This work was supported by the Auburn University fund FOP 101002-139294-2050.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo IACUC da Universidade de Auburn, Auburn, Alabama. 1. Preparação de Meios de Cultura, pratos e Cultura bacteriana <ol><li> Inocular 10 ml de caldo nutriente num frasco com uma única colónia de cultura BSB3 Bacillus subtilis, cultivadas durante a noite numa placa de agar nutriente. </li><li> Adicione 500 ml de meio de esporulação 19 (por litro: Bacto Caldo Nutriente, 8 g; 10% (w / v) de KCl, 10 mL; 1,2% (w / v), MgSO 4 x 7H 2 O, 10 mL; agar, 15 g) e autoclave a 121 ° C durante 20 min. Deixar arrefecer até 50 ° C e adicione as seguintes soluções estéreis: 1 M Ca (NO3) 2, 1 ml; 0,01 M de MnCl2, 1 ml; 1 mM de FeSO4, 1 ml. </li><li> Arrefecer meio preparado a 40 ° C durante 20 min à temperatura ambiente e verter em 25 ml de cada uma das 20 placas de Petri estéreis no gabinete estéril. Deixe o meio solidificar durante a noite. </li><li> Espalhe 0,5 ml da cultura durante a noite de Bacillus subtilis BSB3 sobre a superfície do meio em placas de Petri. Incubar a cultura a 37 ° C durante 5 dias até 90% a esporulação. Revelar esporos fase brilhante por microscopia de alta resolução. </li><li> bactérias colheita por adição de 1 ml de fosfato estéril tamponado salino (PBS) para a placa de raspagem e bactérias a partir de uma superfície usando um espalhador de células estéril. Conserve a suspensão na geladeira até ser necessário. </li><li> Confirmar viabilidade das bactérias por plaqueamento de 0,1 ml de uma diluição adequada (10 -5 a 10 -6) de uma suspensão de bactérias em placas de meio de esporulação seguido de incubação durante 18 - 24 h a 37 o C. </li><li> Contagem das colónias bacterianas das placas utilizando um contador de colónias e calcular a título de bactérias na suspensão testado. Prepare suspensão bacteriana com a concentração final de 1 x 10 8 UFC / ml em PBS. </li></ol> 2. Os animais <ol><li> Usar 32 ratazanas macho Sprague-Dawley (250-300 g). Manter animais sob condições específicas isentos de agentes patogénicos com livre acesso a comida pellet padrão e água. Estabelecer uma temperatura média (21 ± 1 ° C), humidade (50 ± 5%) e um ciclo de luz-escuro de 12 h. </li></ol> 3. Design Experimental <ol><li> Iniciar o tratamento dos animais por sondagem oral de 11, após 2 dias de aclimatização. Use seringa com a agulha de gavagem oral. Trate 16 ratos com B. suspensão subtilis BSB3 (1 ml por ratazana) duas vezes por dia durante dois dias (grupo de B. subtilis). Tratar 16 ratos com PBS (1 ml por ratazana) duas vezes por dia durante dois dias (grupo PBS) (Figura 1). </li><li> Após o tratamento, subdivisão de cada grupo (8 ratos por grupo): Grupo 1- controle (PBS / sem estresse), Grupo 2- B. subtilis (B. subtilis / sem estresse), Grupo 3 tensão (PBS / estresse por calor) e Grupo B. 4- subtilis + estresse (B. subtilis estresse / calor). </li><li> Medir a temperatura rectal de cada rato usando um electronic termômetro digital. Manter os ratos dos grupos 1 e 2 à temperatura ambiente durante 25 min. Animais Local de grupos 3 e 4 em uma câmara climática a 45 o C e umidade relativa de 55% durante 25 min. </li><li> Em seguida, medir a temperatura rectal de cada rato em todos os grupos usando um termômetro digital eletrônico. Coloque todos os animais à temperatura ambiente durante 4 h. </li><li> Anestesiar ratos com isoflurano (2-4%) em um frasco selável anestesia e observar até os ratos são anestesiados profundamente (ausência de resposta ao aperto do dedo do pé). Euthanize ratos por decapitação rápida com uma guilhotina. </li><li> Recolha de sangue do tronco de cada rato 20 (15 - 16 ml) com as pipetas apirogénica apirogénica em tubos para se obter soro imediatamente e recolher amostras de sangue (7 ul) de cada rato com uma pipeta para exame microscópico. </li><li> Colocar os tubos com o sangue no frigorífico durante pelo menos 30 min para permitir a coagulação. Tubos de centrifugação a 20 ° C, 7,000 xg durante 10 min e rapidamenteremover o soro com uma pipeta. Soro alíquota obtidos a partir de cada rato em 50 volumes ul e armazenar a -20 ° C até ao ensaio. </li></ol> 4. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Cut / aparar todas as peles do abdômen e tórax do lado de baixo da carcaça com tesouras elétricas. Coloque a carcaça em um armário estéril e tratar a superfície raspada da carcaça com álcool a 70%. </li><li> Use um bisturi estéril para criar uma incisão na linha média do abdome. Remover fígado, nódulos linfáticos mesentéricos, baço e intestino delgado de cada rato usando uma pinça estéreis. </li></ol> 5. Análise de translocação bacteriana <ol><li> Coloque cada amostra de fígado, linfonodos mesentéricos e baço em tubos estéreis pré-pesado e pesar. Calcule o peso da amostra, tal como uma diferença entre o peso de um tubo com uma amostra e o peso de um tubo vazio. </li><li> Adicionar PBS estéril ao tubo para se obter uma diluição de 1:10 (w / v) da amostra e homogenhecer cada amostra com um homogeneizador de tecidos de vidro estéril para se obter uma suspensão homogénea de 21. </li><li> Fazer diluições em série (10 -1 a 10 -4) de cada amostra em PBS estéril. Placa de 0,1 ml de todas as diluições de todos os tecidos sobre a superfície de MacConkey e de 5% de agar de sangue e de agar de sangue de Brucella com hemina (0,005 g / L) e vitamina K1 (0,01 g / L) placas. </li><li> Incubar MacConkey de e 5% ágar sangue aerobicamente e Brucella placas de agar de sangue em condições anaeróbias a 37 o C 22. </li><li> Contagem das colónias de bactérias aeróbias, após 24 horas, e as colónias de bactérias anaeróbicas após 48 horas de incubação utilizando um contador de colónias. Expressar os resultados como o número de unidades formadoras de colónias (CFU) em um grama de tecido. </li></ol> 6. Análise histológica <ol><li> Retirar amostras do intestino delgado de cada rato pelo procedimento cirúrgico (passos 4,1-4,2). Fix amostras em fixador de Bouin, incorporar em parafina,preparar 6 mm seções e seções mancha com hematoxilina e eosina utilizando procedimentos padrão 23. </li><li> Use um sistema de microscópio de alta resolução para medição da altura das vilosidades intestinais e espessura total da mucosa em cada amostra (ampliação 100X) 24. Analise 4 amostras de cada rato e fazer pelo menos vinte medições em cada amostra. Expressar os resultados em micrômetros. </li></ol> 7. citocinas Assay <ol><li> Use kits de rato comerciais ELISA para IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ, e IL-10 para medir os níveis de citocinas no soro de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Gerar curvas padrão para cada conjunto de amostras testadas usando padrões para o kit relevante. Definir o nível de citocinas em cada amostra por comparação dos dados experimentais com a curva padrão apropriada. </li></ol> 8. Lipopolissacarídeo Assay <ol><li> Analisar nível de LPS no soro utilizando um kit de rato de LPS de acordo com ELISAo protocolo do fabricante. Estimar a concentração de LPS em amostras por comparação dos valores obtidos com os valores da curva padrão. </li></ol> 9. alta resolução Microscopia de Luz de Sangue <ol><li> Usar o sistema de microscópio descrito anteriormente 25,26. Use uma plataforma de isolamento de vibração como uma base para o sistema de microscópio e câmera de vídeo e de computador 25 para gravar as imagens ao vivo. Calibrar imagens de teste usando uma lâmina de Richardson como descrito anteriormente 27. </li><li> Coloque 7 l de sangue recentemente retirada de cada rato em uma lâmina de vidro, lamela, fotografar e gravar dez quadros de imagem de 72 × 53,3 mm 2 em cada amostra (ampliação 1,700X). </li><li> Medir a concentração de vesículas usando software que fornece imagens ópticas com vista directa de alta resolução em tempo real. Examine um mínimo de 20 quadros de imagem para cada condição experimental 28. </li></ol> 10. Statistiques <ol><li> Expresso de todos os valores como média e desvio padrão. Realizar a análise estatística e plotagem gráfico. Analisar os resultados obtidos com o teste t de duas amostras, definir o nível de significância de 0,05 para definir significância estatística. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A exposição a resultados de alta temperatura em condições graves de saúde 29. Prevenção e detecção precoce de complicações relacionadas ao estresse por calor são de importância vital 30. O protocolo apresentado pode ser usado para avaliar a eficácia de várias abordagens para a prevenção do stress térmico efeitos adversos. Passos críticos dentro deste protocolo incluem: o processo de tratamento de calor (45 ° C, 25 min); a utilização de materiais apirogênica durante a coleta e processamento de sangue para evitar a contaminação com enterotoxinas; mantendo alíquotas de soro a -20 ° C para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento; e seguindo o procedimento estéril durante a análise de translocação bacteriana. O protocolo foi criado para o tratamento oral de ratos com bactérias para a prevenção de efeitos colaterais de stress de calor. Para outras vias de administração e outros compostos, este protocolo pode ser modificado. Por exemplo, o tempo de trratamento antes estresse térmico pode ser estendido. A administração oral pode ser alterado para administração rectal. Bacillus subtilis bactérias foram utilizadas para a prevenção de complicações de stress de calor por meio de tratamento oral de animais antes da exposição a uma temperatura elevada. A fim de curar complicações de stress de calor, este protocolo pode ser modificado através da utilização de bactérias para o tratamento de animais após exposição ao calor. Foi demonstrado que a elevação da temperatura do corpo causou um aumento de eritrócitos vesiculação, e este foi completamente prevenida pelo pré-tratamento com B. bactérias subtilis. Assim, o aumento da concentração de vesículas no sangue durante a exposição ao calor pode indicar o nível de stress de calor e fornece evidências de diagnóstico para a estabilidade de eritrócitos e a sua resistência ao calor. É também um teste muito útil e rápida para a avaliação da eficácia do tratamento preventivo contra as complicações de stress de calor. A indução óproteínas de choque térmico F como um marcador de stress térmico foi anteriormente discutido 30, mas esta aproximação é consumidora de tempo e não pode ser utilizado para o diagnóstico em tempo real de resposta a stress térmico. A abordagem apresentada para a prevenção do estresse térmico efeitos adversos é simples, eficaz e não requer equipamento adicional ou instalações especiais. aplicação futura deste trabalho vai ajudar a compreender os mecanismos de proteção contra complicações de estresse de calor e caracterizar os novos procedimentos para essa proteção. Este método é de importância para os trabalhadores rodoviários, militares, atletas - grupos de pessoas que estão em risco de insolação durante atividade física intensa ao ar livre 29. A abordagem proposta permite examinar o nível de estresse de calor e avaliar vários métodos para proteger a saúde das pessoas que trabalham em condições extremas.

Different stressors affect human and animal health. Temperature is one of the most stressful factors, causing chronic, acute and even lethal illnesses1. Changes in intestinal morphology and a loss of gut barrier integrity after heat stress were documented in many cases2,3. This protective barrier is responsible for defense against translocation of gut bacteria and their toxins, in particular lipopolysaccharides (LPS), from the lumen to the internal circulation4,5. Stability of the gut microbiota significantly influences intestinal barrier function, the immune response of the host, and tolerance to stress conditions6. Thus, modulation of the intestinal microbiota can provide a novel approach for prevention of stress-related adverse effects. 
Beneficial bacteria have been used as a promising strategy to modify the gut microbiota for successful management of various clinical conditions, such as diarrhea, inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, metabolic disorders7-10. Probiotic effects of beneficial bacteria include production of essential metabolites to support intestinal health, stimulation of the immune system, promotion of lactose tolerance, restoration of epithelial dysfunction. Probiotics were effective in prevention of the stress-related complications in vitro and in animal models11,12. 
Researchers have given more attention to Bacillus bacteria as probiotics because these bacteria support intestinal homeostasis13 and have beneficial effects on the host14. Our previous data demonstrated high efficacy of Bacillus probiotics against pathogens in vitro15,16 and in clinical trials17,18. Here, we aim to evaluate the preventive effect of B. subtilis BSB3 strain against complications after heat stress.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich,&amp;nbsp;St. Louis, MO</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol&amp;nbsp;</td><td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA&amp;nbsp;</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>97064-334</td><td></td></tr><tr><td>MacConkey agar plates</td><td>VWR</td><td>470180-742</td><td></td></tr><tr><td>5% blood agar plates</td><td>VWR</td><td>89405-024</td><td></td></tr><tr><td>Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K</td><td>VWR</td><td>89405-032</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&amp;rsquo;s Fixative</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>15990</td><td></td></tr><tr><td>IL-10 Rat ELISA kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0101</td><td></td></tr><tr><td>IL-1beta Rat ELISA Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0011</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 Rat ELISA Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0061</td><td></td></tr><tr><td>INF-gamma Rat ELISA Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC4021</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alpha Rat ELISA Kit</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC3011</td><td></td></tr><tr><td>Rat LPS ELISA Kit</td><td>NeoBioLab, MA, USA</td><td>RL0275</td><td></td></tr><tr><td>Environmental Chamber 6020-1</td><td>Caron, Marietta, OH, USA</td><td>6020-1</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light microscope optical system</td><td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colony counter</td><td>Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA</td><td>RE-3325</td><td></td></tr><tr><td>Freezer</td><td>Haier, Brooklyn, NY, USA</td><td>HCMO50LA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra microplate reader</td><td>Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA</td><td>ELx 808</td><td></td></tr><tr><td>Auto Strip Washer</td><td>Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA</td><td>ELx50</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Gilson, Pipetman, France</td><td>P100, P200, P1000</td><td></td></tr><tr><td>C24 Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA</td><td>Classic C24</td><td></td></tr><tr><td>Rocking Shaker&amp;nbsp;</td><td>Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>875713</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>SterilGard III Advance</td><td>The Baker Company, Sanford, ME, USA</td><td>SG403</td><td></td></tr><tr><td>Culture Growing Flasks</td><td>Corning Incorporated, Corning, NY, USA</td><td>4995</td><td>PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks</td></tr><tr><td>Optical Spectrometer Genesys 20</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>Sony DXC-33 Video camera</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Richardson test slide</td><td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA</td><td>80303</td><td></td></tr><tr><td>Millipore water purification system</td><td>Millipore</td><td>Direct-Q</td><td></td></tr><tr><td>Image-Pro Plus software</td><td>Media Cybernetics, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triple Beam Balance</td><td>OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Homogenizer, Dounce</td><td>VWR</td><td>71000-518</td><td></td></tr></tbody></table>

prevention of heat stress adverse effects in rats by bacillus subtilis strain

Este estudo foi desenhado para avaliar o efeito protetor da estirpe Bacillus subtilis contra as complicações relacionadas ao estresse térmico. Trinta e dois ratos Sprague-Dawley foram usadas neste estudo. Os animais foram tratados por via oral duas vezes por dia durante dois dias com B. subtilis estirpe BSB3 ou PBS. No dia seguinte, após o último tratamento, cada grupo foi dividido e dois grupos experimentais (tratados com um PBS e tratadas com um B. subtilis) foram colocados a 45 ° C durante 25 min. Dois grupos de controlo permaneceu por 25 min à temperatura ambiente. Todos os ratos foram sacrificados e diferentes parâmetros foram analisados ​​em todos os grupos. Os efeitos adversos do estresse por calor são registrados pela diminuição da altura das vilosidades e espessura total da mucosa do epitélio intestinal; translocação de bactérias a partir do lúmen; vesiculação aumento de eritrócitos e elevação dos lipopolissacáridos (LPS) de nível no sangue. A eficácia protectora do tratamento é avaliada por prévenção destes efeitos secundários. O protocolo foi definido acima para o tratamento oral de ratos com bactérias para a prevenção de complicações de stress de calor, mas este protocolo pode ser modificado e utilizado para outras vias de administração e para a análise de compostos diferentes.

A temperatura corporal médio dos animais antes e imediatamente após o estresse térmico foi de 36,7 ± 0,07 o C e 40,3 ± 0,17 o C, respectivamente (P &lt;0,05). A exposição de ratos a calor (grupo 3), resultou na inibição significativa da altura das vilosidades da mucosa e espessura total (Figuras 2, 3). A administração oral de tensão BSB3 antes protegidos estresse intestino do efeito nocivo do calor. A translocação de bactérias a partir do intestino foi determinado por análise bacteriológica de nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), fígado e baço de cada rato. As culturas de bactérias numa concentração de 1,7 x 10 3 ± 4,6 x 10 2 ufc / g de tecido (Figura 4) foram isoladas apenas a partir de MLN e fígado de ratos pré-tratados com PBS e expostos a calor (grupo 3). Todas as amostras testadas de ratos controle (grupos 1, 2) e de animais estressados ​​pelo calorrecebeu uma estirpe BSB3 (grupo 4) eram estéreis. Sem bactérias foram isoladas a partir de amostras de baço. Nenhuma mudança de IL-1β; IL-6, TNF-α, IFN-y níveis de citocinas foram registradas em ratos estressados ​​pelo calor. No soro de animais tratados com PBS antes da exposição ao calor elevação significativa dos níveis de IL-10 e LPS foi encontrado (grupo 3) - (Figuras 5, 6). Pré-tratamento com B. subtilis BSB3 (grupo 4) impediu o aumento de IL-10 e LPS no soro de animais stressados ​​por calor. Um aumento significativo da concentração de vesículas livre a partir de (1,4 ± 0,2) x 10 6 de (3,8 ± 0,3) x 10 6 uL vesículas -1 (p &lt;0,001) foi encontrado no sangue de ratos que receberam PBS antes de stress de calor (Figuras 7 , 8). Em um grupo de animais pré-tratados com BSB3 nenhuma mudança no número de vesículas livres foi encontrado réer exposição ao calor (Figura 7). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54122/54122fig1.jpg" /> Figura 1. Desenho do Estudo. Dois grupos de ratos (16 ratos em cada grupo) foram tratados por cânula oral com B. subtilis BSB3 (B. subtilis grupo) ou com PBS (grupo PBS) duas vezes por dia. No dia 3, cada grupo foi subdividido por 8 ratos em cada grupo. Os ratos do Grupo 3 e 4 foram colocados a 45 ° C durante 25 min. Os animais de controlo (grupos 1 e 2) foram mantidos à temperatura ambiente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54122/54122fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54122/54122fig2.jpg" /> Figura 2. Medição das vilosidades intestinais Altura (A) e de mucosa Espessura (B) em ratos. Os ratos pré-tratados com PBS ouB. subtilis BSB3 foram expostos a 45 ° C (stress) ou à temperatura ambiente (controlo). Cada grupo consistiu em 8 ratos. Vinte e foram tomadas medidas de cada parâmetro em cada amostra. Os valores são apresentados como a média eo desvio-padrão. Os resultados foram analisados ​​com o teste t de duas amostras com nível de significância de 0,05 para definir significância estatística. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54122/54122fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54122/54122fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens histológicas de Mucosa Intestinal corados com hematoxilina e eosina. Os ratos foram pré-tratados com PBS ou B. subtilis BSB3 e expostos a 45 o C (stress) ou à temperatura ambiente (Control) A. PBS / sem estresse;. B. PBS / estresse de calor; C. B. subtilis / sem estresse; D. B. subtilis estresse / calor. altura das vilosidades intestinais é indicada por setas. Bar 200 m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54122/54122fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54122/54122fig4.jpg" /> Figura 4. Número total de bactérias em tecidos de ratos. Os ratos pré-tratados com PBS ou B. subtilis BSB3 foram expostos a 45 ° C (stress) ou à temperatura ambiente (controlo). Cada grupo consistiu em 8 ratos. linfonodos mesentéricos, fígado e baço foram removidos assepticamente a partir de cada rato, homogeneizou-se e plaqueadas em meio de ágar para recuperar as bactérias aeróbias e anaeróbias. A contagem total de bactérias translocados (aeróbicos e anaeróbicos) é apresentado como unidades formadoras de colónias (CFU) por grama de tecido. Os valores são apresentados como<html> a média eo desvio-padrão. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54122/54122fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54122/54122fig5.jpg" /> Figura 5. O nível de IL-10 no soro dos ratos. Os ratos pré-tratados com PBS ou B. subtilis BSB3 foram expostos a 45 ° C (stress) ou à temperatura ambiente (controlo). Cada grupo consistiu em 8 ratos. O sangue foi obtido soro de cada rato e analisadas com um estojo de ELISA comercial de rato. Os valores são apresentados como a média eo desvio-padrão. Os resultados foram analisados ​​com o teste t de duas amostras com nível de significância de 0,05 para definir significância estatística. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54122/54122fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> tenda &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54122/54122fig6.jpg" /> Figura 6. LPS em soro de ratos. Os ratos pré-tratados com PBS ou B. subtilis BSB3 foram expostos a 45 ° C (stress) ou à temperatura ambiente (controlo). Cada grupo consistiu em 8 ratos. O sangue foi obtido soro de cada rato e analisadas com um estojo de ELISA comercial de rato. Os valores são apresentados como a média eo desvio-padrão. Os resultados foram analisados ​​com o teste t de duas amostras com nível de significância de 0,05 para definir significância estatística. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54122/54122fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54122/54122fig7.jpg" /> Figura 7. número de vesículas no sangue de ratos. Os ratos pré-tratadoscom PBS ou B. subtilis BSB3 foram expostos a 45 ° C (stress) ou à temperatura ambiente (controlo). Uma pequena gota (7 uL) de sangue recentemente tirado foi colocada numa lâmina de vidro, lamínulas, fotografado e registados dez quadros de imagem em cada amostra (ampliação 1,700X). Concentração de vesículas foi medida utilizando software que fornece imagens ópticas com vista directa de alta resolução em tempo real. Vinte quadros de imagem foram examinados para cada condição experimental. Os valores são apresentados como a média eo desvio-padrão. Os resultados foram analisados ​​com o teste t de duas amostras com nível de significância de 0,05 para definir significância estatística. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54122/54122fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54122/54122fig8.jpg" /> Figura 8. Aumento do Vesicles concentração no sangue após o estresse de calor. image Vídeo de sangue de ratos pré-tratados com PBS antes da exposição à temperatura ambiente (A) ou a 45 o C (B). Uma pequena gota (7 uL) de sangue recentemente tirado foi colocada numa lâmina de vidro, lamínulas, fotografado e registados dez quadros de imagem em cada amostra (ampliação 1,700X). A vesícula é indicado como V. Bar 6 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54122/54122fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Prevenção de estresse térmico efeitos adversos em ratos pela<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

prevention-heat-stress-adverse-effects-rats-bacillus-subtilis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

7.4K visualizações.  Auburn University. We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

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A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these animal models. The rat is one particular model animal where an epigenetic tool can complement many pharmacological and behavioral studies to provide insightful mechanistic information. To this end, we adapted the SureSelect Target Capture System (referred to as Methyl-Seq) for the rat, which can assess DNA methylation levels across the rat genome. The rat design targeted promoters, CpG islands, island shores, and GC-rich regions from all RefSeq genes. 
To implement the platform on a rat experiment, male Sprague Dawley rats were exposed to chronic variable stress for 3 weeks, after which blood samples were collected for genomic DNA extraction. Methyl-Seq libraries were constructed from the rat DNA samples by shearing, adapter ligation, target enrichment, bisulfite conversion, and multiplexing. Libraries were sequenced on a next-generation sequencing platform and the sequenced reads were analyzed to identify DMRs between DNA of stressed and unstressed rats. Top candidate DMRs were independently validated by bisulfite pyrosequencing to confirm the robustness of the platform.
Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is a useful epigenetic tool that can capture methylation changes induced by exposure to stress.

Here, we describe the protocol and implementation of Methyl-Seq, an epigenomic platform, using a rat model to identify epigenetic changes associated with chronic stress exposure. Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is capable of detecting methylation differences that arise from stress exposure in rats.

Uma plataforma de Metil-Seq de Rato para identificar alterações epigenéticas associadas à exposição ao estresse

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Bioquímica

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Métodos padronizados para medir a indução da resposta de choque térmico em elegans caenorhabditis

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...

Ambiente

Isolation, Purification, and Identification of Bacitracin-producing Bacillus licheniformis from Fresh Feces of Healthy Pigs

Bacillus licheniformis and bacitracin have a huge application market and value in the fields of medicine, chemistry, aquaculture, agricultural, and sideline products. Therefore, the selection of B. licheniformis with high production of bacitracin is of great importance. In this experimental protocol, Bacillus with a high yield of bacitracin was isolated, purified, and identified from the fresh feces of healthy pigs. The inhibitory effect of secondary metabolite bacitracin on Micrococcus luteus was also tested. Thin-layer chromatography and high-performance liquid chromatography were used for the qualitative and quantitative detection of bacitracin. The physiological and biochemical characteristics of B. licheniformis were determined by relevant kits. The phylogenetic relationships of B. licheniformis were determined and constructed using gene sequence detection. This protocol describes and introduces the standard isolation, purification, and identification process of B. licheniformis from animal fresh feces from multiple perspectives, providing a method for the large-scale utilization of B. licheniformis and bacitracin in factories.

Isolation, Purification, and Identification of Bacitracin-producing Bacillus licheniformis from Fresh Feces of Healthy Pigs

This protocol provides a complete and comprehensive description of the detailed process for the isolation, purification, and identification of bacitracin-producing Bacillus licheniformis from healthy pig feces.

Bacillus licheniformis and bacitracin have a huge application market and value in the fields of medicine, chemistry, aquaculture, agricultural, and ...

Bioengenharia

Short-Duration Hypothermia Induction in Rats using Models for Studies examining Clinical Relevance and Mechanisms

Therapeutic hypothermia (TH) is a powerful neuroprotective strategy that has provided robust evidence for neuroprotection in pre-clinical studies of neurological disorders. Despite strong pre-clinical evidence, TH has not shown efficacy in clinical trials of most neurological disorders. The only successful trials employing therapeutic hypothermia were related to cardiac arrest in adults and hypoxic ischemic injury in neonates. Further investigations into the parameters of its use, and study design comparisons between pre-clinical and clinical studies, are warranted. This article demonstrates two methods of short-duration hypothermia induction. The first method allows for rapid hypothermia induction in rats using ethanol spray and fans. This method works by cooling the skin, which has been less commonly used in clinical trials and may have different physiological effects. Cooling is much more rapid with this technique than is achievable in human patients due to differences in surface area to volume ratio. Along with this, a second method is also presented, which allows for a clinically achievable cooling rate for short-duration hypothermia. This method is easy to implement, reproducible and does not require active skin cooling.

This article describes two methods of whole-body short-duration hypothermia induction in rats. The first, rapid induction method, employs active cooling using fans and ethanol spray for a rapid decrease in temperature. The second method is a gradual cooling method. This is achieved using the combination of isoflurane anesthesia and the reduction of temperature settings on the homeothermic heat mat. This results in a gradual decrease in core body temperature without the use of any external cooling devices.&#160;

Indução de hipotermia de curta duração em ratos usando modelos para estudos que examinam relevância clínica e mecanismos

Therapeutic hypothermia (TH) is a powerful neuroprotective strategy that has provided robust evidence for neuroprotection in pre-clinical studies of ...

Medicina

A Preclinical Model of Exertional Heat Stroke in Mice

Heat stroke is the most severe manifestation of heat-related illnesses. Classic heat stroke (CHS), also known as passive heat stroke, occurs at rest, whereas exertional heat stroke (EHS) occurs during physical activity. EHS differs from CHS in etiology, clinical presentation, and sequelae of multi-organ dysfunction. Until recently, only models of CHS have been well established. This protocol aims to provide guidelines for a refined preclinical mouse model of EHS that is free from major limiting factors such as the use of anesthesia, restraint, rectal probes, or electric shock. Male and female C57Bl/6 mice, instrumented with core temperature (Tc) telemetric probes were utilized in this model. For familiarization with the running mode, mice undergo 3 weeks of training using both voluntary and forced running wheels. Thereafter, mice run on a forced wheel inside a climatic chamber set at 37.5 &#176;C and 40%-50% relative humidity (RH) until displaying symptom limitation (e.g., loss of consciousness) at Tc of 42.1-42.5 &#176;C, although suitable results can be obtained at chamber temperatures between 34.5-39.5 &#176;C and humidity between 30%-90%. Depending on the desired severity, mice are removed from the chamber immediately for recovery in ambient temperature or remain in the heated chamber for a longer duration, inducing a more severe exposure and a higher incidence of mortality. Results are compared with sham-matched exercise controls (EXC) and/or na&#239;ve controls (NC). The model mirrors many of the pathophysiological outcomes observed in human EHS, including loss of consciousness, severe hyperthermia, multi-organ damage as well as inflammatory cytokine release, and acute phase responses of the immune system. This model is ideal for hypothesis-driven research to test preventative and therapeutic strategies that may delay the onset of EHS or reduce the multi-organ damage that characterizes this manifestation.

The protocol describes the development of a standardized, repeatable, preclinical model of exertional heat stroke (EHS) in mice free from adverse external stimuli such as electric shock. The model provides a platform for mechanistic, preventative, and therapeutic studies.

Um modelo pré-clínico de insolação exercional em camundongos

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Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Investigando os prejudiciais efeitos de baixa pressão Plasma esterilização na sobrevivência de esporos de Bacillus subtilis usando Live celular microscopia

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Biologia

Estabelecendo e validando um modelo de rato de estresse leve imprevisível crônico

Chronic Unpredictable Mild Stress in Rats based on the Mongolian medicine

Depression is a prevalent affective disorder and constitutes a leading cause of global disability. The limitations of current pharmacological interventions contribute to the substantial health burden attributed to this condition. There is a pressing need for a deeper understanding of the underlying mechanisms of depression, making pre-clinical models with translational potential highly valuable. Mongolian medicine, a subset of traditional medicine, posits that disease occurrence is closely tied to the equilibrium of wind, bile, and Phlegm. In this study, we introduce a protocol for the chronic unpredictable mild stress (CUMS) method in rats. Within this framework, rats are subjected to a series of fluctuating, mild stressors to induce a depression-like phenotype, mimicking the pathogenesis of human depression. Behavioral assays employed in this protocol include the sucrose preference test (SPT), indicative of anhedonia-a core symptom of depression; the open field test (OFT), which measures anxiety levels; and the Morris water maze test (MWM), which evaluates spatial memory and learning abilities. The CUMS method demonstrates the capability to induce anhedonia and to cause long-term behavioral deficits. Furthermore, this protocol is more aligned with Mongolian medical theory than other animal models designed to elicit depression-like behavior. The development of this animal model and subsequent research provide a robust foundation for future innovative studies in the realm of Mongolian medicine.

Autor em destaque: Estabelecendo um modelo de roedor para investigar fatores de depressão na medicina tradicional da Mongólia

This protocol outlines a chronic unpredictable mild stress (CUMS) model for depression based on Mongolian medical theory, along with methods for validating behavioral tests.

Estresse Leve Imprevisível Crônico em Ratos com base na medicina mongol

Depression is a prevalent affective disorder and constitutes a leading cause of global disability. The limitations of current pharmacological ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

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