This study was supported by the Swiss National Foundation (n&#176; 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)

Cuidados com os animais foi de acordo com as directrizes aprovadas pelas autoridades locais suíços (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Berna, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, Nrs aprovação. 52/11 e 35/14). Essas diretrizes estão de acordo com a directiva comunitária 2010/63 / UE. Nota: Trabalho em uma capela de fluxo laminar com instrumentos e soluções estéreis para todas as etapas 1 - 5, incluindo sub-etapas. 1. Preparação de acordos ambientais multilaterais Nota: AAM são compostas de um substrato de vidro, eletrodos pré-fabricadas das micro do metal e uma camada de isolamento de polímeros SU-8 (ver também Tscherter et al. 3). Para o propósito deste estudo, AAM disponíveis comercialmente foram encomendados com um esquema de conjunto de eléctrodos personalizado (Figura 1 A e B). Os eléctrodos 68 estão dispostas numa grelha rectangular que é dividida em duas zonas por uma ranhura 300 um de largura livre de eléctrodos, electrleads iCal e isolamento. Cada um dos eléctrodos é de 40 x 40 um em tamanho e estão espaçados por 200 um de centro a centro. Quatro grandes eléctrodos de terra estão posicionados em torno do local de gravação. Eles diferem de outros acordos ambientais multilaterais padrão disponíveis comercialmente em seu tamanho (21 milímetros x 21 mm) e eles não têm câmara de gravação fixo. <ol><li> Para a desinfecção de enxaguamento AAM em 100% de etanol (2x), etanol a 70% (1x) e água destilada (2x) durante pelo menos 30 seg cada. Deixe secar. Colocar 10 - 12 AAM numa placa de Petri de vidro limpo (150 mm x 25 mm) e feche a tampa. </li><li> AAM autoclave durante 20 min a 120 ° C. Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Preparar a solução de revestimento (ver lista de materiais) para os acordos ambientais multilaterais e armazenar alíquotas a -20 ° C. </li><li> Colocar cada MEA numa placa de Petri estéril indivíduo (35 mm x 10 mm). </li><li> Usar uma pipeta para colocar arrefecida 150 ul de solução de revestimento refrigerada no topo dos eléctrodos e fechar a tampa do prato de petri. Após cerca de 10 min, verificar se há bolhas de ar no topo doos eletrodos e removê-los delicadamente com uma espátula de borracha coberta, se necessário. Deixe repouso durante 1 h à TA. </li><li> Aspirar resíduos de solução de revestimento, lavagem 1x com meio otimizado para pré-natal e neurônios embrionários e 2x com água destilada e estéril. Se AMA não são usadas até o dia seguinte, mantê-los em água destilada, água estéril a 37 ° C na incubadora de O / N. Caso contrário, deixa directamente seco à TA. </li></ol> 2. Os ingredientes necessários para a preparação e Crescimento de culturas organotípicas <ol><li> Preparar a solução de lavagem sem cálcio (ver lista de materiais). </li><li> Reconstituir plasma frango em solução de lavagem (1: 1, agite, evitar a formação de bolhas), centrifugar a 3000 xg durante cerca de 20 minutos e decantar o conteúdo claro em um tubo estéril. Alíquota de 200 ul em criotubos e armazenar a -20 ° C. </li><li> Reconstituir trombina a partir de plasma bovina em conformidade (200 U / mL) e esterilizado por filtração (filtro de 0,2 um de poro). Alíquota de 200 ul em crytotubes e armazenar a -20 ° C. </li><li> Por 30 culturas preparar 100 ml de meio nutriente (ver lista de materiais). </li></ol> 3. Spinal Cord Tissue Dissection Nota: o rendimento Processo, de acordo com o número de embriões, fatias de medula espinal durante cerca de 25 - 35 co-cultura, é preparado dentro de uma câmara de fluxo laminar em condições estéreis. <ol><li> Aplicar uma dose letal de pentobarbital (0.4 ml) a mãe do animal por injecção intramuscular. Confirme anestesia profunda, verificando o reflexo de retirada do pedal. Entregar embriões de ratos E14 por cesariana e sacrifício por decapitação. </li><li> Transferir os corpos dos embriões numa placa de petri cheia com, refrigerada, a solução de lavagem estéril. </li><li> Realizar um corte transversal completo com um bisturi acima dos membros posteriores e outro acima dos membros anteriores e remover os membros do corpo. Em seguida, faça um corte no plano frontal para separar as vísceras da peça de volta contendo o co espinhalrd. </li><li> Para cortar, transferir as peças de volta contendo a medula espinal um de cada vez sobre um disco de montagem e cortada a uma espessura de 225 - 250 fim com um cortador de tecido. Colocar uma gota da solução de lavagem sobre o tecido picado e transferir as fatias com uma espátula em 35 mm x 10 mm com placas de petri cheias, refrigerada, a solução de lavagem estéril. </li><li> Para cada fatia separadamente, dissecar medula espinhal longe do restante tecido. Deixe gânglio da raiz dorsal anexado. </li><li> Deixe as fatias descansar durante 1 hora a 4 ° C. </li></ol> 4. Montagem da Coluna Vertebral fatias de tecido Cord sobre acordos ambientais multilaterais <ol><li> Aqueça meio nutriente estéril na incubadora (37 ° C, levemente tampa para a oxigenação desatarraxou). </li><li> Posição MEA com pinças estéreis com dicas cobertas de borracha em temperatura ambiente na placa de Petri sob um microscópio estéreo com o conjunto de eletrodos em foco. Centralize uma gota 6 mL de plasma de frango no conjunto de eletrodos limpo, livre de poeira, e estéril. Usando uma pequena espátula, cuidadosamente deslizeduas secções da espinal medula com lados ventral frente para o outro dentro da gota de plasma. Não toque os eletrodos com a espátula. </li><li> Adicionar 8 mL de trombina em torno da gotícula de plasma de galinha. Usando a ponta trombina pipeta, cuidadosamente misturar e espalhar a mistura de frango plasma / trombina em torno das duas fatias. Mais uma vez, não toque no conjunto de eletrodos diretamente frágil. Pouco antes de coagulação, aspirar o excesso de frango plasma / trombina. </li><li> Tapar o prato de petri para reter humidade elevada, enquanto o conjunto do MEA / cultura senta-se durante cerca de 1 h numa câmara humidif içada no interior da incubadora a 37 ° C. </li><li> Adicionar cuidadosamente 10 ml de meio nutriente para a câmara de cultura, tampar a placa de Petri e colocar de volta na incubadora por cerca de 30 min. </li><li> Coloque cada conjunto MEA / cultura com, dicas cobertas de borracha estéreis em um tubo de rolo, adicionar 3 ml de meio nutritivo e bem perto da tampa. Colocar o tubo de enrolamento no tambor de rolos que roda a 1 - 2 rpm na incubadora em 5% de CO <sub&gt; 2 -containing atmosfera a 37 ° C. </li><li> Mudar metade do meio nutriente depois de 7 dias in vitro (DIV) e, depois, 1 - 2 vezes por semana. </li></ol> 5. As lesões mecânicas <ol><li> Leve o conjunto MEA / cultura com, dicas cobertas de borracha estéreis para fora do tubo de rolo e coloque em um prato de petri sem meio nutriente sob um microscópio estéreo com o tecido em foco. Visualmente verificar que as duas fatias são fundidos. </li><li> Segure o MEA / cultura montagem estável, colocando uma pinça com pontas cobertas de borracha na MEA. </li><li> Coloque uma lâmina de bisturi na ranhura do MEA perto das fatias de tecido. Segurar o bisturi em vez horizontalmente. </li><li> Levante o bisturi lidar com até mas deixe a lâmina de bisturi ficar na ranhura da MEA, de tal forma que a lâmina &quot;rola&quot; da base à ponta e reduz, assim, através do tecido que cobre a ranhura. </li><li> Graves quaisquer ligações de tecido residual com uma agulha de 25 G ponta se necessary. Trabalhar somente na área dentro do sulco e não toque nas bordas do concurso. </li><li> Coloque o conjunto da MEA / cultura de volta para dentro do tubo de rolo. Fornecer 3 mL de meio nutriente fresco para as culturas e colocá-los de volta para dentro do tambor de rolos na incubadora. </li></ol> 6. As gravações eletrofisiológicas da atividade espontânea <ol><li> Para investigar a regeneração funcional entre as duas fatias de medula espinhal após o número escolhido de DIV, monte o conjunto MEA / cultura em uma câmara de gravação em um microscópio e aplicar cerca de 500 solução extracelular ul (ver lista de materiais). </li><li> Esperar 10 min antes da primeira gravação para permitir que o sistema se estabilize. </li><li> Grave 2x atividade espontânea básicos para cerca de 10 min de cada eletrodo do MEA a RT-detectar atividade. </li><li> Para garantir condições estáveis ​​extracelulares, trocar solução extracelular após cada sessão de gravação. </li><li> Para desinibir a rede, aplique a solução de co extracelularntaining estricnina (1 uM) e gabazine (10 uM). Aguarde pelo menos 2 minutos antes de iniciar a gravação. </li></ol> Análise 7. Dados Nota: Para a detecção dos potenciais de acção extracelularmente gravados para cada eléctrodo usar um detector baseado no desvio padrão e um discriminador subsequente. Este procedimento é descrito em detalhe em Tscherter et al. 3. <ol><li> Mostrar a actividade neuronal detectada de cada eléctrodo num lote raster de acordo com procedimentos padrão 3 (Figura 1F). </li><li> Determinar e exibir a actividade da rede total para cada fatia através da soma do número de eventos nos canais de acordo dentro de uma janela deslizante de 10 mseg, deslocada em passos mseg (Figura 1G 1 e ver Tscherter et al. 3). </li><li> Detectar em cada fatia rajadas individuais (clusters de actividade que aparecem em vários eletrodos). Portanto, Definir um limite mínimo de atividade pico na atividade de rede total correspondente e definir cada início e fim estourar estourar. Por exemplo, um limite adequado é de 25% da amplitude média de ruptura e um início de ruptura pode ser definido por ser o primeiro evento numa janela de tempo de pelo menos 5 mseg, uma extremidade de explosão, sendo o último caso de uma janela de tempo de pelo menos 25 ms (ver Heidemann et al. 10). </li><li> Para quantificar a regeneração funcional calcular a porcentagem de explosões sincronizadas entre as duas fatias. Para fazer isto, calcule a latência entre uma explosão numa fatia e a seguinte explosão na outra fatia. Nota: Um par de ruptura é denominado &quot;sincronizado&quot;, quando a latência é menor do que o comprimento de ruptura médio. Especialmente em co-culturas com uma grande quantidade de actividade, existe a possibilidade de ambos os lados coincidentemente iniciar uma explosão na janela latência escolhido. Este facto deve ser tido em conta na quantificação da percentagem de SYrajadas nchronized. Para uma descrição pormenorizada dos cálculos ver Heidemann et ai. 10. </li></ol> 8. Fixação das Culturas e imunohistoquímica <ol><li> Para todas as etapas que incluem a lavagem ou incubação certifique-se de colocar as culturas em uma mesa basculante para garantir a difusão adequada da solução através do tecido. </li><li> Imediatamente após a sessão de gravação for concluído tomar a montagem MEA / cultura para fora da instalação, colocá-lo em uma placa de Petri (35 mm x 10 mm) e adicionar cerca de 2 ml de solução extracelular. </li><li> Para separar as fatias a partir de células que rodeiam as camadas que se formaram durante o tempo in vitro, ter uma ponta de pipeta 10 ul e circundar as fatias. Preste atenção para não danificar as culturas. É possível omitir este passo, mas incorporando mais tarde é mais fácil quando esta é realizada. </li><li> Use uma agulha de seringa não metálica fina (ver lista de materiais), em combinação com uma seringa de 1 ml preenchido com soluti extracelularsobre a soprar delicadamente a cultura fora do MEA. </li><li> Remover a ponta de uma pipeta de Pasteur e encaixar o bolbo de borracha na extremidade lascas. Utilizar a extremidade traseira para transferir a cultura em fixador (paraformaldeído a 4% com solução salina tamponada com fosfato (PBS, 0,1 M)). Não use o padrão ponta da pipeta Pasteur para a transferência, porque é muito pequeno e as culturas seriam dobradas e provavelmente danificado. Fix durante 1 - 2 h a 4 ° C. Lavar o MEA com água destilada e remover os resíduos de tecido com os dedos, mas não arranhar com a unha. Loja AAM em água destilada a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as culturas 3x em PBS durante pelo menos 10 min cada. Armazenar em PBS a 4 ° C ou começar directamente com o processo de coloração. </li><li> Incubam-se as culturas durante pelo menos 90 minutos em solução de (5% de soro de cabra, 1% de albumina de soro bovino, 0,3% de detergente em PBS) de bloqueio. </li><li> Adicione o primeiro anticorpo diluído em solução de bloqueio e incubar durante 3 noites a 4 ° C. </li><li> Lavar 3x em PBS durante pelo lleste 30 min cada. </li><li> Adicionar o segundo anticorpo diluído em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3x em PBS durante pelo menos 30 minutos cada. </li><li> Transfira as fatias com uma pipeta Pasteur com ponta removido em um objeto slide. Retire o excesso de PBS e incorporar com meio de montagem. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Vários elementos do processo apresentados são fundamentais para a realização de experimentos precisos e reprodutíveis. Todos os passos durante a preparação das soluções e meas, a produção das culturas de fatias são realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. Os antibióticos não são aplicados ao meio nutriente, pois podem afectar a actividade espontânea 14. Durante o revestimento MEA, a parte mais importante é certificar-se que a solução de gel matriz extracelular permanece frio em todos os momentos. Descongele na geladeira e mantê-lo em gelo durante todo o procedimento para garantir uma temperatura máxima próxima de 0 ° C. Durante a preparação do fatias rápido isolamento e corte, bem como prestar atenção a uma baixa temperatura, utilizando gelo buffers dissecção fria aumenta a porcentagem de culturas saudáveis. Além disso, o / trombina coagulação do plasma é um dos passos mais críticos. Primeiro, certifique-se de que o plasma é adequadamente mixed com a trombina. Em segundo lugar, prestar especial atenção à remoção de resíduos tanto quanto possível para assegurar a fixação adequada das fatias para os acordos ambientais multilaterais. Este passo é extremamente sensível ao tempo; Se o intervalo de tempo for demasiado curto, o excesso da mistura de plasma / trombina é removido. Se o intervalo de tempo for demasiado longo, já ocorreu coagulação, aumentando o risco de a remoção das fatias, juntamente com o resíduo de plasma / trombina. Se as lesões mecânicas são planejadas, é importante a utilização de acordos ambientais multilaterais, com um planeamento cuidadoso. A área onde a lesão se destina precisa estar livre de eletrodos, fios e isolamento. Caso contrário, o sistema eléctrico do MEA vão ser danificado e, portanto, não há gravações pode mais ser executada. Um outro passo crucial diz respeito ao tamanho da lesão. Foi demonstrado anteriormente que a reconexão duas pequenas fatias após lesão leva cerca de dois dias a 10. Para todos os experimentos, a regra de ouro foi usado que o espaço betwebr as fatias após lesão não deve ser maior do que a largura da ranhura de MEA (300 uM). Um tamanho maior lesão pode resultar em um prazo mais longo para a reconexão ou, se a lesão é muito grande, não reconexão em tudo. Para anotar, ex experiências revelaram que uma colocação inicial das duas fatias mais longe do que 1 mm resultados em uma taxa de ligação muito reduzida. Antes do início da gravação, um tempo de ajuste de pelo menos 10 min à temperatura ambiente, em vez de 37 ° C da incubadora, e à solução extracelular, em vez do meio de nutrição é recomendado. Fechar observação do padrão de atividade durante esses minutos iniciais garante que os dados medidos representam o padrão estouro da cultura de forma adequada após a gravação foi iniciada. Para a detecção da actividade, aquisição de dados e posterior processamento, hardware caseiro (câmara de gravação, ligações para os amplificadores e amplificadores), programas em laboratórioVIEW, C ++ e IgorPro são usados. Setups MEA comerciais e outros pacotes de software são adequados, bem como para estas operações. Aqui, os sinais observados pelos eléctrodos são amplificados de 1001 vezes e, em seguida digitalizou a uma taxa de 6 kHz. O modelo apresentado pode ser uma ferramenta útil para examinar as conexões propriospinal porque in vivo, eles são difíceis de estudar sem a interferência do ascendente e descendente feixes de fibras. O co-cultura das duas fatias de medula espinhal pode elegantemente contornar este problema. As culturas proporcionar um microambiente que pode ser rigorosamente controlado e manipulado facilmente. Por outro lado, a entrada sensorial e supraespinal é falta de curso. Além disso, o processo da preparação de cultura representa uma situação de lesão do SNC. As células da glia como microglia e astrócitos são conhecidos por responder à lesão com o aumento da proliferação e, portanto, o tecido é, em certa medida reorganizado. Relativa ao modo apresentadol a formação de uma cicatriz glial após a realização de lesões mecânicas não foi observado. Uma explicação pode ser que os mecanismos adaptativos de astrócitos já foram desencadeadas durante o processo de preparação e que as lesões das culturas não resultou em uma resposta ainda mais. Além disso, não há evidências para o envolvimento de inibidores associados mielina, por exemplo., Nogo-A, em baixo potencial de regeneração de culturas lesionados em idade avançada. No entanto, foi demonstrado que o tratamento com o inibidor da fosfodiesterase 4 Rolipram, começando imediatamente após a realização de lesões em 23 DIV aumenta a regeneração funcional entre as fatias 10. Estes resultados demonstram que a recuperação funcional pode ser aumentado em culturas velhas. Visivelmente, quando a contagem do número de axônios que cruzam o local da lesão, não houve diferença entre as culturas lesionados em uma idade jovem e culturas lesionados em uma idade avançada foi descoberto. Estes resultados sugerem que a falta de regeneração axonal não é a razão principal fou a perda de recuperação após lesões tardias na cultura e, portanto, enfatizam a necessidade de um modelo que permite a análise funcional da regeneração. Formação sináptica e plasticidade sináptica poderia desempenhar um papel importante no processo de recuperação 10. Estes mecanismos ganhou muita atenção nos últimos anos e é hoje amplamente aceito que eles têm um grande impacto sobre o resultado após a lesão medular. Portanto, um modelo que proporciona condições estáveis ​​para a investigação dos processos em isolamento e em grande detalhe pode certamente ajudar a obter uma visão sobre a regeneração funcional na medula espinhal.

Culturas organotípicas de fatias do sistema nervoso central (SNC) tem sido amplamente utilizado para estudar vários fenómenos fisiológicos e patológicos que vão desde o desenvolvimento neuronal a neurodegeneração. Em comparação com culturas de células dissociadas, fatias organotípicas oferecem a vantagem de uma maior complexidade com um citoarquitetura intacta e circuitos sináptica local. Ao mesmo tempo, o tecido pode ser analisada de uma maneira isolada, sem a necessidade de comprometer a complexidade do conjunto no contexto in vivo. Além disso, o acesso fácil e repetido para as células de escolha é justificada, o ambiente extracelular pode ser controlada com precisão e, geralmente, em modelos in vitro são menos onerosos do que os seus homólogos in vivo. Nos últimos anos, vários estudos apresentados semelhanças notáveis ​​entre os perfis de desenvolvimento de culturas de longo prazo contra os animais que vivem correspondente 1,2. Demonstrou-se que os circuitos neuronais do CNS vários Regions expressar atividade de rede espontânea durante o desenvolvimento e que fatias organotípicas manter parcialmente este fenómeno 3 -7. Isolado preparações da medula espinal têm sido especialmente usados ​​para investigar geração ritmo 6 e a formação de circuitos neuronais 1. Uma maneira de gravar a atividade espontânea de fatias organotípicas é a cultura deles em cima de arrays multi-eletrodo (AMA). Estes dispositivos contêm múltiplos eletrodos que podem monitorar os potenciais extracelulares geradas por potenciais de ação de numerosas células simultaneamente (gravação multi-unidade). A alta resolução temporal das gravações MEA pode ser usado para reconstruir a dinâmica atividade precisa dentro de um dado circuito neuronal. Além disso, em contraste com o remendo de fixação da técnica é não-invasiva, que permite medições de longo prazo e que resulta no fato de que os neurónios não são afectados no seu comportamento. Fou o propósito deste estudo, a combinação de organotípicas espinal medula co-culturas e gravações multisite foi utilizado para investigar a regeneração funcional no interior da medula espinal. Desde adultos vertebrados superiores têm potencial para recuperar de danos da espinal medula limitado, diferentes estratégias têm sido estudados para promover a regeneração após a lesão da medula espinal. Até agora, o trato corticoespinhal geralmente tem sido o sistema de modelo de escolha para tais investigações. Estas experiências são geralmente demorado, caro e exige grandes grupos de animais, devido à alta variabilidade dentro dos grupos individuais. Além disso, as evidências sugerem que as conexões propriospinal (neurônios que são totalmente confinados dentro da medula espinhal) pode desempenhar um papel fundamental no processo de recuperação após lesões da medula espinhal 8. Estas fibras são difíceis de estudar in vivo sem a interferência de ascendentes e descendentes tratos de fibras. Bonnici Kapfhammer e 9 utilizada medula espinhal longitudinalculturas fatia de ratos pós-natais como uma abordagem alternativa. Após a realização de lesões mecânicas eles analisaram semi-quantitativamente a regeneração morfológica de axônios entre segmentos da medula espinhal. Eles observaram menos, mas não nenhum axônios que cruzam o local da lesão em culturas cortadas em uma idade madura. Em contraste, as culturas que foram lesionados numa fase mais jovem exibido uma elevada quantidade de regeneração axonal 5 - 7 dias após o dano. No entanto, a prova para conexões funcionais não foi apresentada. Por conseguinte, o desenvolvimento de um modelo in vitro representativo de fibras propriospinal que permite a investigação de regeneração funcional pode ser uma ferramenta valiosa para estender o nosso conhecimento sobre os processos de regeneração da medula espinhal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Planar multielectrode array</td>
			<td>Qwane Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>custom-made according to the design of our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>80 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled, sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor-7S [5ng/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0513</td>
			<td>200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>reconstituted in wash solution with 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mg/L]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular solution (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mM]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent: Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3%, harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td align="right">5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2366</td>
			<td>Lyophilized, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gabazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SR-95531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mecamylamine hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2843</td>
			<td>toxic if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>harmful, 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-31</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-31P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-32</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-32R-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0532</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1123740001</td>
			<td>irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flat tube 10 (= roller tube)</td>
			<td>Techno Plastic Products AG</td>
			<td>91243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Para investigar o potencial para a recuperação funcional dos co-culturas derivadas da espinal medula de embriões de rato E14, lesões foram realizados em uma janela de tempo de 8-28 DIV. 2 a 3 semanas mais tarde, a atividade neuronal espontânea foi gravado com os acordos ambientais multilaterais (Figura 1 C &amp; D). Os potenciais de ação extracelular registrados foram identificados off-line para cada eletrodo indivíduo (Figura 1E). A partir destes dados foram gerados lotes de varredura (Figura 1F), seguido por parcelas de actividade de rede para visualizar a actividade total separadamente de cada lado (Figura 1G). Em cada fatia da atividade espontânea é normalmente organizado em rajadas. Se as fatias estão funcionalmente ligados, estes rajadas pode propagar de uma fatia para o outro. Portanto, a quantidade de rajadas sincronizados entre as duas fatias foi calculada para medir quantitativamente a regeneração funcional. Para uma descrição detalhada de como a transformação into as diferentes parcelas é realizado e como a fórmula para calcular a porcentagem de atividade sincronizada foi derivado, consulte Heidemann et al. 10. Em todas as experiências, a actividade foi registado em primeiro lugar sob as condições padrão. Num segundo passo, a inibição sináptica foi bloqueada por adição de estricnina (1 uM) e gabazine (10 uM) à solução de banho extracelular. Isto conduz geralmente a desinibição de um padrão de actividade mais regular com rajadas e prolongados intervalos de explosão, o que facilita a definição de rajadas e, assim, a determinação de rajada de sincronização entre as fatias. Culturas lesionados numa idade jovem (7 - 9 DIV) exibido uma elevada quantidade de actividade sincronizado 2-3 semanas após a lesão lesionado ao passo que as culturas nos estádios mais tardios (&gt; 19 DIV) mostraram uma nítida redução na capacidade de regenerar (Figura 2 A - F). Estes resultados indicam que a capacidade de regeneraçãode conexões funcionais da coluna vertebral em culturas fatia cordão diminui a partir de um nível elevado, representando o estado embrionário in vivo, a um nível baixo, o que representa o estado mais desenvolvido in vivo, no prazo de três semanas em cultura. Que tipos de conexões estão realmente envolvidos na sincronização estourou entre as duas fatias? Além conexões propriospinal, as fibras também pode surgir a partir de neurónios motores ou dorsal neurônios do gânglio da raiz. Foi demonstrado anteriormente que os neurónios do gânglio da raiz dorsal não são relevantes para a ligação funcional entre a medula espinal 10 fatias. No entanto, o envolvimento dos neurónios motores permaneceu uma possibilidade. Desde motoneurons são conhecidos para formar conexões colinérgicos para neurônios da medula espinhal através de receptores nicotínicos 13, a atividade da medula espinhal co-culturas foi gravado em 8 DIV, num momento em que as culturas mostram altamente atividade 10 sincronizado, e o antagonista nicotínico Mecamilamina (MEC, 100 pM) foi adicionada à solução do banho extracelular. A participação de motoneurónios na conexão entre as duas fatias iria resultar numa diminuição da percentagem de actividade sincronizado. No entanto, este não era o caso (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; controle: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p&gt; 0,05, teste pareado de Wilcoxon). Estes resultados sugerem que as sinapses colinérgicas não contribuem para a ligação funcional entre fatias. No entanto, uma vez que os motoneurónios também foram exibidas para libertar glutamato nas sinapses no sistema nervoso central 11, 15, estas experiências não excluir totalmente o seu envolvimento. Para identificar motoneurons colorações de imuno-histoquímica contra a neurofilament não fosforilada H com SMI-32 foram realizadas. Eles revelaram vários corpos rotulados grandes celulares típicos para motoneurons, distribuídos ao longo do fatias (Figura 3A). O anticorpo SMI-32 tem sido relatado para rotular os corpos celulares de motoneurons 12 e esta constatação também vale para as culturas utilizadas 13. Além disso, colorações de corpos celulares neuronais em geral, por exemplo, contra o b-III-tubulina ou NeuN, bem como corpos celulares gliais, por exemplo., Astrócitos com anticorpo GFAP estão em linha com outros relatórios e combinar as descrições morfológicas desses tipos de células ( Figura 3 B - D). No entanto, a rotulagem dos axônios com o anticorpo SMI-32 é relativa (Figura 3E). Contra as expectativas, uma enorme rede de fibras aparece quando usando este anticorpo e parece semelhante à coloração SMI-31 que rotula fosforilada neurofilament H (Figura 3F). Uma interpretação desse resultado poderia ser que a regulação do desenvolvimento de neurofilament fosforilação / desfosforilação não é tão apertado nas culturas utilizadas em relação à situação in vivo. Uma ocorrência mista de neurofilamentos fosforiladas e não fosforiladas-no mesmo axónio pode explain este achado. Outra possibilidade é que os SMI-32 axónios marcados surgir a partir de neurónios de projecção. Tsang e seus colegas demonstraram que 16 por exemplo, colunas e colunas de células intermediolateral neurônios de Clark estão manchadas pela SMI-32 além de neurónios motores. Proliferação de neurites pronunciado desses neurônios também poderia explicar a abundância de SMI-32 fibras positivos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> Figura 1. Visualização e análise da atividade espontânea. (A) Diagrama de um MEA. Os eletrodos de platina coberto são retratados em preto, os fios transparentes em vermelho e do sulco no meio do MEA em amarelo. (B) Close-up do conjunto de eléctrodos localizados no centro da MEA. Os diagramas são gentilmente cedido pelo Dr. M. Heuschkel. Imagem de campo brilhante de um velho cultur 8 DIV (C)e. As fatias foram cultivadas e fundida ao longo dos lados voltados um para o outro. A barra amarela representa o sulco electrode- e sem isolamento do MEA. Barra de escala = 400 mm (D) Timeline de experimentos. Duas fatias de medula espinhal de embriões de ratos E14 são colocados ao lado do outro em acordos ambientais multilaterais. Dentro de poucos dias, as fatias de crescer e se fundem ao longo dos lados voltados um para o outro. Em um prazo de 8-28 DIV, lesões completas são realizadas através do site de fusão. Duas a três semanas mais tarde, a actividade espontânea é registada e as culturas são fixadas por colorações imuno-histoquímica. (E) vestígios atividade espontânea de cada eletrodo individual de uma cultura de 23 DIV idade. Para visualização mais clara, única a cada segundo traço é ilustrada. Traços de laranja retratam atividade que foi gravada a partir da fatia no lado direito, traços azuis do lado esquerdo. A maioria das @ bursts @ são sincronizados entre os dois. A seta aponta para uma explosão que ocorrem na fatia deixou que só partially propagadas para a fatia direita. A actividade na fatia direita no entanto não atinja o limiar escolhido de pelo menos 25% do pico de actividade máxima média de acordo com o lado e, por conseguinte, não é detectada como uma explosão. Ampliações à direita retratam o último par explosão sincronizado. (F) Raster gráfico da actividade mostrada em (E). (G) lote de atividade de rede com rajadas definidos (barras abaixo da linha de base) da atividade mostrada em (E). Adaptado de Heidemann et al. 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> Figura 2. Sincronizado ou Atividade não sincronizado. (A, B) parcelas Raster de culturas Lesioned em idade jovem (a 7 - 9 DIV), que mostra a actividade sincronizados sob condições padrão (A) e sob desinibição (B). (C, D) parcelas raster de culturas lesionados em idade avançada (a&gt; 19 DIV), que apresentam uma actividade não sincronizado, sob condições padrão (C) e sob desinibição (D). (E, F) Percentagem média de actividade sincronizado representada para cada lesão individual dia registada sob condições padrão (E) e sob desinibição (F). As gravações foram tomadas 2 - 3 semanas após o dia da lesão. Adaptado de Heidemann et al. 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterização imuno-histoquímica. (A) Coloração de corpos celulares motoneurônio com SMI-32. (B) tubulina rotulagem de corpos celulares neuronais maduros e os seus processos de β-III. (C) Identificação de astrócitos com GFAP. (D) Rotulagem de corpo celular neuronal maduro com NeuN. (E) SMI-32 coloração de não-fosforilada neurofilament H. (F) neurofilament fosforilada H identificado por SMI-31. Adaptado de Heidemann et al. 10. Note-se que com ambos, SMI-31 e SMI-32, uma grande rede de fibras é visível nas culturas. Bares AD = 20 mm, H &amp; F = 100 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Aqui apresenta-se um protocolo que é baseado em fatias de medula espinhal cultivadas em matrizes multi-eléctrodos para estudar a regeneração funcional de ligações propriospinal in vitro.

Investigando regeneração funcional em organotï¿½icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

investigating-functional-regeneration-organotypic-spinal-cord-co

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.0K visualizações.  University of Bern.  Aqui apresenta-se um protocolo que é baseado em fatias de medula espinhal cultivadas em matrizes multi-eléctrodos para estudar a regeneração funcional de ligações propriospinal in vitro. 

Vídeo: Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Do gânglio espiral Neuron Explant Cultura e Eletrofisiologia em multi-eléctrodos Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Treinamento baseado em atividade em uma esteira com medula espinhal ferido de ratos Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Análise automatizada da marcha para avaliar a recuperação funcional em roedores com lesão de contusão do nervo periférico ou da medula espinhal

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...