This work was supported by NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund, and RPB grants.

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade Estadual de Wayne. 1. Preparação de Solução Experimental <ol><li> Preparar a solução de dissecção de 1 dia a 1 semana antes da experiência real. Use uma solução tampão HEPES para dissecção da retina devido à sua forte capacidade de tamponamento em temperaturas mais baixas 16. Misturar todos os produtos químicos da seguinte forma (em mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 de CaCl2, 1,0 de MgCl2, 10 HEPES, 28 glucose. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH. Manter a solução no frigorífico até 1 semana. </li><li> A solução de gravação é o meio de Ames &quot;, o qual é um fluido cerebrospinal artificial (ACSF) concebido para preparações da retina 17. No dia da experiência, pesam-se pó de Ames (4,4 g por 500 ml de solução) num tubo. Além disso, pesam-se NaHCO3 (0,95 g por 500 ml de solução) e misturar com o Apó &#39;mes. </li><li> Preparar a solução pipeta intracelular para gravações de patch clamp pelo dia do experimento. Misturar todos os produtos químicos da seguinte forma (em mM): 111 K-gluconato, 1.0 CaCl2, 10 de HEPES, 1,1 de EGTA, 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 de ATP-Mg, 1,0 e GTP-Na. Ajustar o pH para 7,2 com KOH. Filtra-se a solução da pipeta com um filtro de seringa convencional. Faça ~ 500 mL alíquotas e armazená-los em um freezer ou congelador. </li></ol> 2. Preparação para o Dia da Experiência <ol><li> A noite antes do experimento, coloque um rato em uma gaiola (C57BL / 6J ou fundo semelhante, 4-8 semanas de idade, do sexo masculino) em um espaço escuro para O / N adaptação ao escuro. </li><li> Preparação para dissecção: <ol><li> Encha solução de dissecação (100-200 ml) num copo de vidro, colocá-lo em gelo, e com bolha de oxigénio durante pelo menos 10 min. </li><li> Comece a oxigenação da caixa escura para armazenamento de preparação da retina. </li><li> Prepare lamelas de plástico com trilhos de graxa para repreparações fatia Tinal e coloque cada um deles em um 35 milímetros de plástico prato. </li><li> Coloque uma nova lâmina de barbear para um helicóptero (fatiador de tecidos). </li><li> Cortar uma membrana de filtro em duas metades. Isto é para o corte da retina. </li><li> Alinhar as ferramentas de dissecação e pipetas de transferência de perto o microscópio de dissecação. A área de trabalho deve ser bem organizado para que cada ferramenta pode ser facilmente acessado no escuro. </li></ol></li><li> Preparação para as gravações da braçadeira patch: <ol><li> Dissolve-se pó de Ames e NaHCO3 em água destilada (Ames 4,4 g de NaHCO 3 e 0,95 g / 500 ml ddH2O). A forma da bolha de Ames misturado com oxigénio (95% de O2 e 5% de CO 2) durante pelo menos 30 minutos enquanto se aquece para um nível de temperatura de gravação (~ 35 ° C). Ajustar o pH a 7,4 com NaHCO3 enquanto ainda borbulhante. </li><li> Descongele a solução pipeta interna durante a dissecção. Depois que ele for descongelado, adicione 0,01% sulforrodamina B para a coloração intracelular. </li></ol></li></ol> 3. Retinal Dissection <ol><li> Em um quarto escuro, eutanásia do mouse usando o dióxido de carbono e pneumotórax bilateral. Depois de 2-3 min de usar o dióxido de carbono, o mouse vai perder a consciência. </li><li> Quando o mouse não responde mais a uma pitada cauda, ​​enuclear rapidamente os olhos e colocá-los em uma solução de dissecação fria em um prato de plástico. Realize o pneumotórax bilateral para garantir a morte do animal. Rapidamente armazenar o olho no prato na caixa escura. Use um visualizador de infravermelho para realizar o procedimento no escuro. NOTA: Como alternativa, o isoflurano, decapitação, ou deslocamento cervical pode ser usado para eutanásia. O método de eutanásia deve seguir as orientações do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e / ou o Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional. </li><li> Em um quarto escuro, ajuste o microscópio de dissecação e iluminação infravermelha. Sob o microscópio, transferir um olho a partir do seu prato num prato plástico 10 centímetros wom a solução arrefecida dissecação. Continuamente bolha de oxigénio através de tubos colocados no fundo do recipiente de plástico. Ajustar o volume de fluxo de modo que não é demasiado baixa, mas assegurar que não é suficientemente elevada para perturbar a dissecção. </li><li> Córnea e do cristalino remoção: <ol><li> Realizar uma incisão na parte superior da córnea com uma faca de micro-cirúrgica. Segurando o nervo óptico no extremo oposto do globo ocular impede o olho de se mover. Estender o corte usando um par de tesouras cirúrgicas. Cortar a córnea com alguns esclera em torno dele. </li><li> Agarre a lente com uma pinça fina e puxe lentamente a lente para fora. Se o vítreo é demasiado pegajoso para remover o cristalino, corpo vítreo cortado com uma tesoura. </li><li> Uma vez que o olho-copo é feito, coloque delicadamente, solução de dissecação oxigenado frio para a ocular com uma pequena pipeta de transferência. NOTA: O globo ocular esvazia rapidamente depois é feita uma incisão na córnea. É importante manter a forma do olho como deformando o olho durante este proprocedimento pode danificar a retina e causar descolamento de retina. </li></ol></li><li> Identificando os lados dorsal e ventral da retina: NOTA: Por causa da distribuição desigual do verde e do ultravioleta (UV) cones 18, a identificação de uma área específica da retina é importante para as gravações de resposta à luz. <ol><li> Identificar a linha que vai do outro lado da taça dos olhos retinal passando perto da cabeça do nervo óptico. Esta linha passa principalmente através do lado ventral do nervo óptico; o lado incluindo o nervo óptico é o lado dorsal, enquanto o outro é ventral 19. Veja este marco claramente sob telespectadores infravermelhos. </li><li> Dependendo da finalidade da experiência, fazer um corte no lado desnecessária. Isto será útil após o isolamento da retina a partir da taça dos olhos. </li></ol></li><li> Remoção Vítreo: <ol><li> Opcionalmente, incubar o olho de taça com hialuronidase (0,5 mg / ml) durante 15 min. </li><li> Retire o vítreo com uma pinça extra-finos. O vítreo é principalmentecolocado no fundo e o bordo exterior do olho de taça. Delicadamente, removê-lo sem tocar ou picar a retina. Como o vítreo pode ser firmemente ligado à ocular, retire com cuidado para evitar o descolamento da retina do olho-cup. Continue a puxar até que nenhuma tensão é sentida. NOTA: Este passo é particularmente importante para dissecar as retina do rato; no entanto, não é um problema para as retinas de outras espécies, tais como o rato ou salamandra. </li></ol></li><li> Isolar a retina do olho-cup. Agarre a esclera e retire com cuidado a retina usando a parte traseira de uma pinça. NOTA: Total de montagem preparações da retina pode ser feita a partir da retina isolada. Faça 3-4 cortes nas bordas e achatar a retina, ou cortar a retina em vários pedaços. </li><li> Apare a retina e descartar a metade desnecessária da retina (passo 3.5). No mesmo prato de plástico, cortado a retina restante em dois pedaços. Para cada pedaço da retina, cortar as bordas para fazer umalaje de retina, e aparar as arestas de dobragem. </li><li> Transferir uma laje da retina numa placa de vidro utilizando uma pipeta de transferência grande (~ 2 ml). Suga-se o excesso de solução com uma pequena pipeta, usar um pedaço de papel de filtro para achatar a placa e, em seguida, colocar rapidamente uma parte da membrana de filtro na parte superior do tecido. <ol><li> Utilizando uma pequena pipeta de transferência, colocar uma gota de solução sobre a membrana de filtro de dissecação. Espera ~ 15 seg, até a solução se espalha através da membrana. Durante este tempo, o tecido da retina vai ficar com a membrana de filtro. </li><li> Despeje solução de dissecação mais frio sob e ao redor do filtro. O tecido da retina com a membrana de filtro irá flutuar. Agarrar a membrana de filtro com uma pinça e colocá-lo na câmara de corte. Despeje solução dissecar sobre o tecido, e armazenar a preparação na caixa escura. NOTA: O procedimento descrito aqui é crítica. É importante realizar estes passos rapidamente para assegurar que as varas de tecido da retina para os filtros de membrana e não seque. </li></ol></li><li> Utilizando um cortador, cortar o tecido da retina em fatias. Cerca de 200 m de espessura é viável para estudos de fixação de membranas. </li><li> Coloque uma lamela de plástico com trilhos de graxa na câmara de corte. Transferir uma fatia da retina em cima dos trilhos de graxa em uma lamela de plástico. Girar a fatia 90 °, de modo que a secção transversal é visível. Pressionar a membrana do filtro para baixo sobre a lamela e, em seguida, cobrir os lados do papel de filtro com graxa. <ol><li> Após a fatia é imobilizada em uma lamela de plástico, pegue a lamela e transferi-lo para a 35 mm plástico prato. Despeje solução de dissecação fria sobre o preparo da retina e mergulhe a preparação. Armazenar cada prato na caixa escura, a qual deve ser continuamente oxigenado. NOTA: Todo o procedimento precisa ser feito com cuidado para que a membrana do filtro não está deformado. Caso contrário, a fatia da retina facilmente se separa da membrana de filtro. </li></ol></li></ol><ol><li> Gravação de preparação: <ol><li> Prime os tubos de perfusão com meio Ames &#39;. Permitir que todas as bolhas para atravessar ao encher a tubulação. </li><li> Faça pipetas de gravação patch clamp com um puxador. Para preencher uma pipeta com a solução de pipeta, mergulho na parte traseira de uma pipeta de 1 min até a ponta da pipeta é aterrado. Em seguida, encher ~ 1/3 da pipeta usando um material de enchimento de micro-pipeta. Guarde cada pipeta em uma caixa de pipeta úmido. </li><li> Ligue o equipamento para gravações de patch clamp; incluindo o computador, amplificador, câmera CCD, e microscópio. </li></ol></li><li> Desligue a luz da sala. Coloque uma preparação fatia da retina para a câmara de platina do microscópio usando um visualizador de infravermelho. Depois é imobilizado, começar a perfusão contínua. Regule a temperatura de perfusão em 33 a 37 ° C. </li><li> Ver a superfície da fatia com a câmera CCD. Concentre-se no local de destino onde o ce-alvotipos ll residem. Selecione uma célula de aparência saudável para correção de gravação grampo (ou seja, ele deve ter a superfície lisa para o futuro e uma forma da célula bom). </li><li> Coloque uma pipeta de gravação num suporte pipeta. Avança a pipeta para a preparação fatia. Quando se está perto da preparação fatia (~ 2 milímetros acima), encontrar a ponta da pipeta com o microscópio. Uma vez que a ponta da pipeta é visível ao microscópio, mover a ponta para baixo para a célula alvo. </li><li> Defina o amplificador. Ajustar a pipeta a 0 mV / 0 pA (zeroing) e iniciar um pulso elétrico contínuo de ~ 5 mV em ~ 10 Hz. Verificar a resistência pipeta; resistência ideal é entre 5 e 10 mohms para a maioria dos neurônios da retina. </li><li> Comece soprando para fora da ponta. Usar um bocal, ou utilizar uma seringa, para aplicar pressão positiva quando a pipeta mergulha na solução de banho. Continuamente soprar a solução interna até que a ponta está localizada na superfície da célula alvo. <ol><li> Quando a pressão positiva faz uma pequena covinha no thsuperfície celular e, avançar a ponta ligeiramente e parar de soprar. Verificar a resistência pipeta, que deve aumentar. Se ele está aumentando continuamente, deixá-lo e monitorar a resistência até que ele atinja&gt; 1 GÊ (gigaseal). Se a resistência não aumenta de forma espontânea, aplique suavemente pressão negativa até que se torne um gigaseal. </li></ol></li><li> Após a gigaseal é conseguido, mudar o potencial de manutenção de -70 mV. Em seguida, aplicam-se de forma intermitente de pressão negativa para romper a membrana dentro da ponta da pipeta. Quando a configuração de célula inteira é feita, a resistência pipeta pode estar entre 500 e 1 GÊ mohms, e a corrente capacitiva é visto. Às vezes, as correntes pós-sinápticos espontâneas podem ser observados. </li><li> Grave a relação IV de -80 a +40 mV. Diferentes tipos de canais dependentes da voltagem são activados dependendo do tipo de célula. </li><li> Grave luz evocou-correntes sinápticas ou tensões. </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

Good recordings can only be achieved with good retinal preparations and well-designed patch clamp setups. Although all the steps described above are important, the discussion highlights some critical steps both for the dissection and recordings. 
For dissection, two things are especially important: cooling and oxygenation. After enucleating the eye, quickly remove the front part of the eye in a dissecting chamber with oxygen-bubbled, cooled dissecting solution, and pour cold solution into the eye-cup. When the retinal tissue is in the dissecting chamber, cold solution should be poured on the tissue every 10 min. The tissue should be sliced quickly without pulling or poking the retinal tissue during the dissection, which could easily damage its structure. Using good dissecting tools (sharp forceps and scissors) is also crucial. A chopper is equally as effective as a vibratome because it allows for speedy maneuvering. Extra-fine forceps should be used to remove vitreous matter as efficiently as possible because residual vitreous damages the retinal structure when slicing the tissue.
Beginners tend to damage the retina when removing the lens. The retina can detach from the eye-cup, or can even be accidentally removed with the lens. To avoid this issue, the sclera can be cut around the Ora Serrata which is located close to the extra-ocular muscle attachment point. An eye-cup with a wide opening makes it easier to remove the lens. Also, it is important not to deform the eye when removing the front portion. Another critical point is fixing the retinal slice onto a coverslip. This can be facilitated by practicing rotating the filter paper without distorting it to prevent the retinal slice from coming off during the experiment. 
A sturdy, well-built rig is crucial for patch clamp recordings. It must be free of electric noise, vibration, and pipette drifting. In addition, light response can be recorded in dark conditions to prevent desensitization. Our cage is made with a metal frame and aluminum panels with black plastic drapes that act as an electric shield while also completely blocking light from entering the cage; computer monitor illumination will not affect the retinal preparation. Use a remote controller for the pipette manipulator and close the cage while setting up the patch clamp configuration, which also avoid illuminating the preparation.
Although we have been tried to simplify the procedures involved, patch clamp study is still a difficult experiment that requires extensive knowledge and training. An automated patch clamp has been developed by some groups20; this system is applicable to dissociated cells and might be an efficient technique for pharmacological screenings. 
In summary, patch clamp recording in dark-adapted retinal slice preparations is a useful technique to investigate visual information processing. Compared to other methods, patch clamp offers better temporal and spatial resolution. Additional technical innovations will make the patch clamp method more user-friendly in the near future.

The retina is one of the unique parts of the nervous system. As an accessible part of the brain, its synaptic architecture has been well characterized. In addition, the functions of this neural network can be examined with a physiological stimulus: light. If the retinal tissue is isolated in a dark room with appropriate procedures, neurons in the tissue will respond to light. This preparation has been used to study visual signal processing and elucidate various synaptic mechanisms and neural network functions, as well as disease mechanisms. 
Light responses in retinal neurons have been recorded for decades. Early studies used sharp electrodes to make intracellular recordings from mudpuppy retinal neurons1. In the 1980s, the patch clamp technique was invented2, and soon became a popular method among vision researchers3,4. Single cell recordings from lower vertebrates, including mudpuppy and fish retinal neurons, were popular methods that contributed to the elucidation of visual signal processing mechanisms5,6. 
After genetic mutation techniques were developed, the mouse retina became a more popular model for vision researchers7-9. The mammalian retina is more attractive than that of lower vertebrates because it is evolutionarily closer to the human retina, and there is an opportunity to use disease models. However, mouse retinal cells are small and fragile10, and making retinal preparations and conducting patch clamp recordings in a dark room is challenging. As technology has improved, diverse approaches have become available to study visual signaling mechanisms such as imaging studies11 and the electroretinogram (ERG)12. Nevertheless, single cell recording with the patch clamp method is still important because it is highly temporally and spatially sensitive compared to other methods. Therefore, we have continuously conducted patch clamp recordings and improved our methods to investigate visual signal processing in mouse retinal slice preparations13-15.
In this video tutorial, the protocols are presented with important tips. Good recordings can only be achieved with good preparation. Practicing animal dissection and building a sturdy patch clamp rig will enable most researchers to achieve successful recordings.

<table><tbody><tr><td>Mice (28-60 days old, male)</td><td>Jackson laboratory</td><td>C57BL/6J strain</td><td></td></tr><tr><td>Ames&#039; medium powder</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: forceps</td><td>Dumont</td><td>#4, #5, #55</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Dissecting tool: surgery knife</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Razor blade (for chopper)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Chopper</td><td>handmade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared viewer</td><td>Night Owl Optics</td><td>NOBG1</td><td>It shows bright view. Focusing small objects is an issue.</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>excellent; makes consistent size pipettes.</td></tr><tr><td>Dark box</td><td>Pelican</td><td>dark box</td><td>excellent</td></tr><tr><td>Patch clamp system</td><td>Scientifica</td><td>slice scope 2000</td><td>Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent.</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>multiclamp 700B</td><td>Excellent and easy control.</td></tr><tr><td>Acquiring software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp software</td><td>Excellent and easy control.</td></tr><tr><td>Light source (LED)</td><td>Cool LED</td><td>pE-2 4 channel system</td><td>Excellent</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Q-imaging</td><td>Retiga 2000</td><td>Excellent</td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>handmade</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques

A retina é a porta de entrada para o sistema visual. Para entender os mecanismos de processamento de sinais visuais, investigamos as funções de rede neurais da retina. Neurónios retinais na rede compreendem numerosos subtipos. Mais do que 10 subtipos de células bipolares, células ganglionares e células amacrine foram identificadas por estudos morfológicos. Vários subtipos de neurônios da retina são pensados ​​para codificar características distintas de sinalização visual, tais como movimento e cor, e de múltiplas vias neurais. No entanto, os papéis funcionais de cada neurónio no processamento de sinais visuais não são completamente compreendidos. O método de fixação de membranas é útil para abordar esta questão fundamental. Aqui, um protocolo para registrar as respostas sinápticas luz evocados em rato neurônios da retina usando gravações patch clamp em condições de adaptação ao escuro é fornecido. Os olhos de ratinhos são de adaptação ao escuro O / N, e os preparativos fatia da retina são dissecados em um quarto escuro com uma iluminação e visores infravermelhos. A luz infravermelha nãoativar fotorreceptores do mouse e, assim, preserva a sua capacidade de resposta luz. Patch clamp é usada para registrar as respostas leves evocadas em neurônios da retina. Um corante fluorescente é injetado durante as gravações para caracterizar os subtipos morfológicos neuronais. Este procedimento permite determinar as funções fisiológicas de cada neurónio na retina do rato.

Uma preparação fatia representativo é mostrado na Figura 1. A preparação fatia está numa posição direita, que mostra a fotorreceptores células ganglionares em uma superfície plana, sem descolamento do papel de filtro. Se uma fatia é inclinado, apenas uma parte da preparação está em foco, o que torna difícil identificar uma célula apropriado para correção de aperto. Para as gravações, é importante escolher um bom soma, que geralmente tem uma superfície brilhante, uma forma ainda rodada, e não há placas escuras visíveis. Após a configuração de célula inteira foi feito, a fatia foi exposta a luz de fundo e, em seguida, a um passo de luz (Figura 2). Potencial excitatório pós-sináptico de luz evocado (L-EPSPs) foram evocadas em resposta a uma luz-passo (temporização é mostrada em amarelo). A amplitude de pico e o tempo de decaimento pode variar dependendo do tipo de célula e subtipo. A célula ganglionar gerado potenciais de ação em resposta a estímulos luminosos (Figura 2 D &amp; E). O cell tipo e seu subtipo morfológico foram revelados por meio de rotulagem sulforrodamina após gravações fisiológicas (Figura 2, à direita). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52422/52422fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1. As preparações fatia da retina. (A) uma preparação fatia da retina visto com uma objetiva de 10X. Uma preparação de retina fatia (topo) foi ligado a um pedaço de papel de filtro (parte inferior). (B) Uma compilação de quatro imagem que mostra uma preparação fatia da retina visto com um objetivo 60X. Cada camada de células é claramente observado (ONL: camada exterior nuclear, OPL: camada plexiforme externa, INL: camada nuclear interna, IPL: camada plexiforme interna, GCL: camada de células ganglionares) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52422/52422fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2. Luz evocadas potenciais pós-sinápticos excitatórios (L-EPSPS) de neurônios da retina. Passo-light evocado L-EPSPs (à esquerda). A intensidade da luz foi de 30 - 60% de contraste Weber. Nível de adaptação de luz de fundo foi de 4 x 10 4 fótons / ^ M 2 / sec. Sulforodamina B foi injetado durante patch clamp gravação para visualizar os neurônios registrados (à direita). A pipeta de gravação ainda estava ligado à soma (A) L-EPSPs e coloração sulforrodamina a partir de uma célula cone bipolar ON. (B) OFF célula cone bipolar. (C) célula Amacrine. (D) ON células ganglionares. (E) OFF células ganglionares. A barra de escala indica 2 ou 5 mV como observado. Estimulação luminosa foi aplicado por 1 segundo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52422/52422fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui</a>para ver uma versão maior desta figura.

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Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K visualizações.  Wayne State University School of Medicine. We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Vídeo: Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurociência

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Biologia

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch-clamp gravação de células Starburst Amácrinas em um monte de Luxo Preparação de Deafferentated mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices

Source: Hellmer, C. B., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52422">Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the recording of light-evoked post-synaptic responses in a dark-adapted mouse retinal tissue slice preparation. The retinal slice is placed in a recording chamber, and a recording pipette is used to establish electrical continuity with a retinal ganglion cell. Light pulses are applied to generate excitatory post-synaptic potentials in the ganglion cells, which are recorded by the pipette.

Respostas pós-sinápticas evocadas por luz em neurônios de fatias de retina de camundongos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Experimental ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

Source: Richevaux, L., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/59534">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Fotoestimulação e gravações de grampo de remendo de células inteiras de neurônios em fatias de hipocampo de camundongos

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Solutions for acute slice ...

Electrophysiology Techniques

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: Kinnavane, L., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/63077">Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Estimulação optogenética e registro eletrofisiológico de eventos sinápticos em fatias de cérebro de rato

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Electrophysiology and ...