazenados nos 100 mm de diâmetro numa caixa de Petri que contém os carimbos de PDMS. </li><li> Antes de os carimbos de PDMS e suportes podem ser usados ​​para a cultura de células, esterilizar por imersão em etanol a 70% e seca utilizando um aspirador num armário de segurança biológica (cultura de células capa). </li></ol> 3. Preparação de tecidos epiteliais 3D <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica, adicionar uma gota de cerca de 50 ul de BSA a 1% em PBS para o início de cada selo. Coloque a gota coberto carimbos, a 4 ° C durante um minimamã de 4 h para assegurar que a BSA é adsorvido à superfície do selo. </li><li> Aspirar solução de BSA a partir de os carimbos de PDMS. </li><li> Lavam-se as superfícies dos selos duas vezes com meio de cultura de células (50 uL por lavagem por selo deve ser suficiente), a aspiração após cada lavagem. </li><li> Lidar com os selos e os suportes PDMS esterilizados utilizando pinças de aço inoxidável curvas. Em uma cabine de segurança biológica, colocar para fora um de 35 mm de diâmetro prato de cultura de tecidos para cada PDMS selo. Em cada prato, deitou-se dois PDMS suportes separados por uma distância ligeiramente menor que o comprimento dos selos PDMS. </li><li> Usando as pinças, esterilizar como muitas lamelas de vidro circulares (15 mm de diâmetro, # 1) como existem PDMS selos usando 70% de etanol. Aspirar o líquido em excesso as lamelas, mantendo-os com a pinça. Armazenar as lamelas foram lavadas em uma de 100 mm de diâmetro Petri prato separado. </li><li> Dispensar ~ 50 ul da mistura de colagénio para revestir uniformemente a superfície de cada carimbo de PDMS. </li><li> Pegarcada PDMS revestidos com colagénio carimbar com a pinça e inverter cuidadosamente eles. Diminuir os selos invertidas no topo do PDMS suporta estabelecidas em cultura de tecidos de 35 mm de diâmetro abaulado de modo a que o colagénio é entre o selo e o fundo do prato de cultura de tecidos. Incubar os pratos a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Dispensar ~ 50 ul da mistura de colagénio restante em cada uma das lamelas circulares (mais tarde, estes irão ser colocados no topo dos tecidos modificados para encapsular completamente los em colagénio) e incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Obter uma placa de cultura de tecidos de 100 mm de diâmetro contendo células epiteliais (ex. EpH4 rato células epiteliais mamárias) em ~ 40% de confluência. Aspirar o meio de cultura de células e lava-se uma vez com 10 ml de PBS 1X. Adicionar 2 ml de tripsina às células e incuba-se a 37 ° C durante 5-10 min. </li><li> Adicionar 8 mL de meio de cultura fresco para a placa de cultura de tecido contendo células tratadas com tripsina, separando as células aderentes remanescentes do prato. Misturar suavemente por pipetagem e mover-se a mistura de células para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 100 x g durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante do tubo cónico e ressuspender o sedimento de células em meio de cultura celular. Usando um hemocitómetro, contagem de células para determinar a concentração da suspensão. Ajustar o volume de suspensão para se obter uma concentração final de 10 ~ 6 -10 7 culas / ml. </li><li> Retirar as amostras de colagénio gelificadas da incubadora. Usando a pinça, levante suavemente os selos PDMS em linha reta para cima para destacá-las do colágeno moldado e descartá-las. </li><li> Dispensar ~ 30 ul da suspensão de células concentrada sobre a superfície de cada gel de colagénio contendo cavidades moldadas, de geometria desejada. Observar as células em um microscópio de campo claro com uma objectiva 10X / 0,25 NA, enquanto agitando o lado pratos a lado para promover a célula de se estabelecer dentro das cavidades. As cavidades deve ser preenchido dentro de ~ 5 min. </li><li> para retirar excesso de células a partir de em torno das cavidades, inclinar cada prato de cultura de tecido no seu lado e suavemente dispensar ~ 400 ul de meio de cultura de células sobre a superfície do gel de colagénio. Aspirar o líquido e repita a lavagem mais 1-2 vezes, verificando os géis de colágeno sob o microscópio entre cada lavagem. </li><li> Após as células em excesso foram apuradas a partir de em torno das cavidades cheias de células no colagénio molde, colocar as placas de cultura de tecido para dentro de uma incubadora de cultura de células a 37 ° C durante 15 min. Em seguida, utilizando a pinça, inverter cuidadosamente as lamelas revestidas com colagénio de classe e colocá-las em cima dos moldes de colagénio cheias de células de modo a que o colagénio de as lamelas forma uma capa sobre as cavidades cheias de células. Incubar as amostras a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Uma vez que as tampas de colagénio aderiram ao molde de colagénio cheias de células, dispensar ~ 2-2,5 ml de meio de cultura de células lentamente através da lamela de vidro na parte superior dos géis. Cultura das amostras a 37 ° C durante 1-3 dias. Nota:24 horas após a sementeira inicial, os tecidos epiteliais podem ser tratadas com factores de crescimento tais como o factor de crescimento epidérmico (EGF), ou factor de crescimento de hepatócitos (HGF) para induzir a ramificação. </li></ol> 4. Imunofluorescência e Análise de Imagem <ol><li> Aspirar o meio de cultura de células a partir das placas de cultura de tecidos e adicionar a solução fixadora suficiente para cobrir os géis contendo as células. Incubar os pratos à temperatura ambiente durante 15 min num agitador a 200 rpm. </li><li> Aspirar o fixador, encher os pratos de cultura de tecidos com 1 x PBS, e incubar à temperatura ambiente durante 15 min num agitador a 200 rpm. Repita duas vezes para três lavagens totais. </li><li> Para rotular núcleos: Aspirar o PBS da placa de cultura de tecidos e substitua com uma solução de Hoechst. Incubar à temperatura ambiente durante 15-20 min. Para manchar para FAK ou outro marcador que é detectável com os anticorpos, avance para o Passo 4.5. </li><li> Aspirar a solução de marcação nuclear e lava-se a g contendo as célulasels três vezes com 1x PBS como no passo 4.2. amostras coradas pode ser armazenado em 1x PBS a 4 ° C até uso posterior. </li><li> Para corar para uma proteína de interesse: Aspirar o PBS a partir das placas de cultura de tecidos, adicionar 300 uL de 0,3% de PBST, e incuba-se a amostra à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Aspirar o PBS, cobrir os géis com tampão de bloqueio, e incuba-se num agitador (200 rpm) à temperatura ambiente durante ~ 4 horas. </li><li> Aspirar o tampão de bloqueio, cobrir os géis com solução de anticorpo primário, e incuba-se num agitador a 200 rpm durante a noite a 4 ° C. </li><li> Aspirar a solução de anticorpo primário, adicionar solução de PBST 0,3%, e incuba-se num agitador a 200 rpm à temperatura ambiente durante 30 min. Aspirar o PBST e repetir a cada 30 minutos para 3-4 hr. </li><li> Repita os passos 4.7 e 4.8, este tempo de incubação com a solução de anticorpo secundário. Enrole as placas de cultura de tecido com papel alumínio para evitar a fotodegradação do anticorpo secundário. Após a finaL lavagem, as amostras coradas pode ser armazenado em 1x PBS a 4 ° C até uso posterior. </li><li> Para visualizar amostras, usar um 10X / 0,30 NA objectivo focado no plano médio dos tecidos epiteliais. </li><li> Para visualizar núcleos celulares, amostras de imagem fixa marcadas com um marcador nuclear usando um 10x / 0,30 NA objetivo sob iluminação UV. </li><li> Para visualizar amostras coradas para uma proteína de interesse, utilizando uma imagem de NA objectiva 10X / 0,30 em um microscópio de fluorescência invertido. </li><li> Para criar mapas de coloração das proteínas de tecidos múltiplos (normalmente 50 ou mais) de geometria inicial idêntica frequência, primeira importação cada uma das imagens usando o software de análise de imagem padrão (veja Materiais) e convertê-los para 8 bits em tons de cinza. </li><li> Para limiar essas imagens, convertê-los para binário (ie, reticulação / preto e branco) através da definição de um ponto de corte em tons de cinza; valores em escala de cinza abaixo do limiar de se tornar preto, e aqueles acima do limiar de se tornar branco. Em seguida, combinarcada uma das imagens binárias individuais numa pilha única imagem. </li><li> Em seguida, registrar as imagens empilhados (ou seja, alinhar ou combiná-los) no software de análise. Muitos pacotes de software de análise de imagem vem com um plug-in de inscrição disponível gratuitamente. <ol><li> Usar cada imagem em uma pilha como um modelo para o alinhamento da imagem seguinte, de tal modo que as imagens em toda a pilha estão alinhadas por propagação. Finalmente, overlay (projeto) as imagens da pilha de imagens alinhadas com base na intensidade média para formar uma única imagem com um mapa frequência pixel. Essa imagem pode ser codificados por cores usando o software de edição de imagem de escolha 10,11. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Affolter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+signaling+in+the+regulation+of+branching+morphogenesis.">PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis.</a> Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+stages+in+mammary+gland+development:+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis.">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).</li><li>Fata, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK(ERK-1,2)+pathway+integrates+distinct+and+antagonistic+signals+from+TGFalpha+and+FGF7+in+morphogenesis+of+mouse+mammary+epithelium.">The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium.</a> Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).</li><li>Ip, M. M., Darcy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+mammary+primary+culture+model+systems.">Three-dimensional mammary primary culture model systems.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).</li><li>Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+three-dimensional+models+to+study+mammary+gland+branching+morphogenesis+and+functional+differentiation.">Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).</li><li>Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+geometry+determines+sites+of+mammary+branching+morphogenesis+in+organotypic+cultures.">Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures.</a> Science. 314 (5797), 298-300 (2006).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+patterns+of+mechanical+stress+are+required+for+branching+morphogenesis.">Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mechanical+strains+and+stresses+around+quiescent+engineered+three-dimensional+epithelial+tissues.">Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues.</a> Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).</li><li>Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+tensile+forces+drive+collective+cell+migration+through+three-dimensional+extracellular+matrices.">Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices.</a> Sci Rep. 5, 11458 (2015).</li><li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+regulates+branch+initiation+and+extension+of+cultured+mammary+epithelia+via+Akt+and+Rac1+respectively.">PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively.</a> Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).</li><li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane.">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li><li>Hirai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+functions+as+a+key+morphoregulator+for+mammary+epithelial+cells.">Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells.</a> J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).</li><li>Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stroma+induces+branching+morphogenesis+of+engineered+epithelial+tubules.">Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules.</a> Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the initial architecture make this system amenable for the study of branching morphogenesis of epithelial cells. There are several critical steps in the protocol. The first is lifting the PDMS molds straight upwards from the gelled collagen prior to cell seeding. Any horizontal movement during this step will distort the cavities, and they will no longer retain the desired geometry. Then, after the cavities have been seeded with cells, it is important to carefully wash off any excess cells that remain on the surface, as these may interfere with the behavior of the patterned tissues, particularly if they are very close to the tissues. Washing too rigorously, however, may result in cells being washed out of the cavities. Lastly, in the final micropatterning step when the cell-containing collagen gels are being immersed in culture medium, it is important to add the medium slowly and directly on top of the coverslip. Adding medium to the side of the dish away from the coverslip may result in detachment of the coverslip and the collagen lid. Each of these steps needs to be performed with care to achieve the best results.
Over the past few decades, several culture models have emerged for the study of epithelial morphogenesis, many of which involve the ex vivo culture of intact organs or explants of organs. Major advantages of culturing tissue taken directly from an animal are that tissue architecture remains intact and that cell-cell interactions are maintained. However, these models are not readily amenable to studies investigating the specific effects of a particular cell type or physical microenvironment. Additionally, organs and organ explants can be fragile and difficult to culture ex vivo. Others used primary mammary epithelial cells12, in which gene expression can be more readily manipulated, though this method does not conserve in vivo tissue architecture. Moreover, like intact organs, these cells can also be difficult to culture for long periods of time5. There is a need, therefore, for more robust culture models of epithelial morphogenesis that can be more precisely controlled and readily perturbed to gather reproducible data. 
A widely used 3D cell culture technique is the formation of epithelial cell clusters embedded in collagen or other ECM proteins11,13. Disadvantages of this technique, however, include the inability to precisely control or predict the location of clusters within the gel, cluster size and shape, and branching sites. In addition, it is difficult to manipulate or measure the mechanical cues experienced by cells in different regions of the tissue clusters. Engineered tissues enable better control of these parameters.
The engineered tissue protocol described here is an easy to use, versatile, and reproducible 3D cell culture method that eliminates the heterogeneity commonly found in ex vivo culture systems and 3D clusters. Such engineered cell culture models provide a platform for more precise control of physical and biochemical signals, and results can be easily combined with computational models to predict the effects of perturbations or measure cellular forces using techniques such as traction force microscopy (TFM)9,10. A caveat of the model system, however, is that it does not completely replicate the cellular, chemical, and physical microenvironment within the mammary gland in vivo. Nonetheless, essentially all parts of the system are modifiable: including the cells used (in which gene expression can also be altered by transfection), tissue geometry, ECM composition, and other biochemical factors (ex. growth factors). Primary mammary epithelial cells can also be cultured in this system; they form a lumen and undergo branching morphogenesis from the same locations as immortalized cell lines7. Moreover, the model can be modified to incorporate other cell types to more appropriately represent the native mammary gland microenvironment14, or to investigate the underlying mechanisms that give rise to any branched organ.

O desenvolvimento de tecidos epiteliais ramificada, conhecidos como ramificação morfogênese, é regulado por, e fatores ambientais físicas derivadas de células. Na glândula mamária, ramificação morfogênese é um processo iterativo pelo qual guiou a migração de células coletiva cria uma arquitetura de árvore. O primeiro passo é a formação de gemas primário dos canais de leite, seguido pela iniciação e alongamento ramo 1,2. Invasão de filiais no estroma circundante é induzida pela liberação sistêmica de hormônios esteróides na puberdade. Botões novos primários, em seguida, iniciar a partir das extremidades dos ramos existentes, e este processo continua a criar uma árvore epitelial 3. Embora muitos sinais bioquímicos importantes foram identificados, uma compreensão abrangente dos mecanismos celulares biológica que norteiam este processo de desenvolvimento complexo actualmente não existe. Além disso, estudos sobre os mecanismos sobre as influências das pistas específicas são difíceis de desconstruir a partir experimentos in vivo, perturbações e medições espaço-temporais como precisas muitas vezes não são possíveis. Tridimensionais técnicas de cultura (3D), como a cultura inteira órgão, Organóides primários, e os modelos de cultura de células, são ferramentas úteis para investigar sistematicamente os mecanismos subjacentes morfogênese do tecido 4-6. Estes podem ser particularmente úteis para determinar as influências de factores específicos individualmente, tais como as forças mecânicas e sinais bioquímicos, em uma variedade de comportamentos de células, incluindo migração, proliferação e diferenciação. 6 modelos de cultura de células modificadas geneticamente, em particular, facilmente permitir a perturbação de células individuais e o seu microambiente. Um tal modelo de cultura utiliza uma abordagem baseada em microfabricação para manipular tecidos epiteliais mamárias modelo 3D com estrutura controlada de modo consistente e reprodutível formam ramos que migram colectivamente quando induzida com o umfactores de crescimento ppropriate. A principal vantagem do modelo é a capacidade de manipular com precisão e medir os efeitos dos factores físicos e bioquímicos, tais como padrões de esforço mecânico, com alta confiança estatística. Esta técnica, em conjunto com a modelagem computacional, já foi usado para determinar as contribuições relativas de sinais físicos e bioquímicos na orientação do desenvolvimento normal dos tecidos epiteliais mamárias e outros epitélios ramificados 7-11. É apresentada aqui um protocolo detalhado para a construção destes tecidos modelo, que pode ser facilmente alargada a outros tipos de células e matriz extracelular (ECM) géis, e que serve como uma potencial ferramenta para o teste de agentes terapêuticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS curing agent</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithographically patterned silicon master</td>
			<td>self-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic weigh boat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-732-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm-diameter Petri dishes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>D-2550-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td>Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>American Safety Razor</td>
			<td>620179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:1 Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium : Ham&#8217;s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30023FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6634-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>221465-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine type I collagen (non-pepsinized)</td>
			<td>Koken</td>
			<td>IAC-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved stainless steel tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm-diameter tissue culture dishes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-2881-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3394-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter</td>
			<td>Bellco Glass Inc.</td>
			<td>Special order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% 1X Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300260</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HGF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H 9661</td>
			<td>Resuspended in dH2O at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse FAK antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AMO0672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for color-coding pixel frequency maps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI (ImageJ)</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering three-dimensional epithelial tissues embedded within extracellular matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

Esquemática geral de microfabricação tecido epitelial mamário Um esquema geral do processo de microfabricação descrição do fluxo de trabalho experimental é mostrado na Figura 1. O resultado final é uma série de tecidos epiteliais de geometria e espaçamento idênticos que estão completamente encaixadas dentro de um gel de ECM. Uma experiência representativa utiliza rato EpH4 células epiteliais mamarias cultivadas num gel de colagénio de tipo I bovino a uma concentração de 4 mg / ml. Para garantir a mais alta qualidade de tecidos artificiais, as técnicas descritas no protocolo deve ser acompanhado de perto. Figuras 2A e 2B mostram vistas de baixa e alta ampliação de matrizes de poços retangulares que foram moldados em um colágeno tipo I gel antes da semeadura de células. A forma das cavidades é determinada pela forma das características do mestre de silício. É importante para levantar the PDMS molde recta a partir do colagénio de modo a não falsear a geometria da cavidade. A Figura 2C mostra cavidades rectangulares em um colagénio do tipo I de gel que foram enchidos com células epiteliais mamarias (excesso de células foram lavadas para fora da superfície do colagénio). Neste exemplo, cada 200 um x 50 um poço rectangular contém cerca de 80-100 células. A adição de factores de crescimento induz a morfogénese 24 horas após a sementeira, os tecidos podem ser tratados com factores de crescimento tais como HGF ou EGF e cultivadas durante vários dias para modelar ramificação morfogénese. Tipicamente, ramos começam a formar tão cedo quanto 4 horas após a estimulação do factor de crescimento. A Figura 3A mostra resultados representativos de tecidos epiteliais mamárias rectangulares dentro de um gel de colagénio de tipo I de 24 horas após o procedimento de microfabricação, após o que CELLS aderiram ao colagénio e um ao outro. Sem ramos são observados antes da adição do factor de crescimento. A figura 3B mostra um tecido rectangular representativa que foi submetido a ramificação 24 horas após a adição de HGF a 10 ng / ml. Neste caso, ramos ocorrem nas extremidades dos tecidos (em oposição ao meio), em que as células sofrem o maior esforço mecânico 9. Múltiplos tecidos da geometria inicial idêntica no mesmo gel pode então ser trabalhada para determinar as médias populacionais de localização de agências e comprimento dos ramos, permitindo a análise de alto rendimento. Imunofluorescência para visualizar localização de proteínas Imunofluorescência das matrizes de tecido no modelo de cultura permite-nos determinar a localização de proteínas no interior de um tecido com alta confiança estatística. A Figura 4A mostra represenresultados sentativas de um tecido epitelial ramificação rectangular mamária coradas para quinase de adesão focal (FAK). A criação de mapas de tecidos de geometria idêntica de frequências pode ser utilizada para visualizar a localização espacial média de proteínas de interesse dentro dos tecidos, o que pode ser comparado com a localização de outras proteínas, bem como a actividade de ramificação. Figura 4B mostra um mapa frequência de coloração média FAK por 50 tecidos que apresentam FAK enriquecimento nas extremidades curtas de tecidos retangulares, onde ramificação ocorre normalmente. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático delineando o processo de microfabricação. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54283/54283fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2. Imagens tomadas durante o processo de microfabricação. (A) e baixa (B) e ampliação imagens de alto-contraste de fase de cavidades retangulares em colágeno tipo I criado usando um molde elastomérica PDMS. (C) As cavidades a partir de (A) e (B) são cheios com células epiteliais mamarias. Barras de escala, 100 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54283/54283fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig3.jpg" /> Figura 3. microfabricated tecidos sofrem ramificação morfogênese. (A) imagem de contraste de fase de um representante rectangular de tecidos de 24 horas após a microfabricação. Imagem de contraste de fase de uma re (B)tecido rectangular presentativa que começou a ser submetido a ramificação 24 h depois da adição de HGF a 10 ng / ml. setas brancas indicam ramos recém-formados. Barras de escala, 100 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54283/54283fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54283/54283fig4.jpg" /> Figura 4. Imunofluorescência coloração dos tecidos microfabricated. (A) imunofluorescência para FAK num tecido epitelial mamária após o início do ramo. (B) Um mapa frequência de coloração média FAK em 50 tecidos. Barras de escala, 100 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54283/54283fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix at JoVE.com

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Este manuscrito descreve uma técnica suave baseado em litografia para engenharia matrizes uniformes de tridimensional (3D) de tecidos epiteliais geometria definida rodeados por matriz extracelular. Este método é favorável a uma ampla variedade de tipos de células e contextos experimentais e permite o rastreio de alto rendimento de réplicas idênticas.

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

engineering-three-dimensional-epithelial-tissues-embedded-within

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K visualizações.  Princeton University.  Este manuscrito descreve uma técnica suave baseado em litografia para engenharia matrizes uniformes de tridimensional (3D) de tecidos epiteliais geometria definida rodeados por matriz extracelular. Este método é favorável a uma ampla variedade de tipos de células e contextos experimentais e permite o rastreio de alto rendimento de réplicas idênticas. 

Vídeo: Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bioengenharia

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Em células vivas, imagens de células que expressam proteínas fluorescentes Migrando-marcado em uma matriz tridimensional

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Design e Construção de Matriz Extracelular Artificial (MECa) Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para engenharia de tecidos da pele

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Repovoamento celular epitelial e Preparação de Rodent Matriz Extracelular Andaimes para o desenvolvimento do tecido renal

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Produção de fibras da matriz extracelular através de cultura de células de membrana de fibra oca Sacrificial

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Preparação de Microambientes de Matriz Extracelular Incapaz para avaliar especificação de fenótipo celular schwann

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Geração de um modelo simplificado de pele em um chip tridimensional em uma plataforma microfluida micromaquinda

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...