The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

NOTA: Todos os animais devem ser alojados e utilizados em conformidade com o cuidado com os animais e uso comissão (IACUC) na instituição. Todos os procedimentos aqui descritos são aprovados pela Case Western Reserve University IACUC. 1. Animais Transgénicos <ol><li> Use ratos repórter fluorescentes disponíveis comercialmente para rotular axônios (Thy-1 YFP H) 50 e microglia / monócitos (CX3CR1 GFP / GFP 51; veja a lista de materiais). Estes ratos devem ser entrecruzadas e mantida como colônias de reprodução individuais de acordo com as políticas de cuidados de animais institucionais. </li></ol> 2. Medula Óssea Quimeras <ol><li> Identificar os animais que são, pelo menos, 8 semanas de idade para utilização como animais receptores. </li><li> Coloque animais hospedeiros em uma irradiação segurando gaiola circular projetado para segurar o mouse em uma posição para assegurar mesmo, toda irradiação de corpo. </li><li> Definir o temporizador em um de césio (Cs-137) irradiador para administrar um dos radiação de corpo inteiroidade de 800-1.000 Rads para os animais de acordo com as instruções do fabricante (exemplos aqui apresentados são 980 Rads). </li><li> Animais e volta às suas gaiolas para descansar durante um mínimo de 4 h. </li><li> Escolha animais dadores com o genótipo apropriado (ver Figura 2A) como a fonte de células progenitoras da medula. NOTA: Os doadores adequados são animais que expressam diferentes repórteres fluorescentes de linhagem específica do host para identificar populações de células diferentes, ou um do mesmo genótipo como controles. </li><li> Encha uma placa de Petri com 70% de álcool, e um segundo prato com 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meios de comunicação e um coador de 40 um celular embebido na mídia. Encha um tubo cônico de 15 ml com meio RPMI. Mantenha os pratos e tubo em gelo. </li><li> Sacrifício dos animais dadores por asfixia com CO2 de acordo com as diretrizes institucionais. Limpe a pele e pêlo, mergulhando todo o animal com etanol a 70% até que toda a pele está molhada. </li><li> Remover o ska partir da metade inferior de subprodutos animais de corte em torno da secção média e puxar a pele para baixo sobre as patas traseiras para expor totalmente os músculos da perna. </li><li> Retire a tíbia pelo overextension anterior na articulação do joelho para deslocar o osso, em seguida, usando uma pinça e tesouras estéreis, descasque e corte músculos longe de ambas as extremidades da tíbia. Coloque o osso na placa de Petri com álcool por até 30 segundos, em seguida, transferir para o filtro de células no interior da placa de Petri contendo os meios de comunicação. </li><li> Deslocar a articulação do quadril e descascar as músculos ligados ao fêmur, colocou o brevemente fêmur em álcool e, em seguida, colocá-lo no mesmo filtro de células dentro do prato. </li><li> Num capuz de cultura de tecidos, estéreis utilize uma tesoura para cortar ambas as extremidades dos ossos e inserir uma agulha de calibre 21 numa seringa de 1 ml na extremidade do osso. Lave a medula no cônico de 15 ml com a mídia. Repita os procedimentos para os ossos restantes. </li><li> Usando a parte traseira do êmbolo de uma seringa de 3 ml, osso esmagamento termina na célulafiltro na caixa de Petri para extrair mais células. </li><li> Colocar o filtro no topo de um tubo de 50 ml e transferir meios com células aspiradas a partir do tubo de 15 ml. Utilizar a parte de trás do êmbolo para esmagar a medula, a fim de se obter uma suspensão de célula única. Lave as tubo de 15 ml, fragmentos de ossos e do filtro de células com 30 ml de mídia em um tubo de 50 ml. </li><li> Centrifuga-se as células durante 5 min a 500 xg para sedimentar as células. </li><li> Lisar os glóbulos vermelhos com 2 ml de cloreto de amónio-potássio-(ACK) de tampão de lise durante 2 min. Extingue-se o tampão de lise com 10 ml de meio contendo 10% de soro fetal bovino. Centrifugar a 500 xg durante 5-10 min para sedimentar. </li><li> Lave as células uma vez em 10 ml de meio RPMI e duas vezes em solução salina, centrifugação a 500 xg durante 5-10 min para sedimentar para cada lavagem. </li><li> Ressuspender as células até uma concentração final de 3 x 10 6 células em 200 ul de solução salina. </li><li> Transferência de 3 x 10 6 células da medula através de injecção na veia da cauda em irradiated ratinhos receptores. </li><li> Coloque água acidificada (pH 3,0) na gaiola destinatário e permitir que os ratos a se recuperar. NOTA: Os ratos que não o transplante vai morrer dentro de 10-14 dias após o procedimento. </li><li> Após 8 semanas, verificar a reconstituição de medula examinando as células imunes do sangue periférico, utilizando citometria de fluxo (Figura 2B-C). </li></ol> 3. Coluna Dorsal lesão por esmagamento NOTA: Escolha animais quimera adequadas ou animais transgénicos duplos para cirurgia com base na experiência desejada. Animais com células derivadas de medula óssea, quer residentes ou marcadas foram criados nas etapas anteriores. <ol><li> Preparar e autoclave instrumentos cirúrgicos, incluindo rongeurs, Dumont # 4 pinças, tesouras, pinças de íris para tecidos que prendem, motoristas de agulhas e grampos de sutura. </li><li> Prepare medicamentos a administrar aos ratos para controle da dor. Bupernex e Marcaine são comumente usados ​​para o controle da dor. Use medicamentos apropriados, como requer and aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC). </li><li> Induzir a anestesia com 4% de isoflurano e manter com 1-2% de isoflurano para alcançar uma taxa de respiração de 60-100 respirações por minuto. Aplique lubrificante ocular para os olhos do animal para evitar a secura sob anestesia e confirmar a ausência de resposta a pé pitada. Manter a temperatura usando uma almofada de aquecimento e monitorar a temperatura através de uma sonda retal. </li><li> Raspar o dorsal do rato, com uma máquina de barbear eléctrica sobre o nível da medula espinal alvo, e, em seguida, limpar a área três vezes com solução de povidona-iodo seguido por duas vezes com 70% de álcool. Colocar o animal em um campo estéril, e cobrir o animal com uma outra cortina estéril com um buraco cortado em um local apropriado para a visualização do local da cirurgia. Manter todas as ferramentas em campos estéreis durante toda a cirurgia. </li><li> Cortar a pele ao longo da linha média da coluna vertebral ao nível desejado com íris tesoura para expor o músculo no dorso do animal. </li><li> Sob uma Dissecting microscópio, cortar os músculos das costas, incluindo o trapézio e os ligamentos do grande dorsal ao longo da linha média, onde eles atribuem aos processos espinhosos dorsais, e expor a coluna vertebral. </li><li> Remover os músculos rotadores entre os processos dorsais e transversais da vértebra para revelar a lâmina da vértebra específico a ser removido (T11, neste caso). Identificar T11 através da inserção da última costela não flutuante para este processo. </li><li> Insira dicas de rongeurs no espaço acima e abaixo do processo a ser removido e levantar um pouco para se certificar de que eles estão bem encaixados em torno da lâmina vertebral, mas não é muito profundo para ferir a coluna vertebral. Fechar rongeurs em um movimento para remover a lâmina. </li><li> Ampliar a laminectomy conforme necessário usando os fórceps para remover pequenas partes da vértebra restante. </li><li> Medida 1 mm a partir das dicas de # 4 pinça segurando-os contra uma régua e marcação com um marcador permanente. Meça a 1 mm de aposta separaçãotre os dois dentes, segurando a pinça contra o governante e corrigir a largura máxima das dicas a 1 mm, deslizando um anel de borracha fórceps no lugar sobre o eixo do fórceps. </li><li> Criar um pequeno orifício através da inserção de uma agulha de calibre 30 através da dura-máter com os dois pontos de inserção para as garras da pinça para aceder a medula espinhal. </li><li> Inserir os dentes fórceps em um ângulo para a dura-máter através dos furos para a profundidade de um milímetro marcados sobre os lados da pinça 90 °, garantindo que a marca está acima da dura-máter. Comprima fechar a pinça e segure por 10 segundos. Release, e repetir forceps espremer mais duas vezes para um total de três detém. Remover fórceps da medula espinhal. </li><li> Molhe um pedaço de gelatina absorvível comprimido esponja em solução salina e coloque sobre o local da lesão. </li><li> Usando um ponto corrido, suturar o músculo no lugar sobre a laminectomia e embebido esponja de gelatina com # 4 suturas de nylon não absorvíveis sintéticos. </li><li> Clipe da pele no local usando cinco milímetros ferida clips. </li><li> Injecte 10 ul Marcaína (1,0 mg / kg) em 490 uL de soro fisiológico por via subcutânea ao redor do local da incisão e 5 ul Bupernex (0,1 mg / kg) por via intramuscular em músculos glúteos. </li><li> Permitir animal recuperar em uma almofada quente e monitorização de quaisquer dificuldades de movimento ou sinais de paralisia nos membros posteriores. Não deixe animais autônoma ou na presença de outros animais até que esteja totalmente recuperado da anestesia. Não use quaisquer animais que exibem déficits motores observáveis. NOTA: Embora esta lesão de esmagamento pode ser realizado em qualquer nível ao longo da medula espinal, praticamente, T10-L4 representar menos desafios técnicos para imagiologia com respeito a respiração e estabilizar o movimento do corpo utilizando grampos. Colocação da braçadeira deve ser modificado em torno da caixa torácica para a imagem em níveis torácicos. </li></ol> 4. Imagem intravital <ol><li> Preparar e autoclave instrumentos cirúrgicos, incluindo Dumont # 4 pinças, tesouras, pinças de íris para a realização de tecido, agulha drios e clips ferida. </li><li> Anestesiar o mouse como antes com isoflurano. Induzir a anestesia em 4-5% e manter em 1-2%, conforme necessário para manter uma taxa de respiração de 60-100 respirações por minuto e uma falta de resposta a pé pitada. Mantenha o mouse aquecida, monitorar taxa de respiração quando não de imagem e monitorar continuamente a temperatura do animal com uma sonda retal. </li><li> Limpar a pele em torno dos agrafos com Betadine e álcool e, em seguida, remover os grampos de sutura de acordo com as instruções do fabricante. Depois que os clipes para feridas são removidos, remover pêlos com Nair, se necessário, e limpar o local de novo com álcool povidona-iodo e 70%. </li><li> Re-abrir a pele com uma tesoura. Remova todas as suturas remanescentes de músculo e puxar muscular apart com uma pinça, o corte com uma tesoura, se necessário. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, criar bolsas para a medula espinhal braçadeiras cortando o músculo com tesoura ao lado dos processos transversais na vértebra um nível vertebral acima e abaixo da laminectomy. </li><li> Coloque grampos em torno de cada um destes vértebra e aperte. Ajuste conforme necessário para permitir espaço para microscópio objetivo de alcançar a medula espinhal. Certifique-se de que a medula é paralelo à plataforma de imagem, e manter a estabilidade do tecido para a imagem latente. Se artefato respiração é visto, reajuste grampos de acordo para minimizar movimento no campo de imagem. </li><li> Cubra os grampos com parafilm. </li><li> Retire a gelatina comprimido esponja absorvível da medula espinhal com uma pinça, delicadamente escolhendo fora de tantas peças quanto possível, também remover o máximo de tecido cicatricial sobre as meninges possível. Capa expostos medula espinhal com solução salina e esponja nova, se necessário. NOTA: Se o sangramento ocorre a partir do músculo circundante, seja firme com esponja ou cauterizar conforme necessário. No entanto, tome cuidado para não tocar a medula espinhal com o cautério. Cubra a medula espinhal ou com um pedaço de tecido umedecido ou gelatina comprimido esponja quando cauterização. </li><li> Criar um well para manter o fluido de imersão, selando primeiro a pele e tecido com Vetbond, e, em seguida, utilizando acrílico dental para construir um poço entre as duas braçadeiras do suporte da medula espinal e os lados do animal. Espere até que as curas de acrílico. </li><li> Encha o bem com fluido cerebrospinal artificial (ACSF) e verifique novamente para qualquer sangramento em torno do local da cirurgia. </li><li> Opcionalmente, neste ponto, injectar corantes fluorescentes vasos intravenosamente por injecção na veia da cauda para realçar os vasos sanguíneos durante o exame. NOTA: dextrano fluorescente acima de 70 kDa é frequentemente utilizado, apesar de pontos quânticos e lectinas marcados com fluorescência também servem como corantes vasos úteis. 50 ul de 150.000 WM TRITC-dextrano é tipicamente injectado por via intravenosa. </li><li> Para obter a motilidade das células imunes fisiologicamente relevante, a temperatura do rato deverá ser mantida a 37 ° C. Mova o rato para um ambiente com temperatura controlada sob o microscópio para a imagem latente e monitorar o animal para anes corretasnível tesia por taxa de respiração e pé pitada. Monitorar o animal com frequência durante o exame para determinar a profundidade da anestesia, com o objetivo de alcançar uma taxa respiratória de 60-100 respirações por minuto. </li><li> Localize o site de imagem através da ocular do microscópio. </li><li> Ajuste a 2 fótons microscópio de varredura a laser para tirar uma imagem de z-stack cada 30-60 segundos para obter dados de imagens dinâmicas. </li><li> Depois de sessão de imagem é concluída remover o animal da caixa aquecida. </li><li> Solte os grampos da coluna vertebral e remover o rato dos grampos. Puxar o acrílico bem longe da pele ao remover os grampos. </li><li> Se o mouse está a ser trabalhada de novo, colocar soro fisiológico embebido gelatina comprimido esponja sobre a medula espinhal. Fechar o músculo e pele sobre o local da cirurgia. Não deixe o animal sozinho ou na presença de outros animais enquanto se recupera da anestesia. Se o animal apresentar sinais de déficit neurológico após a recuperação, o animal deve ser sacrificado. Caso contrário, a eutanásiao mouse em uma câmara de CO 2 antes que emerge da anestesia acordo com o protocolo de eutanásia IACUC-aprovado. </li><li> Analisar imagens fluorescentes usando software de análise de imagem, seguindo as instruções do fabricante. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Interações de imagem de diferentes tipos de células em seus compartimentos de tecido nativas durante seguiu patologia em tempo real tem gerado grande interesse. Dentro da rede densa do SNC, o contacto célula-célula e sinalização com as células adjacentes são essenciais para a função normal e para compreender a patologia do SNC. Aqui, nós descrevemos o uso de microscopia de varrimento de laser 2-fotão para a observação do movimento celular dentro de uma lesão mecânica na medula espinal. Para além da qualidade da preparação de cirurgia e o tecido, a estabilidade mecânica do tecido é primordial para a microscopia de lapso de tempo bem sucedido, em particular o isolamento da medula espinal de respirar artefactos. A estabilidade pode ser avaliada por olhando para o movimento da medula espinal sob um microscópio de dissecação que corresponde à frequência cardíaca ou respiratória do animal. Estabilidade deve ser avaliada tanto durante a realização da cirurgia e também imediatamente antes do início da criação de imagens. Se o animal não é estável, os ajustes devem ser feitos para a colocação e aperto dos grampos na medula espinhal. Modelos fluorescentes específico repórter do rato do tipo celular, juntamente com abordagens quimera da medula óssea têm permitido a identificação de células monocï¿½icas contra microglia e axônios. Estudos anteriores revelaram que o sangue derivada de monócitos e microglia não são responsáveis ​​pela lesão axonal secundária após o trauma usando a metodologia descrita aqui 43. Dye navio conjugado Dextran permite a identificação da embarcação tanto para fornecer pontos de referência e identificar brechas na integridade dos vasos. A escolha do modelo de rato repórter fluorescente apropriado é crítico para permitir a identificação correcta dos tipos de células desejadas para ser trabalhada. O desenvolvimento de modelos de ratinho fluorescentes que são apropriados para os estudos empreendidos também é crítico para o sucesso das experiências. A distinção entre as duas populações fagocíticas de CX3CR1 + / GFP </sup&gt; Células no sistema nervoso central tem sido tradicionalmente difíceis. Como mostrado aqui, uma técnica imunológica comum, quimeras de irradiação, pode ser utilizado para distinguir rádio-resistentes, microglia residentes do SNC de macrófagos derivados da medula óssea. O procedimento de irradiação tem o potencial para danificar a barreira hemato-encefálica e alterar fenótipos celulares, portanto, o uso deste modelo deve ser considerada com cuidado. A extensão dessas alterações é diferente com dose de irradiação, bem como a duração do período de recuperação, e seu impacto sobre os diferentes modelos inflamatórios não foi completamente estudado. Os efeitos da irradiação sobre o SNC barreira hemato-encefálica pode ser minimizado pela blindagem da cabeça durante a irradiação, e isto foi demonstrado para diminuir a infiltração de células na medula espinal após a irradiação, mesmo se a medula espinal não está directamente blindado 52. Aqui observamos que o número de células que se infiltram no SNC, no estado estacionário como um resultado da geração de quimera é insignificante, em contraste com o dormenteer de células que entram na lesão. Outros modelos alternativos a serem considerados incluem quimeras induzidas por drogas 52 ou modelos parabiótico rato 53. Aqui, apresentamos um modelo de lesão pequena específica, simples e reprodutível, que resulta em uma lesão na substância branca dorsal da medula espinhal que é fácil de imagem usando a microscopia de dois fótons. Este método também proporciona uma lesão quantificável para testar o grau de morte das axonal nas colunas dorsais que, na literatura tem sido acoplados com complementar tecido fixado análise 16,18,43,48,54. Neste modelo, os animais exibir apenas déficits mínimos e não necessitam de cuidados especiais após a lesão. Estudos futuros utilizando as técnicas de lesão coluna esmagamento e de imagem dorsais aqui descritas podem ser poderosas ferramentas de triagem para avaliar a eficácia do tratamento para lesão da medula espinhal. Estes tratamentos podem incluir inibidores de moléculas pequenas, fármacos, produtos celulares, enxertos de tecidos e de tratamento combinatórias. A interacção entre macrófagos, microglia e neurónios são também susceptíveis de desempenhar um papel em outros modelos de doenças na espinal medula, incluindo a esclerose múltipla, tumores, meningite e a esclerose lateral amiotrófica, e esta técnica pode ser útil para o estudo destas doenças, bem .

A reação inflamatória a doença ou lesão no sistema nervoso central (SNC) é mal compreendido, especialmente no que diz respeito às interações entre células do sistema imunológico e residentes no interior do tecido. Investigações destas interacções celulares na medula espinal são de particular interesse no animal vivo. O CNS trato de matéria branca só é facilmente acessível nas colunas dorsais da medula espinhal, tornando esta uma área importante em que se concentrar esforços na melhoria da abordagem experimental viável. Estas investigações foram limitadas devido à dificuldade técnica no acesso e na estabilização do CNS para a imagem latente. Imagens ao vivo na medula espinhal tem sido descrita anteriormente movimento celular 1-13, no entanto, poucos estudos têm abordado em uma lesão da medula espinhal além de algumas horas após a agressão inicial. A lesão traumática da medula espinal é um ambiente complexo, com neurónios, astrócitos, fibroblastos, células progenitoras NG2, e células imunitárias including microglia, neutrófilos, macrófagos, células T, células B e células dendríticas 14,15. Os macrófagos são o subconjunto de células imunitárias responsáveis ​​pela fagocitose na lesão, que se infiltram da circulação. O papel destas células fagocíticas foi debatido, com relatórios que indicam que estas células podem assumir dois papéis prejudiciais e de protecção no tecido lesionado. Essas funções vão desde o aumento perecimento axonal secundária após uma lesão e atuando de forma phagocytic 16-22, para assumir uma ferida fenótipo de cura e diminuir déficits funcionais no animal ferido 21,23,24. Anteriormente, as tentativas de distinguir os macrófagos de microglia têm contado principalmente na morfologia do tecido saudável. No entanto, a microglia e macrófagos activados expressam muitos dos mesmos marcadores e exibem morfologia indistinguíveis após lesão 25-29, tornando a separação das diferentes actividades destas células difíceis de estudar based sobre estes fatores sozinhos 30. Estas células podem ser separadas por expressão diferencial de CD45 usando citometria de fluxo 33,34, embora esta abordagem é menos útil para discriminar estes tipos de células in vivo. Utilizando a expressão diferencial de CCR2 e CX3CR1 em microglia e macrófagos também foi explorada, embora as alterações dinâmicas na expressão destes marcadores como os monócitos diferenciam-se em macrófagos pode complicar a análise exacta 35,36. A microglia são as células do sistema imunológico residentes do SNC e surgem a partir de progenitores de saco vitelino fetal durante o desenvolvimento, enquanto que os macrófagos são derivados a partir de progenitores de medula óssea e entrar no sistema nervoso central lesionado após um insulto 31,32. Uma abordagem alternativa ao uso de morfologia de distinguir esses dois tipos de células é a substituição da medula óssea, com células progenitoras a partir de um animal doador expressando um marcador rastreáveis ​​nos macrófagos derivados dos progenitores doadores, preservando ao mesmo tempo a residentes do SNC, recipderivados de tário microglia. Estes modelos quiméricos de medula óssea são habitualmente utilizados em muitas outras aplicações 37-40. Este método tem ressalvas únicos associados com danos para a integridade da barreira sangue-cérebro provocada por irradiação ou fármacos citotóxicos utilizados para a erradicação progenitores de medula no hospedeiro, limitando a sua utilização em certas aplicações. Recentemente, distinções funcionais entre microglia e macrófagos no sistema nervoso central estão começando a ser discernida por meio de citometria de fluxo, análise de matriz gene chip e métodos quimerismo 24,26,41-44, que poderá ser muito útil no futuro. Apesar de separar esses dois tipos de células continua a ser difícil, entendendo suas funções originais é importante em conduzir a tratamentos mais direcionados de distúrbios que envolvem tanto microglia e macrófagos no SNC. Descrição das interações celulares no interior da lesão da medula espinhal veio principalmente de estudos envolvendo modelos de cultura celular. Este é due para os desafios envolvidos em imagiologia tanto a lesão da medula espinal e células imunes em conjunto em um animal vivo. Modelos de roedores atuais de lesão da medula espinhal de distinta natureza e gravidade incluem modelos de contusão 45,46, lesões picar pinos 2, laceração 47, e dorsal lesão coluna crush descrito aqui 16,18,48. A inflamação nas meninges aumenta com a gravidade da lesão e apresenta desafios únicos para a implantação de janelas ou cirurgias para imagens em série. Alguns desses desafios são a infiltração de células fagocíticas, bem como a geração de tecido fibroso sobre o local cirúrgico. Alguns desses problemas podem ser superados através da criação de lesões menores e cobrindo a medula espinal exposta com penso cirúrgico não imunogénica entre a dura-máter e os músculos paraspinous para permitir a subsequente reabertura cirurgia, tal como é feito aqui para estudar a coluna dorsal lesão por esmagamento . A capacidade de imagem apenas a parte dorsal do spincabo al limita também a escolha de lesão, uma vez que os modelos de contusão, inicialmente, causam danos no fio central, muitas vezes, a parte mais poupando dorsal das colunas dorsais, especialmente nos pontos de tempo iniciais após o ferimento 45,49. Portanto, descreve-se um modelo de lesão simples que produz uma lesão em forma limpa repetível,, retangular que é útil tanto para a observação de movimentação das células no interior da lesão e para facilitar a quantificação da posição axonal em relação à lesão.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="594">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:125px;">Name</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:240px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">CX3CR1 GFP mice</td>
			<td style="width:165px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:64px;">5582</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">Thy-1 YFP H mice</td>
			<td style="width:165px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:64px;">3782</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">Mouse pie cage</td>
			<td style="width:165px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:64px;">MPC 2 set</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">60mm2 petri dish</td>
			<td style="width:165px;">Corning</td>
			<td style="width:64px;">430166</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">Falcon 40 um cell filter</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">08-771-1</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:125px;">1x15mL and 1x50mL conical tube</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">16 gauge needle</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">305177</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">1ml syringe</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">309628</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:165px;">Gibco</td>
			<td style="width:64px;">A10492-01</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">HBSS</td>
			<td style="width:165px;">Gibco</td>
			<td style="width:64px;">1E+07</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:125px;">RPMI media</td>
			<td rowspan="2" style="width:165px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">R8758</td>
			<td rowspan="2" style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">F4/80 antibody</td>
			<td style="width:165px;">Ebioscience</td>
			<td style="width:64px;">12-4801 PE</td>
			<td style="width:240px;">For FACS verification of chimeras</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">30-gauge insulin syringe&#160;</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">328280</td>
			<td style="width:240px;">For tail vein injection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Spinal Cord Clamps</td>
			<td style="width:165px;">Narshinge</td>
			<td style="width:64px;">STS-A</td>
			<td style="width:240px;">For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Ortho-Jet Dental Acrylic powder&#160;</td>
			<td style="width:165px;">Lang Dental</td>
			<td style="width:64px;">REF1320</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td>
			<td style="width:165px;">Lang Dental</td>
			<td style="width:64px;">REF1404</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Gelfoam gelatin sponges</td>
			<td style="width:165px;">Pfizer</td>
			<td style="width:64px;">9E+06</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">4-0 Ethilon sutures</td>
			<td style="width:165px;">Ethilon</td>
			<td style="width:64px;">1667G</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Reflex Clips, 7mm</td>
			<td style="width:165px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:64px;">INS750344</td>
			<td style="width:240px;">For surgery. Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">14061-09</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">45/5 Forceps, Dumoxel</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">11251-35</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Rongeurs</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">16021-14</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">305106</td>
			<td style="width:240px;">For making access holes in dura</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Forceps Dumont #4 Biology tips</td>
			<td style="width:165px;">Dumont</td>
			<td style="width:64px;">11242-40</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Needle Drivers</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">12002-12</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Michel Wound Clip Forceps</td>
			<td style="width:165px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:64px;">INS700753</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Wound clip remover</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">12033-00</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">O-rings for Forceps</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">11200-00</td>
			<td style="width:240px;">For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Cordless Rechargable Animal trimmer</td>
			<td style="width:165px;">Wahl</td>
			<td style="width:64px;">Series 8900</td>
			<td style="width:240px;">for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Vetbond</td>
			<td style="width:165px;">3M</td>
			<td style="width:64px;">1469SB</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td>
			<td style="width:165px;">Purdue Products L.P.</td>
			<td style="width:64px;">NDC 67618-150-08</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Nair Hair remover lotion</td>
			<td style="width:165px;">Church &#38; Dwight Co., Inc.</td>
			<td style="width:64px;">NRSL-22329-05</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:165px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:64px;">NDC 11695-6776-2</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Marcaine</td>
			<td style="width:165px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:64px;">6E+06</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Bupernex</td>
			<td style="width:165px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:64px;">121-7793</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="345" rowspan="6" style="height:345px;width:125px;">aCSF</td>
			<td rowspan="6" style="width:165px;">Chemicals from Sigma</td>
			<td style="width:64px;">119 mm NaCl</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:64px;">26.2 mM NaHCO3</td>
			<td style="width:240px;">From Cold Spring Harbor Protocols</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:64px;">2.5 mM KCl</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:64px;">1 mM NaH2PO4</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:64px;">1.3 mM MgCl2</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:64px;">10 mM glucose&#160;</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">TRITC-dextran 150,000 MW</td>
			<td style="width:165px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">T1287</td>
			<td style="width:240px;">For intravenous administration to label vasculature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Um diagrama esquemático que representa a coluna dorsal lesão de esmagamento é mostrado na Figura 1A. Após a lesão, o animal é preparado e estabilizado para microscopia intravital usando grampos espinhal (Figura 1B). Uma imagem tomada imediatamente após a lesão de coluna dorsal crush mostra uma lesão rectangular claramente visível com pontos de inserção pinça de dentes que são claramente identificáveis. Os axónios no local da lesão são cortadas em toda a extensão de toda a coluna dorsal (Figura 1C). A integridade dos vasos sanguíneos permanece intacta, e nenhuma evidência de infiltração de corante vaso foi detectado por fluorescência. Para realizar imagem de série da mesma lesão ao longo de semanas, os músculos e pele pode ser suturado sobre o laminectomy para posterior re-exposição. Lesão morfologia semelhante é vista em momentos posteriores (Figuras 1D, E). 5 dias após a lesão, os locais de inserção fórceps ainda são visíveis, mas a lesão começou a aumentar de tamanho due a lesão secundária causada por inflamação. Os axónios na extremidade caudal da lesão ter recolhido a partir do local inicial da lesão através de um processo chamado de &quot;colapso axonal&quot;. Os axónios na extremidade rostral da lesão exibiu degeneração Wallerina semelhante (Figura 1D, E). Entre os dias 5 e 22 após a lesão, o tamanho da lesão foi estabilizado. Ao mesmo tempo, um grande influxo de células CX3CR1 + pode ser visto infiltrante e em torno da lesão de esmagamento durante estes intervalos de tempo, embora a identidade destas células microgliais (contra macrófagos) não podem distinguir-se na preparação, como mostrado na Figura 1. A fim de distinguir o comportamento da microglia e macrófagos, no microambiente lesão por esmagamento, um modelo de quimera de radiação foi utilizado (descrito na Figura 2A). Em primeiro lugar, as células progenitoras da medula óssea de um CX3CR1 + / GFP rato são substituídos com cel dador não fluorescentels, portanto, só GFP + microglia CNS residente são visíveis por imagens fluorescentes. A eficiência de reconstituição de medula pode ser confirmada por análise de citometria de fluxo de sangue periférico a 8 semanas após o transplante de medula (Figura 2B, C). Na Figura 2B, F4 / 80 e GFP macrófagos positivos, destacada em azul, são detectados em um CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 do mouse quimérico, em que alguns monócitos positivos negativos, mas F4 / 80 GFP também estão presentes. Na Figura 2C, não F4 positivo duplo / 80 e as células GFP positivas são deixados após a substituição de CX3CR1 + / GFP medula óssea destinatário com tipo selvagem de medula óssea. Antes da lesão, a microglia estão uniformemente distribuídos no interior da medula espinal, exibindo um descanso, morfologia ramificado (Figura 2D). 8 dias após a lesão, apenas alguns microglia pode ser detectado e em torno da lesão. Estes microglia exibir uma morfologia amebóide (Figura 2E). Em segundo lugar, ossoAs células progenitoras da medula em um rato não-fluorescente são substituídas por células da medula de um CX3CR1 + / GFP rato, tornando assim derivadas da medula óssea CX3CR1 + monócitos / macrófagos visíveis por fluorescência de GFP (Figura 2A). Antes da lesão, a única GFP + células detectadas são largamente perivascular, que têm sido referidos como sendo derivadas da medula óssea e sempre revirando numa base regular de 28 (Figura 2F). Depois de uma lesão por esmagamento, CX3CR1 células + / GFP pode ser visto ao longo do interior dos vasos sanguíneos ao redor da lesão (Figura 2H-J), e do centro da lesão é preenchido com infiltração de macrófagos CX3CR1 + / GFP (Figura 2G). Lapso de tempo de imagem das colunas dorsais pode ser realizada durante até 6 h. Na Figura 3, que mostra um CX3CR1 não quimérico + / GFP rato imediatamente após a lesão, em que as células a partir da circulação pode ser vern se deslocam para fora do vaso sanguíneo para o núcleo e se desloca no interior da lesão no local da lesão (Figura 3A, B; Suplementar Filme 1). A análise das imagens utilizando intensidade de fluorescência para identificar as células podem rastrear o caminho percorrido pelos macrófagos (Figura 3A, B; Suplementar Filme 1). Estatísticas derivadas da análise de imagem mostram a motilidade média de macrófagos na lesão é de 3,6 mm / min (Figura 3D). Finalmente, aos 22 dias após a lesão, os axônios, microglia e macrófagos pode ainda ser detectada no interior da lesão demonstrando a área de imagem é estável durante longos períodos de tempo (Filme Suplementar 2). <img alt="Figura 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: Criação e imagem sequencial da lesão de coluna dorsal esmagamento. (A) O dorsallesões coluna esmagamento é realizado através da remoção do processo dorsal da vértebra ao nível de interesse. Fórceps são inseridos na coluna dorsal da própria medula 1 mm entre si e são, em seguida, fechado 3 vezes para produzir a lesão mostrados no roxo. (B) O animal é então posicionada com medula espinhal grampos para obter a estabilidade de imagens intravital. (C) Imediatamente após a lesão, os sites fórceps de inserção (oval vermelho) eo rectangular volume de lesão por esmagamento (caixa cinza) podem ser claramente identificados. Axónios nas raízes dorsais podem ser vistos (setas brancas), assim como as extremidades dos axónios lesionados no lado caudal da lesão (cabeças de seta a cheio). (D) 5 dias após a lesão, os fórceps locais de inserção (oval vermelho ), e da extensão da lesão (caixa cinza) ainda pode ser facilmente visualizado. A lesão aumentou em tamanho desde o insulto inicial. Os axônios submetidos a degeneração Walleriana-como pode ser visto rostral à lesão (cabeças de seta aberta) em additipara axônios nas raízes dorsais (setas brancas) e as extremidades dos axônios lesionados (setas brancas). (E) 22 dias após a lesão, local da lesão ainda é identificável com dimensões semelhantes à lesão após 5 dias. Observa-se grande número de células CX3CR1 + e em torno do local lesionado. Características marcadas são os mesmos que em (D). Todas as barras de escala = 200 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: Construção de ratos quiméricos para rastrear CX3CR1 + / GFP expressando macrófagos derivadas da medula óssea ou microglia CNS residentes na lesão de coluna dorsal esmagamento. (A) Um diagrama esquemático de geração de ratos quiméricos com qualquer CX3CR1 + / GFP expressando kmcroglia ou macrófagos. Primeiro, os ratinhos Thy-1 H YFP são irradiadas e a medula óssea é reconstituído com células da medula isolado a partir de uma CX3CR1 + / GFP ratinho, resultando em um rato quimérico cujo macrófagos são GFP +. Em segundo lugar, Thy-1 YFP ratinhos H / CX3CR1 + / GFP são irradiadas e a medula óssea é reconstituído com células da medula isolado a partir de um rato não-fluorescente, produzindo um ratinho quimérico cujo microglia são GFP +. (B) Exemplo de citometria de fluxo de dados com células F4 / 80 + e CX3CR1 para GFP + no sangue de um animal quimérico com um doador de medula óssea + / GFP CX3CR1 transplantadas para um irradiadas C57BL / 6 destinatário. Células derivadas de doadores positivos CX3CR1 que são positivas tanto para GFP e F4 / 80 são mostrados no azul a zona iluminada. (C) Exemplo de citometria de fluxo de dados com 80 células / + F4 e CX3CR1 GFP + em um animal quimérico com uma C57BL6 doador de medula transplantada para um irirradiada CX3CR1 + / GFP destinatário. Note-se a inexistência de dupla positivo CX3CR1 + / GFP e F4 / 80 células dentro da área azul em destaque. (D) Um de dois fótons snapshot microscópica intravital de um rato a partir do primeiro esquema quimérico, mostrando GFP + microglia com morfologia ramificadas dentro do dorsal coluna (cabeça de seta). Estas células são intercaladas entre axónios (amarelo) em raiz dorsal e a coluna dorsal. Barra de escala = 100 mm. (E) imaging Intravital do mesmo mouse em (B) 8 dias após a lesão de coluna dorsal revela alguns CX3CR1 + microglia com corpos celulares grandes e amebóides forma que faltam processos (cabeça de seta). Barra de escala = 100 mm. (F) Snapshot de um rato a partir do segundo esquema quimérico em (A), mostrando pouca GFP + macrófagos, dentro do parênquima CNS. Barra de escala = 100 pm. (L), imagiologia intravital do mesmo rato em (F) 8 dias após a lesão da coluna dorsal revela alarge influxo de macrófagos e em torno da lesão. Barra de escala = 100 mm. (H) A imagem de maior ampliação de CX3CR1 células derivadas + sangue em contato com os vasos em que o animal ileso. Escala da barra = 30 m. (I) A reconstrução de células CX3CR1 em contacto com o recipiente, visto de dentro do vaso. Escala da barra = 30 m. (J) Uma reconstrução de células CX3CR1 em contacto com o vaso, visto do exterior do recipiente. Barra de escala = 20 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 3 :. Dados de rastreamento de células representativos numa CX3CR1 não quimérico + / GFP do mouse imediatamente após a coluna dorsal crushlesão. (A) Um instantâneo de CX3CR1 + microglia e macrófagos ao redor dos axônios danificados (amarelo) de Filme Complementar 1, imediatamente após uma lesão na coluna dorsal crush. (B) Os caminhos (cinza), tomada pelas células CX3CR1 + no (A) durante uma 110 min sessão de imagens intravital. (C) A representação codificada tempo das faixas em (B). As faixas são coloridos com base no seu tempo dentro de todo o filme 110 minutos, como mostrado na barra de tempo. (D) Histograma da motilidade global das células CX3CR1 +. Todas as barras de escala são 30 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Filme Complementar 1: filme intravital Representante imediatamente após a lesão de coluna dorsal crush no duplo heterozigoto Thy-1 YFP / + <strong&gt; / CX3CR1 GFP / + mouse. imaging espinhal Intravital foi realizada imediatamente após a coluna dorsal lesão por esmagamento, a nível T11. Painel da direita mostra o movimento de CX3CR1 + microglia e macrófagos. Os caminhos do movimento de células são mostrados como faixas brancas no painel da esquerda. A lesão está localizado no canto superior esquerdo. Células CX3CR1 + pode ser visto em movimento no local da lesão ao longo destas faixas. Axônios são mostrados a amarelo. Escala da barra = 40 m. Tempo total: 110 min. A velocidade de reprodução: 300x. Filme Suplementar. 2: filme intravital Representante aos 22 dias após a lesão de coluna dorsal crush no duplo heterozigoto Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + rato aparece aqui é um filme representativo tomada em um mouse de 22 dias após a primeira queda coluna dorsal lesão ao nível da coluna vertebral T11. A injUry está localizado no canto superior direito do quadro. Os axônios (amarelo) ascendente rostralmente são mostrados na parte inferior direita. Os vasos sanguíneos da veia dorsal e são marcados com TRITC-dextrano (vermelho). Células CX3CR1 + dentro do movimento lesão em uma velocidade mais lenta em comparação com aqueles imediatamente após a lesão. Barra de escala = 50 mm. Tempo total: 90 min. A velocidade de reprodução: 600x.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury at JoVE.com

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Imagem Intravital de axonais Interações com Microglia e macrófagos em um mouse Dorsal Coluna lesão por esmagamento

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K visualizações.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

Vídeo: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Neurociência

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.

Imagem latente avançada da difusão no Hippocampus dos ratos com ferimento de cérebro traumático suave

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...