This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.

1. DNA Biotinilaï¿½o <ol><li> A biotinilação de DNA de extremos cerses usando transferase terminal (TdT) Nota: O uso de T4 DNA (166 kpb), que é um DNA de extremos cerses. <ol><li> Adicionar 5 uL de 2,5 mM de CoCl2, 5 ul de 10 × tampão de reacção, 0,5 ul de 10 mM de biotina-11-dUTP, 0,5 ul de transferase terminal (10 unidades) e 0,5 ul de ADN de T4 (0,5 ug / uL) à mistura de reacção. Adicione a um volume final de 50 ul pela adição de 38,5 ul de água. </li><li> Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 1 h. Nota: o tempo de reacção prolongado pode produzir ADN de dupla presa, ou seja, é possível que biotinas são marcados em ambas as extremidades. </li><li> Parar a reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M, pH 8. </li><li> Manter o tubo a 4 ° C. </li></ol></li><li> A biotinilação de ADN ended pegajoso utilizando ADN ligase Nota: O uso λ ADN (48,5 kpb), que é um ADN pegajosa-fim. &lt;ol&gt; <li> Adicionar 1 ul de DNA-ligase de T4, 5 uL de tampão de ligação 10 ×, 1 ul de 25 ng / ul de ADN de fago λ, e adicionar 43 ul de água para fazer um volume final de 50 ul. </li><li> Manter o tubo a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. funcionalizados A derivação de superfície Nota:. A fim de amarrar uma extremidade de uma molécula de ADN na superfície de vidro, um grupo de amina primária é silanizada sobre uma lamela, seguido por revestimento por biotina-PEG como se mostra na Figura 1 Este processo de PEGilação é importante para a imagiologia de DNA única molécula porque pode diminuir significativamente o ruído aleatório criado por ligação de moléculas indesejáveis ​​sobre a superfície. <ol><li> Limpeza Piranha Nota: As soluções Piranha reagir violentamente com materiais orgânicos, pelo que deve ser manuseado com cuidado, seguindo as orientações de segurança adequadas. <ol><li> Lugar lamelas em um rack de politetrafluoretileno (PTFE), e mantê-los by PTFE veda-rosca longitudinalmente, metade na borda das superfícies e metade na prateleira. Após acondicionamento, deixar uma parte longa (~ 5 cm) de fita adesiva para lidar com a grade durante o procedimento de limpeza. </li><li> Encher um copo de vidro de 1 L com 350 ml de H 2 SO 4 e 150 ml de H 2 O 2 para fazer a solução piranha numa hotte. Coloque o rack em solução piranha, durante 2 horas. </li><li> solução vazia piranha da taça, e lamelas enxaguar abundantemente com água deionizada até que o pH da água no copo atinge neutro. Utilizar as tiras de papel de pH. </li><li> Sonicar os suportes de lamelas na água proveta contendo, durante 30 min. água vazia do copo imediatamente antes amino silanização. Use 75 W de potência sonicação de limpar e derivar os substratos de vidro. </li></ol></li><li> Aminosilanization na superfície de vidro <ol><li> Adicionar 2 ml de N - [3- (trimetoxissilil) propil] etilenodiamina e 10 ml de ácido acético glacial em 200 mlde álcool metílico em um recipiente de polipropileno limpo para preparar a solução aminosilanization. </li><li> Coloque lamelas limpas no recipiente de polipropileno. Agite-los a 100 rpm e a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Sonicar a proveta com lamelas derivatizadas durante 15 minutos a 75 W. agitá-los a 100 rpm e à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min. </li><li> Esvaziar a solução a partir do recipiente, e enxaguar lamelas cuidadosamente, uma vez com álcool metílico, e duas vezes com álcool etílico. lamelas de loja em álcool etílico e usá-los dentro de duas semanas. </li></ol></li><li> PEGilação da lamela <ol><li> Adicione 10 ml de bicarbonato de sódio 0,1 M (NaHCO3). Filtra-se a solução com um filtro de seringa de 0,22? M. </li><li> Dissolve-se 2 mg de carbonato de biotina-PEG-succinimidil (biotina-PEG-SC) e 80 mg de valerato de PEG-succinimidilo (mPEG-SVG) em 350 ul de NaHCO3. Use um tubo de proteção contra a luz. </li><li> Vortex do tubo vigorosamente durante 10 segundo, e centrifuga-se que a 10.000 × g durante 1 min para remover bolhas. </li><li> Lavar uma lâmina de vidro com acetona, seguido por lavagem com álcool etílico. Permitir o slide secar ao ar completamente. </li><li> Colocar uma gota (50 uL) de solução de PEG sobre a lâmina de vidro limpa. Cubra a gota suavemente com um amino silanizada lamela, sem gerar bolhas. </li><li> Colocar as lâminas para 3 horas durante a noite em um escuro, bem nivelado câmara húmida à temperatura ambiente. Use um suporte de ponta de pipeta vazia como a câmara, com água na parte inferior. Selar solução de PEG residual no tubo e mantê-lo a 4 ° C. </li><li> Lavar as lamelas PEGylated cuidadosamente com água deionizada. Armazená-lo em um lugar escuro e seco até o uso. </li></ol></li></ol> 3. Montagem de uma câmara de fluxo <ol><li> Fabricar um suporte de acrílico perfurados, como na Figura 2. Assegure-se que o diâmetro do tubo de inserção é 0,762 milímetros, e designa um orifício de entrada é um e o outro éuma saída (Figura 2). </li><li> Coloque tiras adesivas de dupla face de fita (largura 5-6 mm) sobre um suporte acrílico (Figura 2), alinhando perpendicularmente a um orifício de entrada e de saída, não perturbando quaisquer furos de canal. Use estas tiras de fita como paredes multi-canal para fazer câmaras. Esfregue a fita usando uma ponta de pipeta. </li><li> Coloque uma lamela PEGylated na parte superior para fazer câmaras de fluxo, com o lado da PEGylated bruços. </li><li> Para evitar qualquer solução de vazamento, pressione o topo de uma lamela sobre a área onde fitas de dupla face são colocados. Adicionar cola epoxi de secagem rápida, para fechar as extremidades da câmara na parte superior e na parte inferior (cor amarela na Figura 2). </li><li> Conectar uma peça curta (2,5 cm) de tubo (diâmetro externo, OD, 0,042 &quot;) para uma seringa estanque de gás e vedar a junta com cola epóxi. </li><li> Conecte um longo tubo flexível (OD: 0,03 &quot;) para a tubulação ligada à seringa e selar a junção com cola epóxi. </li><li> Encha o tubing ligada à seringa com água DI. Certifique-se de que não há bolha de ar. </li><li> Insira a tubulação no orifício da câmara de fluxo selada com cola epóxi. </li><li> Coloque uma ponta amarela (200 ul ponta) do outro furo como um reservatório. </li></ol> 4. Amostra Carregando no fluxo Câmara Nota: neutravidina pode ser substituído por outras proteínas avidina, tais como estreptavidina. Todas as reacções podem ser realizadas à temperatura ambiente, a menos que seja mencionado. Tome solução da amostra em uma ponta amarela, e instalar a ponta com a solução para o buraco do suporte de acrílico (Figura 2b). <ol><li> Definir a taxa de fluxo da bomba de seringa a 50 ul / min. Carga 20 ul de proteína de avidina (25 ug / ml em solução T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), e mantê-lo durante 10 min. </li><li> Carga 20 l de oligodesoxinucleï¿½idos biotinilados (100 mm em 1 × TE), e mantê-lo por 10 min. Se transferase terminal é utilizado, pule o carregamentode oligodesoxinucleï¿½idos. </li><li> Carga de 20 uL de solução de ADN a partir do Passo 1 para a câmara de fluxo a uma taxa de fluxo de 10 uL / ​​min, e mantê-lo durante 30 min. </li><li> Lava-se a câmara de fluxo com 1 x TE, e carregar 40 ul de FP-DBP de 10 (~ 80 nM). </li><li> Observar ADN sob um microscópio de fluorescência com o fluxo contínuo de moléculas de coloração em 1 × TE numa lente objectiva 60X. Use 488 nm laser em estado sólido para excitação do FP (eGFP) -DBP. Para a completa extensão de moléculas de DNA, aplicar diferentes taxas de fluxo de acordo com os comprimentos de DNA usadas. Por exemplo, aplicam-se 50? L / min durante 48,5 kpb de ADN λ, e 100 ul / min durante 166 kpb de ADN de T4. <ol><li> Para reciclagem do titular do acrílico, mergulhe câmaras de fluxo montados em uma solução de detergente doméstico 12. Retirar fitas ou epóxi com uma lâmina de barbear e esfregar com as mãos para levá-los completamente desligado. Desobstruir furos com agulhas de seringa. Mantenha os titulares em água deionizada até à sua utilização. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Aqui nós apresentamos uma plataforma para visualização de moléculas de DNA longos biotinilados para a ancoragem em superfícies. Nós relatamos uma abordagem para moléculas de DNA amarrados em uma superfície revestida de proteína avidina com albumina sérica bovina biotinilado. 6 Na abordagem anterior, verificou-se uma questão crucial de DNA photo-clivagem causada por corantes bis-intercalação que mancham moléculas de DNA amarrados na superfície. Como estes fluoróforos continuamente animado têm uma elevada probabilidade de atacar uma espinha dorsal de fosfato de DNA, 9 o poder de luz de excitação teve que ser minimizado para evitar photo-clivagem. A fim de ultrapassar este inconveniente, foi desenvolvido por engenharia genética de proteínas fluorescentes com capacidade de ligação ao ADN (FP-PAD) para coloração de ADN sem a foto-clivagem. 10 Observou-se coloração de DNA fiáveis ​​sobre as superfícies de proteínas revestidas com avidina. No entanto, esta plataforma tinha um outro problema da agregação indesejável de proteínas fluorescentes nasuperfície da proteína, resultando em aumento de ruído de fundo. É essencial para minimizar este ruído aleatório para a análise de DNA única molécula para melhorar o contraste de ADN e as proteínas a partir do fundo. A utilização de FP-PAD, por conseguinte, requer passivação de superfície para evitar a proteína fluorescente de ser adsorvido na superfície. PEG pode ser um candidato poderoso para esta finalidade. 12 Assim, foi utilizado PEG-biotinilado, o que aumentou dramaticamente a relação sinal-ruído para as moléculas de ADN de imagem FP-PAD coradas amarrados na superfície. Há várias etapas críticas e notas neste método de rendimentos mais elevados. A fim de amarrar uma extremidade de uma molécula de ADN sobre uma superfície de vidro, um grupo de amina primária é silanizada sobre uma lamela, seguido por revestimento por biotina-PEG como se mostra na Figura 1. Este processo de passivação de superfície é crítica para a imagiologia de DNA única molécula porque pode diminuir significativamente adsorção aleatório de geração de ruído nas superfícies.Portanto, aminosilanization durante a noite e PEGylation são fortemente recomendados. Além disso, a limpeza da lâmina de vidro, bem como o vidro de cobertura com uma solução piranha pode reduzir ainda mais o ruído de fundo. Um oligonucleótido biotinilado deve ter um grupo fosfato na extremidade 5 &#39;, de modo a ligá-lo a 3&#39; grupo hidroxilo de uma molécula de DNA grande. A sequência do oligonucleótido biotinilado é 5&#39;-P-GGGCGGCGACCT-TEG-biotina-3 &#39;para amarrar ADN λ. A solução de DNA λ tem de ser carregada logo após a preparação da solução de ADN λ (descrito em 1.1), por causa do ADN λ forma frequentemente concatemeros com armazenamento de longo tempo. Para ADN de extremidades lisas, tais como ADN de T4, de transferase terminal pode adicionar dUTPs biotinilados em ambas as extremidades de ADN, sem qualquer especificidade. Assim, o tempo de reacção de transferase terminal de tem de ser cuidadosamente ajustada em torno de uma hora, de outra forma estendida de reacção pode produzir ADN duplamente marcada (isto é, ambas as extremidades estão marcados com biotina). em addsição para ADN virai, tal como λ e T4, quaisquer tipos de ADN pode ser utilizada nesta plataforma. No entanto, é recomendado o uso de fragmentos de ADN genómico gigantesco após digestão por enzimas de restrição raro-cortador tais como SwaI ou NotI. taxas de fluxo diferentes são aplicadas para diferentes comprimentos de DNA. Normalmente, as moléculas de ADN mais longas requerem caudais mais rápidos para esticar completamente as moléculas de ADN, para coincidir com o comprimento do contorno exacto. Por exemplo, λ ADN pode esticar até 16,5 mm, o que corresponde ao valor calculado de 0,34 nm x 48502 pb. É muito importante para preparar de fresco todos os materiais, em particular todas de proteínas e PEG. Por exemplo, neutravidina facilmente perde a sua função de ligação biotinas se ele é armazenado como uma solução diluída. Para soluções de PEG, o pH é crítica para conjugar os grupos funcionais de uma amina primária e N-hidroxissuccinimida. Portanto, recomenda-se preparar de fresco todos os materiais, pelo menos, a cada semana. A visualização das grandes moléculas de DNA amarrados na superfície é uma plataforma versátil para ser aplicado para uma variedade de aplicações, tais como genómica, epigenomics, estudos bioquímicos para ADN e interacção de proteína, e estudos física de polímeros. No entanto, esta abordagem está actualmente limitada apenas para modelar sistemas que utilizam moléculas de ADN relativamente simples e bem conhecidas, tais como o genoma viral. Para ser estendido para o genoma humano e epigenoma, é extremamente importante para estabelecer uma plataforma robusta, confiável e simples para uso prático. Ao superar DNA photo-clivagem induzida por luz e prevenção da adsorção aleatória de proteína fluorescente na superfície, esta plataforma, portanto, proporciona imagens nítidas e de alto contraste para DNA alongada com os fluxos de cisalhamento.

Visualização de moléculas de DNA grandes amarrados em superfícies de vidro ou talão tem sido utilizado para investigar as interações DNA-proteína, dinâmica de proteínas em substrato de ADN, 1,2 e física de polímeros. 3,4 Uma plataforma de moléculas de DNA grandes single-tethered tem um pouco distinta vantagens em comparação com outros métodos de imobilização de DNA. 5 primeiro, uma grande molécula de ADN amarrado na superfície tem uma conformação em espiral aleatória natural sem um fluxo de cisalhamento, o que é criticamente importante para uma proteína de ligação de ADN de reconhecer o seu local de ligação. Em segundo lugar, é muito fácil de alterar o ambiente químico em torno de moléculas de DNA para uma série de reacções enzimáticas em uma câmara de fluxo. Em terceiro lugar, um fluxo de cisalhamento de microfluidos induz ADN molecular do alongamento até 100% do comprimento do contorno completo, o que é muito difícil de conseguir utilizando o alongamento do ADN as abordagens alternativas, tais como a superfície de imobilização 6 e confinamento nanochannel. 7 Um totalmente stretchemolécula de DNA d também fornece informação de posição que pode ser útil para monitorizar os movimentos enzimáticas no mapa genómico. No entanto, a abordagem DNA tethering tem uma lacuna crítica em que a tintura a intercalação, tal como YOYO-1 geralmente provoca moléculas de DNA amarrados para ser facilmente quebrado pela luz de excitação de fluorescência. De um modo geral, moléculas de DNA grandes têm de ser marcadas com um corante fluorescente para a visualização sob um microscópio fluorescente. Para este efeito, YOYO-1 ou outros corantes da série TOTO são usadas principalmente porque estes corantes fluoresce apenas quando intercalar de ADN de cadeia dupla. 8 No entanto, é bem conhecido que a bis-intercalantes corante faz com que o ADN induzida pela luz foto-clivagem porque da intercalação de fluoróforos. 9 Além disso, as moléculas de ADN fluorescentes coradas amarrados na superfície são mais frágeis uma vez que os fluxos de cisalhamento pode exercer forças de quebra no movendo-se livremente moléculas de ADN. Por isso, desenvolvemos FP-DBP como um romance Dcorante proteína NA-coloração para imagiologia de grandes moléculas de ADN na superfície amarrados. A vantagem da utilização de FP-PAD é que ela não provoca foto-clivagem das moléculas de ADN ao qual se liga. 10 Além disso, FP-PAD não aumenta o comprimento do contorno do DNA, enquanto que corantes bis-intercalantes aumentar o comprimento do contorno por cerca de 33%. Este método de vídeo introduz a abordagem experimental para prender moléculas de DNA grandes a uma superfície PEG-biotina. A Figura 1 ilustra as diferentes abordagens de amarrar DNA com extremidades sem corte e extremidades pegajosas. Assim, este método de coloração pode ser aplicado a qualquer tipo de molécula de ADN. A figura 2 mostra uma representação esquemática da montagem de câmara de fluxo que pode ser controlada por uma bomba de seringa para gerar fluxos de cisalhamento para esticar moléculas de ADN, bem como a carga química e enzima soluções. a Figura 3 demonstra micrografias das moléculas de ADN esticadas inteiramente amarrados no PEGylatsuperfície ed 11 e corados com FP-PAD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="925">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">1. DNA Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Terminal Transferase</td>
			<td style="width:167px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:133px;">M0315S</td>
			<td>Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Biotin-11-dUTP</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:133px;">R0081</td>
			<td>Biotin-ddNTP is also available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">T4GT7 Phage DNA</td>
			<td style="width:167px;">Nippon Gene</td>
			<td style="width:133px;">318-03971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">E6758</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:167px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:133px;">M0202S</td>
			<td>Provided with 10x reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:287px;">Lambda Phage DNA</td>
			<td style="width:167px;">Bioneer</td>
			<td style="width:133px;">D-2510</td>
			<td>Also available at New England Biolabs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:925px;">2. Functionalized Surface Derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">2.1) Piranha Cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Coverslip</td>
			<td style="width:167px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:133px;">0101050</td>
			<td>22x22 mm, No. 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Teflon rack</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Custom Fabrication</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">PTFE Thread Seal Tape</td>
			<td style="width:167px;">Han Yang Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">3032292</td>
			<td>Teflon&#8482; tape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Sulferic acid</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">S280823</td>
			<td>H2SO4, 95 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">H290423</td>
			<td>H2O2, 35 % in water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sonicator</td>
			<td style="width:167px;">Daihan Scientific Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">WUC-A02H</td>
			<td>Table-top Ultrasonic Cleaner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">2.2) Aminosilanization on Glass Surface</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] 
			ethylenediamine</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">104884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Duksan Chemicals</td>
			<td style="width:133px;">414</td>
			<td>99 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Methyl Alcohol</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">M300318</td>
			<td>99.9 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Polypropylene Container</td>
			<td style="width:167px;">Qorpak</td>
			<td style="width:133px;">PLC-04907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ethyl Alcohol</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">A300202</td>
			<td>99.9 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">2.3) PEGylation of the coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Syringe Filter</td>
			<td style="width:167px;">Sartorius</td>
			<td style="width:133px;">16534----------K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Biotin-PEG-SC</td>
			<td style="width:167px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:133px;">Biotin-PEG-SC-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">mPEG-SVG</td>
			<td style="width:167px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:133px;">MPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetone</td>
			<td style="width:167px;">Jin Chemical Co. Ltd.</td>
			<td style="width:133px;">A300129</td>
			<td>99 % Purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:167px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:133px;">1000612</td>
			<td>~76x26x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">3. Assembling a Flow Chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acrylic Support</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Custom Fabrication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Double-sided Tape</td>
			<td style="width:167px;">3M</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>Transparent type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Quick-dry Epoxy</td>
			<td style="width:167px;">3M</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td style="width:167px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:133px;">06417-11, 06417-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Gas Tight 250 &#181;l Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Hamilton</td>
			<td style="width:133px;">81165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:167px;">New Era Pump Systems Inc.</td>
			<td style="width:133px;">NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:925px;">4. Sample Loading into Flow Chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Neutravidin</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:133px;">31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Tris base</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">T1503-5KG</td>
			<td>Trizma base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:133px;">IX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:167px;">Q Imaging</td>
			<td style="width:133px;">Rolera EM-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Solid-state Laser (488 nm)</td>
			<td style="width:167px;">Oxxius</td>
			<td style="width:133px;">LBX488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Alconox</td>
			<td style="width:167px;">Alconox Inc.</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

A Figura 1 mostra dois métodos de ADN de ancoragem diferentes dependendo das estruturas terminais da molécula de DNA. A Figura 1a ilustra a forma como as moléculas de ADN casquilhos pegajosos são hibridados com os oligonucleótidos biotinilados complementares, que são imobilizadas na superfície de PEG a revestida com avidina. A Figura 1B mostra a adição de biotinilado ou ddNTP de dNTP para o grupo hidroxilo 3 &#39;de um ADN de extremos cerses por transferase terminal. Nós adicionamos elementos de ligação flexíveis entre moléculas de DNA e biotina. Isto aumentou a eficiência de ligação e de ligação avidina-biotina para proporcionar espaço suficiente para as reacções. A Figura 1C mostra a representação esquemática geral para amarrar ADN na superfície de PEG a revestida com avidina. A Figura 2 ilustra o conjunto da câmara de fluxo, juntamente com um suporte de acrílico. Em comparação com glass / lâminas de vidro de quartzo, um suporte de acrílico feito por medida simplifica a preparação da câmara de fluxo por microscopia de epi-fluorescência. 12 A câmara de fluxo permite a mudança instantânea de condições de tampão para reacções enzimáticas, 6 e as moléculas de ADN de alongamento. A Figura 3 demonstra DNA single-tethered e T4 λDNA coradas com FP-PAD. cisalhamento microfluídico flui moléculas de DNA individuais alongadas até comprimentos de contorno completo, tal como 16,5 mm (DNA 48,5 kb λ x 0,34 nm) e 56,4 mm (166 kb de ADN T4 x 0,34 nm). Fomos capazes de repetir DNA alongamento e relaxamento várias vezes durante um período prolongado (por exemplo, meia-hora), já que utilizou FP-PAD que não cause foto-clivagem. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54141/54141fig1.jpg" /> Figura 1. Ilustração esquemática de tethering DNA. a) Um sADN ended tique é hibridado com um oligonucleótido biotinilado complementar. Trietileno-glicol é um agente de ligação flexível entre o oligonucleótido e biotina. B) biotinilado dNTP é adicionado a uma extremidade romba de ADN de cadeia dupla, por transferase terminal. Polycarbon espaçador (11 átomos) é um elemento de ligação flexível entre dNTP e biotina. C) ADN biotinilado é ancorada a uma proteína de avidina, que é ligado a um PEG biotinilado ligado de forma covalente à superfície do vidro. A proporção de PEG biotinilado para PEG normal foi de 0,025 (01:40). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54141/54141fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54141/54141fig2.jpg" /> Figura 2. Fluxo de câmara. a) câmara de fluxo consiste em um suporte de resina de ácido acrílico, tiras de fitas dupla face e uma PEGylated cobrir deslizamento. O titular de acrílico de dimensões 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x W x H), foi fabricado com corte a laser b) Vista lateral da câmara de fluxo:. Perfurado buracos são uma porta de entrada no qual uma ponta amarela é instalado para um reservatório tampão, e uma porta de saída que está conectado a um tubo controlado por uma bomba de seringa. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54141/54141fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54141/54141fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens microscópicas fluorescentes de moléculas de DNA esticadas corados com FP-PAD. a) bacteriófago λ ADN (48,5 kpb) preso na superfície após a ligadura com oligonucleótidos complementares biotinilados. b) do bacteriófago T4 de ADN (166 kpb) preso na superfície após a adição de biotina com transferase terminal. setas indicadas mostrar molecul DNAES esticado até aos seus comprimentos de contorno completo, tais como 16,5 ^ M para o DNA λ e 56,4 mm para ADN de T4. Barras de escala:. 10 m <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54141/54141fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

A visualização de tethered-grande superfície moléculas de ADN com um ADN de proteína fluorescente Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K visualizações.  Sogang University. We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows. 

Vídeo: Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologia

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

DNA-Stable Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

Visualização de replicação de DNA no DT40 Vertebrados Modelo de Sistema utilizando a técnica de DNA Fibra

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

Preparação de ADN de poliacrilamida reticulada-hidrogéis

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

De gravidade reduzida Manifestações ambiente de hardware de uma tecnologia de mistura de fluxo Cytometer e Companion microfluídicos Prototype Miniaturized

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...