Este trabalho foi financiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL56237, Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais Instituto DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 e EPS-1003907).

1. fabricação de dispositivos microfluídicos <ol><li> Fabrication fotolitografia padrão de um SU-8 molde 50 Mestre <ol><li> Limpe o wafer de silício antes de spin-coating. Lavar uma bolacha de silício de 2 polegadas nua com acetona durante 15 minutos, seguido de álcool isopropílico (IPA) durante 15 min. Desidratar a bolacha, colocando-o numa placa de aquecimento a 150 ° C durante 1 h. Após a desidratação, arrefecer a bolacha à temperatura ambiente. </li><li> Spin-coat a bolacha de silício com SU-8 fotorresiste. Adicionar 2 ml de SU-8 foto-resistente sobre a bolacha. Rampa, o wafer de 500 rpm a 100 rpm aceleração / s por 10 seg, seguido de 1000 rpm a 300 rpm aceleração / s durante 30 seg. (Veja Suplementar Video 1) </li><li> Pré-coze a bolacha sobre uma placa quente a 65 ° C durante 10 min, em seguida, coze suave a 95 ° C durante 30 min. </li><li> Use a exposição UV para transformar o padrão concebido a partir de uma máscara de filme para a foto-resistente revestida-spin. Imprimir o padrão em uma fina película transparente como uma máscara de filme. Coloque a máscara de filme no topo dagirar-revestido fotorresistente e expor a UV com uma dose de 300 mJ / cm 2. (Veja Suplementar Video 2) Nota: Neste protocolo, o padrão de rede de microcanais (159 mm de largura canais mãe ramificação em quatro canais de 100 mm de largura filha) é projetado com software CAD. O padrão sobre a película mostra como um campo claro e o resto da película é coberto por tinta preta. Porque SU-8 é uma foto-resistente negativa, a porção do material fotosensitivo que é exposta à radiação UV vai ser reticulado e tornam-se insolúveis à solvente durante o desenvolvimento do molde (passo 1.1.6). Após o desenvolvimento, esta porção insolúvel vai replicar o padrão de rede concebido e servir como um molde mestre. </li><li> Pós-coza a bolacha exposta numa placa quente a 65 ° C durante 1 min, em seguida 95 ° C durante 10 min. </li><li> Desenvolver o molde mestre. Use SU-8 desenvolvedor como solvente para remover o fotorresiste reticulado-un. Mergulhe o wafer em SU-8 developer por 3 min e enxaguar com IPAdurante 1 min. </li><li> Repetir este ciclo de desenvolvimento de 2-3 vezes até que não haja formação de camadas de branco (resíduo de material fotosensitivo não-curado), após a lavagem com IPA. Seque suavemente a bolacha com azoto gasoso e examinar as características pequenas do padrão sob um microscópio. Repita os ciclos de desenvolvimento adicionais, se necessário. </li><li> Disco cozer a bolacha sobre uma placa quente a 150 ° C durante 15 min. </li></ol></li><li> litografia macia <ol><li> misture manualmente as duas partes (base e agente de cura) de polidimetilsiloxano (PDMS) elastômero em um peso. proporção de 10: 1. </li><li> De gás-se a mistura de PDMS com um exsicador ligado a uma câmara de vácuo durante 15 min. Lançai a solução PDMS no molde mestre fotorresiste. A espessura do PDMS tem de ser superior a 3 mm, para proporcionar uma retenção estável da tubagem de entrada / saída. De gás-PDMS novamente durante 15 min, e remover as bolhas de ar remanescentes, com gás de azoto, se necessário. Curar o PDMS fundidas num forno a 65 ° C durante 3 h. </li><li> Limpe a superfície doa lamela de vidro com uma fita adesiva e um aspirador de plasma (30 seg tratamento de plasma). Spin-coat PDMS curado-un (0,5 ml) sobre a lamela de vidro por aumentando a 4.000 rpm a taxa de aceleração / seg 500 rpm durante 30 segundos. Curar a lamela revestida por rotação PDMS em uma estufa a 65 ° C durante pelo menos 30 min. </li><li> Corte e liberar os PDMS curado do molde mestre. Em seguida, crie uma entrada e uma saída com um furador de diâmetro de 1 mm na extremidade distal dos canais mãe. </li><li> Unir o dispositivo à lamela de vidro PDMS spin-revestido. Oxidar as superfícies dos PDMS e lamela com um produto de limpeza de plasma por 1 min. Após o tratamento por plasma de oxigénio, colocar uma gota de água desionizada (água Dl), a superfície de ligação, e colocar as duas partes em conjunto. Asse o dispositivo num forno a 65 ° C durante 30 min para conseguir uma ligação permanente. </li></ol></li></ol><img alt="Suplementar Video 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Suplementar Video 1 (clique com o botão direito para baixar).</a> <img alt="Suplementar Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Suplementar Video 2 (clique com o botão direito para baixar).</a> 2. endotelial semeadura de células e Cultura <ol><li> Esterilização de dispositivos e Fibronectina Coating <ol><li> Preservar a propriedade hidrófoba da superfície do PDMS em torno da entrada / saída da oxidação. Cubra a superfície PDMS em torno da entrada e saída com pequenas tiras de fita adesiva para evitar a oxidação. Este processo pode impedir que a água DI se espalhe por toda a superfície superior do dispositivo durante o passo de enchimento (2.1.3). </li><li> Tratar o dispositivo de PDMS com plasma de oxigénio foR 5 minutos para alterar a superfície a ser hidrófila, assim facilitar o fluxo do fluido através do microcanal e evitar a bolha de aprisionamento no procedimento de enchimento (2.1.3). </li><li> Utilize uma seringa com uma agulha acoplada ou uma pipeta para encher o dispositivo com água Dl a partir da entrada. Continue o enchimento até que haja uma gotícula de água Dl (30-50 ul) acumulado na saída. Examine o dispositivo sob um microscópio para verificar se existem bolhas de ar no interior do microcanal. Remova a gota de água excessiva na entrada e na saída com um lenço de papel. </li><li> Esteriliza-se o dispositivo numa cápsula de Petri com UV durante um mínimo de 3 horas em uma capa biosegurança laminar. Para evitar a evaporação, cobrir a entrada / saída com uma parte fina de PDMS, coloque um lenço de papel molhado dentro do prato, e enrole o prato com Parafilm. </li><li> Cubra o dispositivo com fibronectina. Lavar o dispositivo pela primeira vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS), em seguida, revesti-la com 100 ug / ml de f ibronectina durante a noite num frigorífico (4 ° C). Coloque uma gotícula de solução na entrada, e, em seguida, criar uma pressão negativa na saída com uma câmara de vácuo, uma seringa com uma agulha ou uma pipeta. </li><li> Encher o dispositivo com meios de cultura de células. Lavar o dispositivo com PBS manualmente por 3 vezes antes de carregar o meio de cultura celular. Aquece-se o dispositivo numa incubadora a 37 ° C. </li></ol></li><li> ECs Sementeira e perfusão de longo prazo Nota: comparação com a cultura 2D CE estática convencional, o modelo de rede de microvasos in vitro com perfusão contínua fez o ambiente de cultura de células mais próximas das condições in vivo. A in vitro rede microvascular demonstrado neste protocolo pode ser mantida até duas semanas. A perfusão bem controlada continuamente repor os nutrientes, remova os resíduos e evitar o excesso de confluência da monocamada CE. Portanto, ele pode ser estendido para um estudo de longo prazo, imitando o ambiente celular e hemodinâmico sob Physiologica diferenteL e condições patológicas. <ol><li> Misture HUVECs primárias em meio de cultura de HUVEC (MCDB 131) com 8% dextrano (peso mol 70.000). O dextrano é usado para aumentar a viscosidade dos meios de carregamento e de conseguir um melhor resultado sementeira de células. A densidade celular recomendada é cerca de 2-4 x 10 6 culas / ml. </li><li> Semear as células dentro do dispositivo. Coloque uma gota de 10-20 ul de células sobre a entrada. Introduzir um fluxo suave, quer por inclinação do dispositivo, ou acção capilar utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro na saída. A chave para uma carga bem sucedida de células é de controlar a velocidade de fluxo inferior a 1 mm / seg dentro dos canais mais pequenos. </li><li> Verifique a semeadura de células. Após a sementeira inicial, o dispositivo de incubar durante 15-20 min (atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C) antes de verificar o estado de semeadura sob o microscópio. Se for necessário, realizar o carregamento da célula adicional para conseguir uma densidade de células desejada. </li><li> Lave o dispositivo com meio de cultura celular (37° C) para remover o dextrano. Cultura o dispositivo na ausência de fluxo para o primeiro 6 h numa incubadora (5% de CO2 a 37 ° C). </li><li> Configurar a conexão do tubo de perfusão de longo prazo. Tape o aparelho numa placa de Petri para evitar o movimento. Criar pequenos orifícios na tampa da caixa de Petri para entrada de ar e tubo de saída inserções. Ligue o tubo de entrada para uma seringa com uma agulha de perfusão para o meio de cultura celular. Conecte o tubo de saída para um serviço de recolha. Nota: Colocar o dispositivo e o colector de resíduos em uma incubadora de cultura de células, enquanto que a colocação de uma bomba de perfusão fora da incubadora e ligá-la com o dispositivo pela tubagem de admissão de comprimento. A taxa de perfusão é determinada pelo projecto experimental. No presente dispositivo, utilizar uma taxa de perfusão de 0,35 uL / min, e uma variação de tensão de cisalhamento entre 1-2 dine / cm 2. Sob esta condição perfusão, as HUVECs atingir confluência em cerca de 3-4 dias. </li></ol></li></ol> 3. Immunofluorescent coloração <ol><li> Corrigir o ECs no dispositivo de perfusão de 2% de paraformaldeído durante 30 min a 4 ° C, seguido de enxaguamento 1x PBS à temperatura ambiente durante 15 min, e 1% de BSA de bloqueio durante 30 minutos. Usar uma taxa de perfusão que é o mesmo que o utilizado para a cultura de células. </li><li> Permeabilizar as ECs fixo para a coloração de anticorpo com 0,1% de Triton X-100. Perfundir o dispositivo com Triton para 5-7 min a etiqueta VE-caderina, e 3 min a etiqueta de F-actina. </li><li> Carregar os anticorpos para o dispositivo. Perfundir o dispositivo com 1x PBS durante 15 minutos para lavar as soluções anteriores. carregar manualmente o anticorpo primário contra VE-caderina (anti-cabra) para dentro do dispositivo, na concentração de 2 ug / ml (o volume total é de 20-50 uL). Manter o dispositivo no frigorífico a 4 ° C durante a noite. Perfundir o anticorpo secundário (de burro anti-cabra) por uma bomba de seringa a uma concentração de 7 ng / ml para 45-60 min. </li><li> Rotular CE F-actina com faloidina. Perfundir o dispositivo com fo 1x PBSR 15 min antes de carregar manualmente faloidina (10 ug / ml) durante 7-10 min. </li><li> Etiqueta núcleos da CE (ver Lista de Materiais). </li><li> Lavar o dispositivo com 1x PBS, e mantê-lo a 4 ° C até à imagiologia. </li></ol> 4. Fluorescência imagem das endotelial [Ca 2+] i <ol><li> Perfundir o dispositivo com albumina (10 mg / ml) solução de -Ringer durante 15 min a 37 ° C. Utilizar a mesma taxa de perfusão que o utilizado para a cultura de células. As concentrações de todos os componentes da solução de albumina-Ringer são descritos na Lista de Materiais. </li><li> Configure o sistema confocal para CE [Ca 2+] i imagem com fluo-04:00. Use um sistema microscópico confocal de imagem Ca 2+. Use um laser de argônio (488 nm) para a excitação e definir a banda de emissão de 510-530 nm. Recolher as imagens com um objetivo 25X (imersão em água, NA: 0,95) em 512 x 512 formato de digitalização. Use um z-passo de 2 mm e um intervalo de digitalização para cada pilha de imagos de 20 seg. </li><li> Perfundir o dispositivo com fluo-4 AM (5 mM) durante 40 min a 37 ° C, em seguida lavar o lúmen de fluo-4 AM com solução de albumina-Ringer. </li><li> Adquirir imagens de microvasos fluo-4 carregado. Recolher as imagens de linha de base durante 10 min. Perfundir o dispositivo com ATP (10 uM) e gravar as mudanças de intensidade de fluorescência (FI) durante 20 min. </li></ol> 5. Fluorescência de imagem de óxido nítrico Produção <ol><li> Perfundir o dispositivo com uma solução de albumina-Ringer durante 15 min. Usar uma taxa de perfusão que é o mesmo que o utilizado para a cultura de células. </li><li> Configure o sistema de imagens de fluorescência para medir a produção de óxido nítrico induzida por ATP. Usar um microscópio equipado com uma câmara CCD digital de 12-bit e um obturador controlado por computador para a medição do óxido nítrico. Use uma lâmpada de xenônio 75 W como fonte de luz. Nota: Selecione a excitação e emissão de comprimentos de onda para DAF-2 DA por um filtro de interferência (nm 480/40) e um espelho dicróico(505 nm) com uma barreira de passa-banda (535/50 nm). Use uma lente objetiva de 20X (NA: 0,75) para recolher as imagens. Para minimizar o fotobranqueamento, posicionar um filtro de densidade neutra (0,5 N) em frente do filtro de interferência e limitar o tempo de exposição a 0,12 seg. </li><li> Carregar as células com DAF-2 DA (5 M). Perfundir o dispositivo com DAF-2 DA para cerca de 35-40 min a 37 ° C. Grave a linha de base de DAF-2 intensidade de fluorescência (FI DAF) após a carga inicial. Nota: DAF-2 DA é continuamente presente no perfusato durante toda a experiência 7. </li><li> Recolha DAF-2 imagens. Grave a linha de base FI DAF por 5 min. Perfundir o dispositivo com ATP (10 uM) e recolher as imagens durante 30 min com intervalos de 1 min. Recolha todas as imagens a partir do mesmo grupo de células no mesmo plano focal. </li></ol> Análise 6. Os dados <ol><li> selecionar manualmente a região de interesse (ROI) das imagens recolhidas a nível da célula individual. CadaROI cobre a área de uma célula individual, que pode ser indicado pelo contorno de fluorescência. </li><li> Subtrair fluorescência de fundo e calcular o FI média de cada ROIs. </li><li> Medir as mudanças induzidas por ATP em CE [Ca 2+] i e produção de NO. Quantificar as alterações induzidas por ATP na CE [Ca 2+] i calculando as mudanças em Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, onde 0 é o FI FI da linha de base média durante a perfusão de albumina-Ringer antes de adicionar ATP) menos a medida fundo. Quantificar NO taxa de produção, realizando a primeira conversão diferencial do FI DAF ao longo do tempo. Nota: O curso de tempo de FI DAF representa uma produção de NO acumulado com o tempo. Portanto, nenhuma taxa de produção é calculado com base no perfil de FI DAF sob basal e estimulada ATP condições. Detalhes de análise de dados e procedimentos experimentais foram descritos na publicação anterior 7. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases.">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks.">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(iBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).</li><li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li><li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures.">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li><li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element.">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis.">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li><li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients.">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li></ol>

Os autores não têm interesses conflitantes ou interesses conflitantes para divulgar.

<html> Neste artigo, apresentamos protocolos detalhados para o desenvolvimento da rede microvascular culta, a caracterização das junções CE e citoesqueleto distribuição de F-actina, e as medições quantitativas da CE [Ca 2+] i e produção de NO utilizando um dispositivo microfluídico. O dispositivo microfluídico perfusão fornece um modelo in vitro que permite uma simulação perto dos in vivo geometrias microvasculares e condições de fluxo de cisalhamento. Uma vez que a rede de microvasos em cultura pode ser formada por ECs humana primária, esta abordagem pode servir como uma ferramenta útil para investigar como patologicamente componentes sangue alterado a partir de amostras de doentes afectar ECs humanos por perfusão directa de amostras de sangue dos pacientes para os microvasos cultivadas e fornecer informações sobre clínica problemas. Os CEs microvasos humanos desenvolvidos também podem ser utilizados para o rastreio de drogas para evitar os potenciais discrepâncias nas respostas de drogas entre os tecidos humanos e animais. ve_content &quot;&gt; O substrato dos dispositivos de microfluidos mostrados neste protocolo é uma lamela de vidro (150-180 mm) spin-revestido com uma fina camada de PDMS. Esta fina camada de PDMS é essencial para alta resolução e tecido vivo em tempo real imagem, porque os objectivos de abertura numérica maiores geralmente tem distância de trabalho curta. o fluxo laminar dentro do microcanal (intervalo submillimeter) tem um número muito baixo Reynolds, eo diferencial de pressão é linearmente relacionada com o fluxo, assim, a distribuição de tensões de cisalhamento depende apenas sobre a geometria do canal. por conseguinte, ele pode ser bem controlado por-alta precisão bomba de perfusão 20. no nosso estudo, a tensão de cisalhamento aplicada à rede de microvasos em cultura de HUVEC era entre 1 a 10 dines / cm2, que está dentro do gama de tensão de cisalhamento medida no sistema venoso 21,22. os sistemas de macro-fluídicos tais como câmara de fluxo paralelo carece de padrões complexos de fluxo. em câmaras de fluxo em maior escala (variação mm cm), ECS são normalmente apenas cresceu na superfície de fundo (monocamada 2D), sem as semelhanças geométricas de microvasos in vivo. Quando a largura da câmara de fluxo é superior a 2 mm, o fluxo homogéneo é confinado numa região que é geralmente de alguns milímetros afastado da saída / entrada, e algumas centenas de mícrons de distância da parede lateral 23. Quando a largura da câmara é aumentada para a gama de centímetros, o fluxo irá diferenciar em várias linhas de fluxo e as velocidades de fluxo irá mudar ao longo de toda a área 24. Além disso, a câmara de fluxo da escala maior consome pelo menos 100 vezes mais perfusato para atingir a mesma tensão de corte a que está em microcanais. A distribuição de tensões de corte no interior da rede de microcanais pode ser simulada usando uma ferramenta de simulação numérica, e as incompressíveis equações de Navier-Stokes estacionário pode ser resolvido pela maioria dos programas de elementos finitos. O dispositivo microfluidico pode ser feita com um singlprocesso de máscara de microfabricação e. O sucesso do desenvolvimento de microvasos culta, no entanto, requer atenção especial aos detalhes. Depois de carregar a solução para os microcanais, cada dispositivo precisa ser verificado para bolha trapping sob o microscópio antes da semeadura CE. Se ocorre uma bolha, é ainda possível a forçá-lo para fora, nesta fase, por aplicação de uma pressão hidráulica na entrada com uma saída fechada, como PDMS é um material permeável ao ar. Para manter uma taxa de perfusão desejado, ajuste apertado sem um vazamento é necessário para todas as conexões de agulha / tubulação. O furo-perfurador combinados e dimensão da mangueira são fundamentais para alcançar um encaixe apertado. Para assegurar uma entrega precisa da taxa de fluxo, a seringa sobre a bomba de infusão, e o dispositivo deve ser colocado ao mesmo nível. Para alterar o perfusato, o tubo deve ser inserido suavemente desligado do dispositivo, para evitar qualquer alongamento. Para aumentar a tensão de cisalhamento, aumentos (como 10 passos de aumento em 18 horas) são recoded para evitar alterações de fluxo súbita causada descamação CE. Estudos anteriores realizados em microvasos perfundidos intactas individualmente indicado que os aumentos induzidos por agonistas em CE [Ca2 +] i, e a subsequente óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) activação e a produção de NO são necessários para a sinalização permeabilidade microvascular aumentada em condições inflamatórias 6,7 , 9-13,25. Neste protocolo, seleccionamos ATP como o agonista representativo, uma vez que é geralmente liberada pelas células vermelhas do sangue, plaquetas agregadas e tecidos lesionados ou sob condições inflamatórias in vivo. Um indicador de cálcio fluorescente, Fluo-4 AM, foi usada para medir as alterações em [Ca2 + endotelial] i após a exposição ao ATP. A CE [Ca 2+] i em resposta microvasos cultivadas são semelhantes aos encontrados em microvasos intactas 7,9. Medir a produção CE NO tem sido um desafio técnico para os biólogos.Até à data, não houve nenhuma indicador fluorescente que permite a detecção de alterações dinâmicas na concentração de NO de uma maneira semelhante para os indicadores de cálcio. DAF-2 DA tem sido amplamente utilizada para avaliar a produção de NO. No entanto, o uso adequado, a interpretação de dados e análise de dados precisa para chamar a atenção dos usuários. Desde a transformação química do DAF-2 para DAF-2T na presença de NO é irreversível (conversão só ida) 26, a DAF perfil de intensidade de fluorescência detectado não representa as mudanças na concentração de NO. Em vez disso, ele indica a produção DAF-2T acumulada com o tempo. Com base nesta acumulado DAF-2 fluorescência curva (FI DAF), o (df / dt) taxa de produção de NO pode ser obtido por conversão do primeiro diferencial da FI DAF 7,11. Designadamente, a inclinação da curva de FI indica a taxa de produção de NO e a fase planalto indica aumento não mais a produção de NO. Depois da conversão, os dados gerados a partir deste protocolo PResented tanto o basal NO taxa de produção e as mudanças na produção de NO em resposta a ATP com resolução temporal e espacial nos níveis CE individuais dentro da rede microvascular. Actualmente o PDMS tem sido amplamente utilizado para aplicações de microfluidos, uma vez que é um elastómero macio permeável opticamente transparente, não tóxico, e de gás 27-30. No entanto, desde PDMS não é permeável à água, não foi possível medir diretamente a permeabilidade da monocamada CE. Para superar esta limitação, algumas aplicações modificou as estruturas de parede de canal, tais como integração de uma membrana permeável para dentro do canal 31, ou criando um &quot;permeáveis ​​aberturas de janelas&quot; com micro-pilares ou micro-orifícios 32,33, enquanto outros têm sido focados na modificação de materiais para dispositivos como o uso de dispositivos de hidrogel ou hidrogel / PDMS dispositivos híbridos 17,34-36. As desvantagens de tais dispositivos são sua natureza vulneráveis ​​à desidratação e à sua relativamente fraca mPropriedades echanical ficar estresse ou pressão. desenvolvimento futuro de material permeável com resistência mecânica vai melhorar ainda mais o dispositivo e seu potencial para aplicações biológicas mais amplas.

As células endoteliais (ECS) que revestem as paredes dos vasos sanguíneos in vivo estão constantemente expostos a fluir, mas ECs cultivadas são cultivadas em condições estáticas e exibem um fenótipo pró-inflamatório 1,2. A tecnologia de microfluidos permite que um fluido controlado com precisão através de uma microescala geometricamente limitado (sub-milímetros) canais 3, o que proporciona a oportunidade para células de cultura, especialmente para células endoteliais vasculares, a crescer sob condições de fluxo desejadas. Estas características tornam as condições de cultura de célula mais perto in vivo do que as culturas de células, 2D estáticos convencionais. Eles são extremamente importantes quando os dispositivos microfluidicos são utilizados para modelar diferentes tipos de vasculaturas e para estudar as respostas a estímulos mecânicos CE e / ou químicos. Apesar das vantagens demonstradas pela rede de microcanais através de uma cultura de células estática, a adaptação e a aplicação de microfluidos na f biomédicaield permanecem limitados. Relatado por uma revisão recente, a maioria das publicações neste domínio (85%) ainda estão em revistas de engenharia 4. O desempenho de dispositivos de microfluidos não tem sido suficientemente convincente para a maioria dos biólogos para alternar a partir de técnicas correntes, tais como o ensaio Transwell e a corrediça cultura prato / vidro macro-escala para este dispositivo miniaturizado. A microfluídica é um campo multidisciplinar, que requer colaborações interdisciplinares para mover esse campo para a frente. O objetivo deste artigo técnico é reduzir as lacunas de conhecimento entre as disciplinas e fazer os procedimentos de fabricação compreensível por biólogos, ao fornecer aplicação biológica e validação funcional dos microvasos microfluídicos. Os protocolos experimentais visualizadas incluem fabricação de ambos os dispositivos microfluídicos e suas utilidades biológicos, o que representa uma estreita colaboração entre engenheiros e biólogos. Nós recentemente relataram algumaplicações biológicas usando a rede microvascular in vitro com o dispositivo microfluídico 5. A fim de conceber apropriadamente as dimensões da rede de microcanais e aplicar a tensão de corte desejado, um modelo numérico foi construído com o software de dinâmica de fluido computacional para estimar de perto o perfil do fluxo. Da veia umbilical células endoteliais humanas primárias (HUVECs) foram semeadas em que os microcanais atingiram a confluência, isto é, cobriam a totalidade das superfícies internas do microcanal, em 3-4 dias, com perfusão contínua. A formação da barreira adequada foi demonstrada por coloração com VE-caderina e em comparação com os que são formados sob condições de cultura de células estáticas e em microvasos intactas. Ao aplicar os protocolos experimentais desenvolvidos em microvasos perfundidos intactas individualmente 6-8, que medida quantitativamente as mudanças na CE [Ca2 +] i e óxido nítrico (NO) em resposta a adenosina-trifosfato (ATP) com fluorescente emcadores e confocal e microscopia de fluorescência convencional. Os aumentos induzidos por agonistas em CE [Ca 2+] i ea produção têm sido relatados como sinais intracelulares necessárias para os aumentos inflamatórias induzida pelo mediador na microvasos permeabilidade 6-15. Apesar de alguns estudos anteriores mostrou imagens de dispositivos microfluídicos DAF-2 DA carregados 16,17, análise adequada resolução e dados ainda não tinha alcançado 18. Para nosso conhecimento, este estudo demonstra os primeiros resultados quantitativos de mudança dinâmica induzida por agonista em endotelial [Ca 2+] i e produção de NO utilizando microfluídico sistema baseado. Técnicas de microfabricação tem a flexibilidade para fabricar microcanais para baixo a alguns microns e permitir o desenvolvimento de padrões complexos para imitar as geometrias de microcirculação in vivo. Aqui nós apresentamos uma rede de microcanais típico com três níveis de ramificação. esterede é fabricada pela combinação de fotolitografia, que é realizado em uma sala limpa microfabricação e litografia macia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1058">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">ATP</td>
			<td style="width:247px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">A2383</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biopsy punch</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-31 AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Albumin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>810014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Brain Extract (BBE)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover-slip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAF-2 DA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>251505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DRAQ5 (nuclei staining)&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2759-15MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>F-14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Pasteur pippette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES Buffered Saline Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mammalian Ringer Solution Ingredient</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl (132 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCL (4.6 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2 &#183; 2H2O (2.0 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4 &#183;7H2O (1.2 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose(5.5 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3 (5.0 mM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes Salt (9.1 mM)</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>6007H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes Acid (10.9 mM)</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>6003H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB 131 Culture Medium</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phalloidin (F-actin staining)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td>Exel Int</td>
			<td>29552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scotch tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>34-8711-3070-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicon wafer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2050 Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tissue culture flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Chemical Book</td>
			<td>T6878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin Neutralizer solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>PTFE microbore tubing, 0.012&#34; ID x 0.030&#34; OD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-cadherin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-6458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:247px;">Company</td>
			<td style="width:327px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:183px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biosafety Laminar hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-425 Class II, Type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hotplate</td>
			<td>Wenesco</td>
			<td>HP-1212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isotemp oven</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>3608-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lithography bench</td>
			<td>Karl Suss</td>
			<td>MA6 Contact Lithography</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>L200 ND &#38; Diaphod 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shutter for the CCD camera</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lambda 10-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>PVA TePla/Harrick plasma</td>
			<td>M4L/PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td>Brewer Science</td>
			<td>Cee 200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump system</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>703005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Software</td>
			<td style="width:247px;">Company</td>
			<td style="width:327px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:183px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD 2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFD simulation software</td>
			<td>COMSOL</td>
			<td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Images acquire and analyse for NO production&#160;</td>
			<td>Universal Imaging</td>
			<td>Metafluor</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production

As células endoteliais (ECS) que revestem as paredes dos vasos sanguíneos in vivo estão constantemente expostos a fluir, mas ECs cultivadas são cultivadas em condições estáticas e exibem um fenótipo pró-inflamatória. Embora o desenvolvimento de dispositivos microfluídicos foi abraçado pelos engenheiros mais de duas décadas, as suas aplicações biológicas permanecem limitados. Um modelo in vitro de microvasos mais fisiologicamente relevante validada por aplicações biológicas é importante para avançar no campo e colmatar as lacunas entre in vivo e in vitro. Aqui, apresentamos os procedimentos detalhados para o desenvolvimento da rede microvascular cultivadas utilizando um dispositivo microfluídico com uma capacidade de perfusão de longo prazo. Nós também demonstrar as suas aplicações para medições quantitativas de mudanças induzidas pelo agonista na CE i e óxido nítrico (NO) [2 + Ca] em tempo real usando confocal e microscopia de fluorescência convencional. A rede microvascular formadotrabalho com perfusão contínua mostrou cruzamentos bem desenvolvidos entre ECs. distribuição VE-caderina estava mais perto do que a observada em microvasos intactas do que monocamadas CE estaticamente cultivadas. ATP induzida por aumentos transitórios na CE [Ca 2+] i e produção de NO foram quantitativamente medido a níveis de células individuais, que validaram a funcionalidade dos microvasos cultivadas. Este dispositivo de microfluidos permite ECs a crescer sob um fluxo fisiologicamente relevante bem controlado, o que faz com que o ambiente de cultura celular mais perto in vivo do que os que, em culturas 2D estáticos convencionais. O projeto de rede de microcanais é altamente versátil, e o processo de fabricação é simples e repetível. O dispositivo pode ser facilmente integrado ao sistema microscópico confocal ou convencional que permite imagens de alta resolução. Mais importante ainda, porque a rede de microvasos em cultura pode ser formada por CEPs primárias humanas, esta abordagem irá servir como uma ferramenta útil para investigar comopatologicamente componentes do sangue alterados a partir de amostras de pacientes afetam ECs humanos e fornecer informações sobre questões clínicas. Ele também pode ser desenvolvido como uma plataforma para o rastreio de drogas.

Esta seção mostra alguns dos resultados obtidos com a rede microvascular cultura desenvolvida com este protocolo. O padrão de microcanais é uma rede ramificada de três níveis (Figura 1A). Neste design, a 159 m de largura ramos canal mãe em duas 126 mm canais de largura, e ramos de novo em quatro 100 mm canais filha de largura. Uma simulação numérica 3D foi realizada para estimar as distribuições de tensões de cisalhamento sob a taxa de fluxo de 0,35 mL / min (Figura 1B), o que indica três níveis diferentes de tensão de corte dentro desta rede de microcanais. O fluxo laminar dentro dos microcanais é predito para ser hidrodinamicamente estável sem a presença de fluxo perturbado ou secundária. Depois de um molde mestre SU-8 foi fabricado com um processo de fotolitografia padrão (Figura 1C), um dispositivo de PDMS foi fabricada por meio de litografia suave para replicar o ne de microcanaisprojeto Twork em um, ar andaime permeável transparente (Figura 1D - E). Após sementeira CE (Figura 1F - G) e 3-4 dias de perfusão contínua, ECs atingiram a confluência e coberto com êxito as superfícies internas dos microcanais. CE F-actina e os núcleos foram marcado por fluorescência dentro da rede e ilustrado com imagens confocais. Sob a tensão de corte de 1,0 dine / cm2, cerca de 30% do HUVECs alongada ao longo da direcção do fluxo com o aumento das fibras de stress centrais, enquanto o restante 70% mantiveram a sua padrão de calçada com dominada periférica F-actina 5. A alteração da forma da célula induzida por cisalhamento parece menos proeminente do que a normalmente observada em culturas de células estática 2D. Na verdade, sob condições in vivo, o ECS possuem formas diferentes de células em diferentes tipos de navios, mas não alterar facilmente a forma da célula em resposta ao fluxo de chaNGES. São necessários mais estudos para determinar se esta diferença foi os resultados da geometria do canal e ambiente de perfusão que estão mais perto de condições in vivo. Também medido com sucesso as mudanças induzidas pelo ATP na CE [Ca 2+] i e nenhuma produção (Figuras 4 e 5). ATP induzidos aumentos transitórios da CE [Ca 2+] i e produção de NO. A média de pico FI fluo-4 foi de 187 ± 22% da linha de base, que ocorreu a 35 ± 10 segundos após o início da perfusão de ATP. A taxa de produção de NO foi aumentada a partir de um nível basal de 0,15 ± 0,05 UA por min para 1,18 ± 0,37 UA por min durante os primeiros cinco minutos de exposição ao ATP. Todos os resultados foram relatados como a média ± erro padrão (SE). Eles são comparáveis ​​aos resultados derivados de vênulas intactas perfundidos individualmente 6,9,14,19. Figura 1: Fabricação Dispositivo de microfluidos e CE de carregamento (A) A vista esquemática da rede de microcanais.. O ângulo de largura e bifurcação dos microcanais são indicados em cada nível de ramificação. (B) A simulação numérica da distribuição de tensões de cisalhamento. A taxa de fluxo é 0,35 l / min. A altura do microcanal após desenvolvimento é de 80 uM. Estas duas figuras foram modificados a partir da publicação anterior com detalhes adicionais 5. (C) O desenvolvimento do molde mestre. O molde mestre da rede de microcanais é fabricado com SU-8 fotorresiste em bolacha de silício. (D) O processo de litografia macia. mistura PDMS é fundido para o molde mestre e curadas num forno. (E) Bonding PDMS canal para o substrato. O substrato utilizado para este dispositivo é um SPI lamelan revestida com uma fina camada de PDMS. A entrada e saída são criados com um furo-perfurador. De carga (F e G), CE. Cerca de 10 ul de solução da célula é colocada na entrada. Um fluxo suave é então induzida pela colocação de uma pipeta Pasteur na saída via fluxo capilar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54014/54014fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig2.jpg" /> Figura 2: As imagens confocais de CE F-actina em rede de microcanais cultivadas (A) uma vista esquemática do desenho da rede.. As regiões seleccionadas mostradas em B - D estão indicadas no gráfico. (B - D) imagens Confocal de CE F-actina (vermelho) e núcleos (azul) da rede microvascular in vitro B 1. </strong&gt;, C e D 1 1 são as imagens projectadas a partir de metade superior das pilhas de imagens de microcanais, e B 2, C 2, 2 e D são as projecções de imagem a partir da metade inferior das pilhas de imagens. E. A vista em corte transversal como indicado 01/01 &#39;, 02/02&#39;, e 03/03 &#39;em B 1 - D 1, barra de escala = 100 pm. Estas imagens são adaptados a partir da publicação anterior 5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54014/54014fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig3.jpg" /> Figura 3: Comparações de VE-caderina distribuição na rede microvascular cultivadas com monocamada CE estaticamente cultivadas e intacto venule mesentérica de rato (. <strong&gt; A) A visão esquemática do projeto de rede com regiões selecionadas mostrados na B - D. (B - D) VE-caderina (verde) e núcleos de células (azul) coloração do in vitro microvasos rede D 1 e D 2 são parte superior e inferior das imagens projectadas recolhidos da mesma região de bifurcação, respectivamente.. (E) VE-caderina coloração das ECs estaticamente cultivadas. (F) VE-caderina coloração de venule rato intacta perfusão individualmente. Este valor publicado anteriormente 5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54014/54014fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig4.jpg" /> Figura 4: ATP induzida por aumentos na CE [Ca 2+ </sup&gt;] i. Os experimentos foram conduzidos a partir de 4 dispositivos e 7 a 12 ROIs (individuais CEs) por dispositivo foram selecionados para análise de dados. (A) O curso de tempo de ATP (10 uM) induzida por alterações no CE [Ca 2+] i (Fluo 4 FI / FI 0 × 100% ± EP) a partir de uma experiência representativa. (B) As imagens da experiência representativa (dados é mostrado em A). Esta é uma figura publicado anteriormente 5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54014/54014fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig5.jpg" /> Figura 5: ATP induzida a produção de NO As experiências foram realizadas em 3 e dispositivos 11 a 12 (ROIs indivíduo ECs) por dispositivo foram selecionados para análise de dados.. (A </strong&gt;) Tempo mudanças dependentes de intensidade DAF-2 fluorescência (FI DAF ± SE, deixou eixo Y) em ECs em condições basais e após exposição a ATP. A taxa de produção de NO (df / dt, linha pontilhada), foi obtido a partir do primeiro diferencial da conversão FI DAF acumulada (eixo dos Y direito). (B) Imagens representativas de uma experiência. O DAF FI aumentou ainda mais depois de um dador de NO, nitroprussiato de sódio (SNP), foi adicionado ao perfusado, indicando uma quantidade suficiente de intracelular DAF-2 para reagir com NO. Esta é uma figura publicado anteriormente 5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54014/54014fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Desenvolvimento e Caracterização de<em&gt; In Vitro</em&gt; Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E óxido nítrico Produção

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

8.5K visualizações.  College of Medicine, Penn State University. Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Vídeo: Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Contagem e determinação da viabilidade das células em cultura

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Biologia

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

A quantificação da Adesividade celular endotelial<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

A Assembleia e Aplicação de &#39;tesoura Anéis&#39;: A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into nitrite and nitrate by interactions with various oxy-heme proteins and other still not well known pathways. The reverse process, reduction of nitrite and nitrate into NO had been discovered in mammals in the last decade and it is gaining attention as one of the possible pathways to either prevent or ease a whole range of cardiovascular, metabolic and muscular disorders that are thought to be associated with decreased levels of NO. It is therefore important to estimate the amount of NO and its metabolites in different body compartments &#8212; blood, body fluids and the various tissues. Blood, due to its easy accessibility, is the preferred compartment used for estimation of NO metabolites. Due to its short lifetime (few milliseconds) and low sub-nanomolar concentration, direct reliable measurements of blood NO in vivo present great technical difficulties. Thus NO availability is usually estimated based on the amount of its oxidation products, nitrite and nitrate. These two metabolites are always measured separately. There are several well established methods to determine their concentrations in biological fluids and tissues. Here we present a protocol for chemiluminescence method (CL), based on spectrophotometrical detection of NO after nitrite or nitrate reduction by tri-iodide or vanadium(III) chloride solutions, respectively. The sensitivity for nitrite and nitrate detection is in low nanomolar range, which sets CL as the most sensitive method currently available to determine changes in NO metabolic pathways. We explain in detail how to prepare samples from biological fluids and tissues in order to preserve original amounts of nitrite and nitrate present at the time of collection and how to determine their respective amounts in samples. Limitations of the CL technique are also explained.

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...