The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), &#8220;Neurogel-en-Marche&#8221; Foundation (France), Fondazione &#8220;La Colonna&#8221;.

Nota: Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Revisão da Universidade de Milão e se encontrou com as Diretrizes italianos para Animais de Laboratório em conformidade com a Directiva Europeia Comunidades datado de Novembro de 1986 (86/609 / CEE). 1. Preparação de células para transplantes NOTA: Use as células-tronco neurais entre os dias 5 e 9 passagem em cultura para estas experiências; testar as culturas para a proliferação e diferenciação capacidade antes de serem rotulados para transplante. Determinar a extensão de diferenciação de 12 por imunocitoquímica. <ol><li> Ressuspender as células a uma concentração de 1 x 10 6 células / 150 uL (transplante 1 x 10 6 culas por ratinho). Preparar pelo menos 1,2 x 10 6 culas por rato por causa de um excesso de células é necessária para fins de carregamento seringa. </li><li> Lave as células 3 vezes com o meio de células-tronco neurais 13 em um frasco de 10 ml cônico. Em cadapasso de lavagem, as células precipitadas por centrifugação (500 xg durante 5 min, RT). </li><li> Contar as células antes da rodada final. </li><li> Centrifuga-se as células (500 xg durante 5 min), e, em seguida, aspirar o sobrenadante, tendo o cuidado para não remover todas as células, mas não deixando mais do que 25 ul de sobrenadante. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células de 2 x por adição de 1 ml de diluente de C para a pelete de células e ressuspender com pipetagem suave. </li><li> Imediatamente antes da coloração, preparar uma solução 2x da tintura (4 x 10-6 M) em Diluente C por adição de 4 ul de solução de corante etanol PKH26 para 1 ml de diluente de C em um tubo e misturar para dispersar bem. </li><li> Rapidamente adicionar os 1 ml de suspensão de células para 2 x 1 ml de 2x solução de corante e misturar imediatamente a amostra, pipetando (densidade celular final será 1,2 x 10 7 células / ml e 2 x 10-6 M PKH26). </li><li> Incubar a suspensão de células / corante durante 1-5 minutos. </li><li> Pare a coloração por adição de um volume igual (2ml) de solução de BSA a 1% em HBSS e incubar durante 1 min. </li><li> Células de centrifugação (500 xg por 10 min) e cuidadosamente remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de HBSS e centrifugação (500 xg durante 5 min). </li><li> Lava-se a pelete de células mais duas vezes com 10 ml de meio completo para assegurar a remoção de corante não ligado. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio completo para a avaliação da recuperação das células, viabilidade celular e a intensidade de fluorescência. Se forem necessárias para o transplante de células, lavar e ressuspender-los numa solução fisiológica estéril a uma concentração de 3,3 x 10 5 células / 50 ul. </li></ol> 2. Preparação para Cirurgia <ol><li> Equipamentos de cirurgia limpar e esterilizar. </li><li> Prepare a área de cirurgia, limpando com um agente asséptico. Configure o dispositivo IH do pêndulo. </li><li> Prepare o aparelho de anestesia: o Scavenger gás ativo com Filtro VetScav Pesando dispositivo, fluxo contínuo de indução Câmara, Gene Oxygenrator, Low Flow O 2 Medidor por Mice. Limpe a câmara de indução e a máscara usada durante a cirurgia. </li><li> Anestesiar os animais com 2,5% (v / v) de isoflurano em oxigénio (1 L / min), e esperar 5 min após a indução de fluxo para o medicamento tenha efeito. Verifique se os bigodes estão se contraindo ou se houver a retirada do membro posterior lento em resposta a beliscar a pata. Durante a cirurgia, reduzir a concentração de isoflurano a 2,0% (v / v) de isoflurano em oxigénio (1 L / min). </li></ol> 3. Preparação de Ratos de Cirurgia e Transplante <ol><li> Mantenha o CD1 camundongos adultos do sexo masculino (25-30 g) por pelo menos 3 dias antes dos experimentos em condições normais (22 ± 2 ° C, 65% de umidade e luz artificial entre 08h00 - 20:00). NOTA: Todo o processo de preparo cirúrgico para sutura levará cerca de 40 min. <ol><li> Para identificar o animal, marcar a cauda por meio de tinta colorida resistente à água. </li></ol></li><li> Use um electric clipper para cortar o cabelo dorsal do rato a partir do pescoço, sobre a nível T2, a região lombar. </li><li> Esterilizar a área preparada com uma solução de iodeto e de etanol (70% em água estéril). </li><li> Tratar o animal com uma sub cutânea (sc) de injecção de 200 uL de gentamicina (1 mg / ml em solução salina estéril). </li><li> Aplicar lubrificante oftalmológico em ambos os olhos dos animais para prevenir a dessecação e injectar buprenorfina (por via subcutânea, 0,03 mg / kg) para aliviar a dor. </li></ol> 4. Laminectomy <ol><li> Posicione o mouse sobre um aquecedor de slides para evitar o problema de hipotermia durante a cirurgia. Posicione o animal com o dorsal para cima. </li><li> Adicione uma incisão vertical com um bisturi ao longo da região de interesse, a partir de T7 a T12. </li><li> Mantenha a pele ea almofada de gordura superficial usando fórceps convencionais (normalmente encontrada no espaço entre a 5 e 6 de processos torácica dorsal). </li><li> Contar o processo sob o vaso como T6em seguida, passar a T7. </li><li> Coloque um pouco rolamento sob o lado ventral do ratinho para aumentar a curvatura da coluna vertebral. Imobilizar a medula espinhal, bloqueando-o com a pinça Graefe. </li><li> Corte os músculos paravertebrais bilateral de T7 e T10 nível vertebral usando o bisturi até que a superfície dorsal dos contactos a ponta da lâmina de bisturi. </li><li> Use o bisturi para assinalar fora da junção de T7 até T10. Pare no espaço entre T8 e T9 saliências espinhosas. Cortar os tecidos entre T8-T9 e T9-T10 com as micro tesoura. <ol><li> Use a Rongeur para remover o processo T9. Exponha a junção com cuidado raspar a camada muscular com os micro tesoura. Continue até que o osso é exposto. </li></ol></li><li> Utilizar as pinças para remover músculos da lâmina e abrir um pequeno espaço entre as vértebras. Insira com cuidado as micro tesoura sob o osso, corte a lâmina em ambos os lados e remover esta parte com uma pinça. </li><li> Retire a lâmina com a forceps para expor o cabo. Cuidado para não deixar quaisquer fragmentos de ossos gratuitos ou irregulares para trás; removê-los com o Rongeur. </li><li> Use as pequenas pinças ponta para remover o periósteo bem como quaisquer fragmentos de ossos ou músculos que pode estar próximo da incisão. </li><li> Remova a metade superior do processo dorsal T9 e prosseguir com o protocolo dispositivo IH do pêndulo. </li></ol> 5. IH Impactor Dispositivo Protocol (contusão) <ol><li> Colocar o rato no meio da plataforma do dispositivo de estabilização IH Impactor. </li><li> Bloqueie o animal com as duas pinças de dentes relacionados com a plataforma de estabilização por dois braços de posicionamento articular (braço esquerdo para a vértebra torácica, o braço direito para vértebra cervical). </li><li> Use o braço rostral para segurar a borda lateral do corpo vertebral rostral (T8). </li><li> Manipular o braço caudal da mesma maneira de entender o corpo vertebral T10. </li><li> Coloque a plataforma de estabilização no dispositivo e diminuir a ponta (diâmetro 0,75mm) mais próximo possível do cabo quanto possível, sem tocá-lo. </li><li> Levante a ponta três voltas completas antes de iniciar o impacto. </li><li> Realize a contusão com o pêndulo definido para entregar uma força de 60 kdyn a 100 mm / s. </li></ol> 6. suturas e pós-atendimento <ol><li> Suturar a incisão com um 4/0 absorvível fio de sutura. Cobrir a medula espinal exposta no local da lâmina removida; suturar o tecido nas extremidades do corte por meio de uma pequena agulha. Colocar os dois pontos imediatamente acima e abaixo do local de exposição da medula espinal. </li><li> Feche a pele usando dois ou três clipes Reflex sem beliscar fora os músculos subjacentes. </li><li> Hidrate o mouse pós-cirurgia com 2 ml de solução salina subcutânea na região lombar. </li><li> Posicione o mouse de volta em uma gaiola pré-aquecido para evitar hipotermia durante a recuperação cirúrgica. Coloque as gaiolas em almofadas de aquecimento. </li><li> Monitorar os ratos durante a fase aguda pós-lesão, verificando atamanho da bexiga, o fio de sutura e o peso do animal, duas vezes por dia. Aperte delicadamente bexiga (duas vezes por dia durante 7 dias) para evitar infecções (urina poderia ser nublado, com sangue ou que contenham quaisquer precipitados) do trato urinário. </li><li> Tratar os ratos uma vez por dia com uma injecção de solução salina (2 mL durante dois dias pós-cirurgia de injecção sc) e antibiótico gentamicina (0,2 mL; injecção sc) durante cinco dias após a lesão. </li><li> Tratar os ratos para analgesia pós-operatória com buprenorfina (0,1 mg / kg, duas vezes por dia) durante 3 dias após a lesão. </li></ol> 7. Cauda Vein injeção de células NOTA: Para o passo seguinte do processo para injectar as células na veia da cauda é demonstrada. As células podem ser também administrada com um transplante de intraspinal usando um quadro estereotáxico 15-16, ou na cisterna magna 17. É importante considerar que outros tipos de células podem ser transplantadas com este método, tais como as células estromais mesenquimatosas(por exemplo, da medula óssea, células-tronco mesenquimais derivadas de células-tronco adiposas, células do líquido amniótico). Além disso, outras opções de tratamento, tais como as nanopartículas podem ser injectados através da veia da cauda após a lesão da medula espinal. <ol><li> Use etanol a 70% e PBS para limpar a agulha antes da utilização. Lidar com a agulha e seringa apenas com luvas estéreis. </li><li> Ressuspender as células em tubos de ensaio e de carga de 75 ul de células dentro de uma seringa de 0,3 ml (29 L agulha e seringa 0,33 cc). </li><li> Certifique-se de que não há bolhas de ar no interior da suspensão celular. Manter a seringa na posição horizontal para evitar a sedimentação de células. </li><li> Posicione o mouse sob a lâmpada de calor para dilatar as veias da cauda. </li><li> Pegue o mouse e puxe-o na restrainer mouse para visualizar a veia lateral da cauda como uma linha azul estreita. </li><li> Limpe a cauda com um algodão embebido em álcool. Uma vez que a veia é visualizado, pegue na veia da cauda entre o polegar eo dedo médio da mão esquerda. </li><li> Traga a agulha para a superfície em um ângulo de 15 ° a partir do horizonte e certifique-se o bisel é para cima. </li><li> Injectar 50 jil de células, a uma taxa de 0,33 l / seg. Após a injecção, atrasar a retracção da agulha por 10 seg. Retirar a agulha devagar e preste atenção para a possível efluxo de suspensão de células. </li><li> Limpe a seringa como no passo 7.1 entre as cargas. </li></ol> 8. Testes comportamentais e Função Hind Limb <ol><li> Posicione o mouse no campo aberto. </li><li> Avaliar a função locomotora e recuperação dos membros posteriores após contusão com o teste de campo aberto de acordo com a escala do mouse Basso (BMS) 18. NOTA: A função neurológica deve ser avaliada periodicamente, a partir do dia 3 após a lesão durante 4 semanas 18. </li></ol> 9. Perfusão <ol><li> No final do período experimental, anestesiar os animais com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital sódico (65 mg / kg). Use pitadas toe para Avaliado come o nível de anestesia e prosseguir apenas depois do mouse não está respondendo aos estímulos nocivos. </li><li> Contenha o animal em decúbito dorsal em um avião cirurgia. </li><li> Corte através do tegumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica. Separa-se a membrana a partir do fígado. </li><li> Use a tesoura para cortar o diafragma para expor a cavidade pleural. </li><li> Cortar os lados da caixa torácica até que os ossos da clavícula. </li><li> Use os hemostats para prender a cartilagem xifóide e colocar a pinça hemostática sobre a cabeça. </li><li> Segure o terço inferior do coração em um plano transversal com a pinça. Insira a agulha para o ventrículo esquerdo. </li><li> Utilize uma pinça hemostática para prender o coração. Isto assegura que a agulha e impede a fuga. </li><li> Use a tesoura para cortar o átrio direito. </li><li> Permitir que o PBS para bombear (18 ml / min) através do animal. Manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão (3-4 min; correspondente a cerca de 70 ml de PBS). Continue até que o coração é limpo.</li><li> Alternar a torneira para permitir que o fixador (4% de paraformaldeído em água destilada, PFA a 4%) através da bomba. Permitir que o PFA a 4% para bombear através do animal durante cerca de 8-10 min (300 ml). Aumentar gradualmente a pressão até atingir um máximo de 30 ml / min. Um fígado endurecido é a melhor indicação de uma perfusão de sucesso. </li></ol> 10. Tissue recolha e processamento, Histologia e Iimmunohistochemistry <ol><li> Dissecar medulas espinhais de T5 a L1. Em seguida, pós-fixar o tecido em 6 ml em 4% PFA (O / N a 4 ° C). </li><li> Coloque o mesmo tecido em uma solução com 30% de sacarose durante 72 horas a 4 ° C, a fim de protegê-lo e crio para impedir a formação de cristais durante o congelamento. </li><li> Resfriamento rápido o cabo usando gelo seco e armazená-lo a -80 ° C. </li><li> Secção por meio de um criostato com 15 mm de espessura e recolher secções sobre lâminas de vidro e continuar para imunocitoquímica. </li><li> Enxágüe seções com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes; 5 minutos cada, temperatura ambiente). </li><li> Permeabilizar cada lâmina com 200 ul de 10% NGS e 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 1 h à TA. </li><li> Enxágüe seções com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes; 5 min cada, RT). </li><li> Bloquear os sítios não específicos com 200 ul de solução para a corrediça de bloqueio (5% de NGS; 0,1% de Triton X-100 em PBS) durante 30 min (RT). </li><li> Incubar cada lâmina com 200 ul de anticorpos primários O / N a 4 ° C (anticorpo diluído em 5% de NGS; 0,1% de Triton X-100 em PBS). </li><li> Lave os cortes com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes, 5 minutos cada; RT). </li><li> Incubar com anticorpos secundários apropriados durante 2 horas à TA. </li><li> Lave os cortes com 200 mL de PBS para cada slide (3 vezes, 5 minutos cada; RT). </li><li> Stain núcleos com 200 ul de 4 &#39;, 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 ug / ml de concentração final, 10 minutos à temperatura ambiente). </li><li> Montar usando o Reagente FluorSave e analisar por microscopia confocal. NOTA: Emdeterminações de controlo, anticorpos primários deve ser omitida e substituída com concentrações equivalentes de IgG não relacionados da mesma subclasse. Foi utilizada associada a microtúbulos Protein 2 anticorpo primário. </li></ol>

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M., Gorio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability-dependent+promoting+action+of+adult+neural+precursors+in+spinal+cord+injury.">Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury.</a> Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).</li><li>Bottai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+promote+motor+recovery+and+affect+inflammatorycell+infiltration+in+spinal+cord+injured+mice.">Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice.</a> Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).</li></ol>

Os autores declaram que não há interesse financeiro concorrente.

Neste artigo é descrito um método para obter um modelo reprodutível de lesão medular traumática usando um Infinito Horizon Impactor com uma força de 70 Kdyne (grave). Usando um paradigma força maior (80 Kdyne), que pode causar uma lesão mais grave que, infelizmente, está associado à mortalidade camundongos mais elevados. Para evitar esse problema, é comumente escolher um paradigma força moderada (70 Kdyne) que está associado a uma lesão repetíveis com uma recuperação gradual da função e menor mortalidade. Para produzir uma lesão tão estável, é muito importante que se preste especial atenção à fixação correta do animal na plataforma pêndulo; em particular, a medula espinhal deve ser centrado na ponta do pêndulo, e os dois braços do pêndulo devem ser paralelos um ao outro. Além disso, a atenção deve ser tomado em bloquear o animal com a pinça do impactador, quando as vértebras pode ser esmagado e o fio pode ser danificado pelas pontas das pinças. O posicionamento da animal após a laminectomia é crítico, e o manuseio dos animais durante este processo também é muito importante. Também deve ser dada especial atenção ao processo de laminectomia, que deve ser realizada sempre no mesmo local e pela mesma extensão. Quando estes procedimentos são realizados durante a laminectomia, outra questão metodológica para monitorar é a redução do risco de danificar o cabo ao usar micro-tesoura, Rongeur, ou pinça para cortar ossos e libertar o cabo através da remoção da lâmina, para eliminar o remanescente saliências ósseas laterais e fragmentos, e para remover o periósteo. O uso de micro-tesouras e Rongeur com pontas voltadas para cima irá reduzir o risco de se deparar com os problemas acima mencionados. Uma limitação importante deste método é a alta probabilidade de que os animais podem desenvolver infecções urinárias graves internos e externos no período pós lesão. A infecção externo é devido à incapacidade dos ratinhos lesionados a move com suporte de peso dos membros posteriores. Em contraste, a infecção urinária interno pode ser causado pela incapacidade dos ratinhos lesionados de urinar de forma independente. A fim de evitar estes problemas, é absolutamente necessário para injectar os animais com o antibiótico indicado e para verificar o tamanho da bexiga duas vezes por dia durante os procedimentos de cuidados animais da primeira semana. O estado de hidratação e o peso deve ser verificado com cuidado durante as três primeiras semanas após a lesão. Aplicando os procedimentos descritos, fomos capazes de obter déficits reprodutíveis da função dos membros posteriores que foram avaliados através de um teste comportamental específico desenvolvido pela Basso e colegas (BMS) 18. Imediatamente após a lesão, a perda da função de membro posterior está completa, que é seguida por uma recuperação gradual que é mais importante durante as primeiras 2-3 semanas. A recuperação comportamental atingiu um nível superior quando os ratinhos foram tratados com lesionados adulto PM-NPCs (Figura 1 </strong&gt;). Nós também seccionados medula espinal de ratinhos tratados célula às 4 semanas após a lesão, e detectado PKH26 positivo PM-NPCs por meio de microscopia confocal nas bordas da lesão (Figura 3). Estimou-se que o número total de vital enxertado PM-NPCs é maior do que os CES enxertados e NSC adultos como relatados anteriormente por nosso grupo de pesquisa 20-21. Às quatro semanas após a lesão e transplante, a maioria PM-NPCs têm corpos maiores e possuem alargada processos dendríticos semelhantes que são totalmente imunomarcadas pelos anticorpos específicos para MAP-2 (Figura 4). A grande vantagem deste modelo de lesão medular traumática é a padronização da lesão. A curva relacionada ao tempo reprodutível de recuperação dos membros posteriores de função também é alcançado. Tal reprodutibilidade torna possível definir estudos de prova de princípio para tratamentos investigados, incluindo transplante de células para a medicina regenerativa studies com um número reduzido de casos. Além disso, vários aspectos da patof isiologia da lesão da medula espinal pode ser analisado em maior detalhe.

A lesão medular (LM) é a lesão mais comum causada por trauma de alta energia, como veículos automóveis acidentes, quedas, esportes e violência 1. Em grave SCI, a força lesão destrói ou danifica o tecido neural, causando perda súbita da função neurológica. Traumatic SCI ocorre frequentemente em adultos jovens entre 10 e 40 anos de idade. Ela afeta grandemente condição mental e física do paciente e causa enorme impacto econômico para a sociedade 2. A abordagem de tratamento na fase aguda é geralmente limitada a uma alta dose de corticosteróide, a estabilização cirúrgica e descompressão para possivelmente atenuar danos maiores 3-4, mas os papéis desses métodos na recuperação locomotora após SCI ainda são controversos. Além da perda de tecido aguda, lesão traumática e a activação de mecanismos secundários de degeneração causa desmielinização e morte de vários tipos de células 5-6. O grau de recuperação da função pode dedez ser correlacionado com a extensão da matéria branca poupado no local da lesão 7. Os modelos animais de SCI pode ser usado tanto para investigar as respostas biológicas do tecido a lesão e para testar terapias potenciais. Além disso, um modelo animal útil de uma patologia humana, não só tem que reproduzem alguns aspectos dessa condição, mas deve também oferecer vantagens sobre observação clínica directa e experimento. Os modelos mais amplamente utilizados de lesão da medula espinal ou contusão envolvem compressão lesão entregue para a medula espinal exposta cirurgicamente 8. O desenvolvimento de uma contusão peso-drop controlados representam um marco importante na história da pesquisa SCI. O centro de pesquisa medula espinhal Ohio State University tem prosseguido o desafio tecnológico de um dispositivo que pode ser usado para induzir uma compressão particular da medula espinal com parâmetros de impacto controlado por um computador 9. Esta foi originalmente projetado para uso with ratos; mais tarde foi modificado para aplicar em direção camundongos 10. As vantagens deste tipo de abordagem é que a biomecânica da lesão pode ser estudado com mais profundidade e os parâmetros de lesão pode ser definida de uma maneira mais completa, a fim de obter um modelo experimental reproduzível, portanto, permitindo uma avaliação mais precisa dos efeitos de tratamentos testados sobre o processo de recuperação funcional. Muitos estudos avaliaram os efeitos de transplante de uma variedade de células-tronco em modelos SCI 11. Temos recentemente isolado adultos neural células-tronco a partir da Sub-Ventricular Zone (SVZ) várias horas após a morte do doador do mouse 12-13. Este procedimento proporciona uma população de células-tronco neurais, chamado post mortem precursores neurais (PM-NPCs), que parecem ser vantajoso em uma abordagem da medicina regenerativa para curar SCI. Neste artigo vamos demonstrar: i) o protocolo de marcação celular com o PKH26 tracer vital, ii) o surgical procedimento para executar em SCI traumático, e iii) a administração intravenosa (iv) administração de células marcadas. Além disso, neste trabalho demonstram que as células transplantadas migrar para locais de lesão da medula espinhal e diferenciar principalmente em proteína associada microtúbulos (MAP) 2 células positivas. Além disso, a diferenciação é acompanhada pela promoção de uma recuperação estável da função dos membros posteriores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">PKH26GL-1KT&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">091M0973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Infinite horizon (IH) Impactor device&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Precision Systems and Instrumentation, LLC</td>
			<td style="width:119px;">Model 0400 Serial 0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Gentamycin 10mg/ml</td>
			<td style="width:115px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECM0011B</td>
			<td>1mg/ml in sterile saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Isoflurane-Vet 250ml</td>
			<td style="width:115px;">Merial</td>
			<td style="width:119px;">B142J12A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Blefarolin POM OFT 10g</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Slide Warmer</td>
			<td style="width:115px;">2Biological Instruments</td>
			<td style="width:119px;">HB101-sm-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Scalpel, size 10</td>
			<td style="width:115px;">Lance Paragon</td>
			<td style="width:119px;">26920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Small Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">2Biological Instruments</td>
			<td style="width:119px;">11023-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Rongeur</td>
			<td style="width:115px;">Medicon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">07 60 07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Micro scissors</td>
			<td style="width:115px;">2Biological Instruments</td>
			<td style="width:119px;">15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Absorbable sutures (4/0)</td>
			<td style="width:115px;">Safil Quick</td>
			<td style="width:119px;">C0046203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hemostat</td>
			<td style="width:115px;">2Biological Instruments</td>
			<td style="width:119px;">13014-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Reflex 7 wound clip applicator</td>
			<td style="width:115px;">2Biological Instruments</td>
			<td style="width:119px;">12031-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">7mm Reflex wound clips</td>
			<td style="width:115px;">2Biological Instruments</td>
			<td style="width:119px;">12032-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">NGS</td>
			<td style="width:115px;">Euroclone</td>
			<td>ECS0200D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:115px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">1086431000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Anti Microtubule Assocoated Protein&#160; (MAP) 2</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluorSave Reagent&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Neural stem cells medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 &#956;g/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:115px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ASM5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">l-glutamine</td>
			<td style="width:115px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">glucose</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">putrescine</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5780-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">progesterone</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6149-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Sodium-selenite</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9133-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">transferrin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T 5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Insulin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Heparin sodium-salt</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H0200000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">bFGF</td>
			<td style="width:115px;">Life Technology</td>
			<td style="width:119px;">PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">h-EGF</td>
			<td style="width:115px;">Life Technology</td>
			<td style="width:119px;">PHG6045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Syringe 0.33cc 29G</td>
			<td style="width:115px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">MYJECTOR&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:115px;">Schering Plough SpA</td>
			<td style="width:119px;">TEMGESIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">eye gel</td>
			<td style="width:115px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">LIPOSIC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural stem cell transplantation in experimental contusive model of spinal cord injury

A lesão medular é uma condição clínica devastadora, caracterizada por um complexo de disfunções neurológicas. Os modelos animais de lesão da medula espinal pode ser utilizado tanto para investigar as respostas biológicas a lesões e para testar terapias potenciais. Contusão ou compressão lesão entregue à medula espinal exposta cirurgicamente são os modelos mais amplamente utilizados de patologia. Neste relatório, a contusão experimental é realizada utilizando o dispositivo Impactor Infinito Horizon (IH), que permite a criação de um modelo animal lesão reprodutível através da definição de parâmetros de lesão específica. O transplante de células-tronco é comumente considerado uma estratégia potencialmente útil para a cura desta doença debilitante. Numerosos estudos têm avaliado os efeitos do transplante de uma variedade de células estaminais. Aqui demonstramos um método adaptado para lesão da medula espinal, seguido por injecção na veia da cauda de células em ratos CD1. Em suma, nós fornecemos procedimentos para: i) marcação celular with um traçador vital, ii) o atendimento pré-operatório de ratos, iii) execução de uma lesão medular contundente, e iv) a administração intravenosa de pós mortem precursores neurais. Este modelo de contusão pode ser utilizado para avaliar a eficácia e segurança de transplante de células estaminais em uma abordagem de medicina regenerativa.

O número total de células transplantadas é 1 x 10 6 células e foi dividido em três injecções consecutivas na veia da cauda. Nós administrado 3,3 x 10 5 células em 50 ul de solução tampão de fosfato (PBS). A primeira injecção foi realizada no prazo de 30 minutos após a lesão, o segundo 6 horas mais tarde e as últimas 18 horas após a lesão. A escolha de um limite de tempo de 18 horas após a administração de SCI para PM-NPCs foi determinada pela permeabilidade óptima da barreira hemato-encefálica em 14 este tempo. Para avaliar o efeito da injecção de células estaminais seria útil ter positivos laminotomias os animais de controlo (n = 14) e injectados com PBS animais como um controlo negativo (n = 14). PM-NPCs Melhorar a recuperação da função Hind Limb, migrar para o local da lesão e se diferenciar em MAP-2 células positivas A contusão T9 causou a perda transitória da função do membro posterior seguido por um g progressivarecuperação radual (Figura 1). Dentro de 2-3 semanas, os ratos lesionados tratados com PBS melhorado e função dos membros posteriores chegou a 3 pontos de BMS (correspondente a colocação plantar da pata com ou sem suporte de peso ou ocasional, freqüente, ou consistente stepping dorsal, mas não plantar pisar 18) . Em vez disso, dentro do mesmo período de observação, os ratos lesionados tratados com PM-NPCs mostrou uma recuperação maior, chegando a 4,5 pontos de BMS (correspondente a stepping plantar frequente ou consistente, sem coordenação, ou plantar freqüente, ou consistente pisando com um pouco de coordenação). A melhoria comportamental foi particularmente evidente no período de 7 dias e 14 dias após a LM. Sem sinais de membro anterior alodinia-like hiper sensibilidade 19 foram registrados em qualquer momento em qualquer grupo experimental durante todo o período de observação de 30 dias. Mais enxertada PM-NPCs, marcado com PKH26 (Figura 2), acumula nas bordas dalesão formando grupos (Figura 3) desde os primeiros dias de sua administração. Em seguida, as células transplantadas migraram ao longo das bordas da lesão e de uma forma mais difundida onde diferenciadas, assumindo gradualmente a conformação assimétrica celular dos neurónios. Aos 30 dias após a lesão e o transplante, o corpo da célula de PM-NPCs aumentou em tamanho e na maioria das células dendríticas processos semelhantes foram evidentes e totalmente imunocoradas pelos anticorpos específicos para MAP-2 (Figura 4). A realização de complexidade morfológica e da positividade para MAP2 por transplantado PM-NPCs não é provável devido à fusão com sobrevivendo hospedeiras neurônios da medula espinhal, o que é evidente na sua morfologia claramente diferenciados e da ausência de dois núcleos em um único celular rotulados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52141/52141fig1highres.jpg" /> Figura 1. PM-NPCs melhorar RECOV funcionalEry em animais feridos. A locomoção campo aberto foi o teste empregado para a determinação de retorno da função motora 18. Os animais foram testados no dia anterior a contusão e marcou 9 pontos na escala BMS. No primeiro dia pós-lesão nos animais lesionados, a pontuação BMS diminuiu para zero. A recuperação da função dos membros posteriores de ratos lesionados apresentaram uma melhora duradoura notável e muito tempo, quando os animais foram tratados com PM-NPCs. A análise foi realizada em dupla ocultação, e cada grupo foi composto por 14 animais. Os valores representam média ± SEM. Nós determinamos as diferenças estatísticas por meio de análise de variância seguida do pós-teste de Tukey. *** P &lt;0,001; ** P &lt;0,01 vs PBS. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52141/52141fig2highres.jpg" /> Figura 2. PKH26 rotulagem dos PM-NPCs. Após o procedimento de marcação com PKH26, PMNPCS são visu<html> desmineralizada com o microscópio de imagem ao vivo Evos fl e microfotografia foi tirada com o mesmo instrumento (escala bar = 50 mm). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52141/52141fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52141/52141fig3highres.jpg" /> Figura 3. Localização da PM-NPCs no local da lesão PKH26 marcado PM-NPCs (vermelho) estão presentes em todas as bordas do local da lesão em 30 dias após a sua injeção iv.. A imagem é representativo para um rato, mas imagens semelhantes foram obtidos por pelo menos 5 animais (barra de escala = 50 m). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52141/52141fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> carga / 52141 / 52141fig4highres.jpg &quot;/&gt; Figura 4. expressão MAP2 em transplantado PM-NPCs. A maioria PKH26 marcado PM-NPCs (vermelho) adquiriu uma forma neuronal-like com processos dendríticos-like e tinha diferenciado MAP-2 células positivas (verde). Os núcleos são corados em azul (DAPI). A imagem é representativo para um rato, mas imagens semelhantes foram obtidos por pelo menos 5 animais (barra de escala = 25 m). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52141/52141fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

A lesão medular é uma condição traumática que causa grave morbidade e mortalidade elevada. Neste trabalho, descrever em detalhes um modelo contusão de lesão medular em ratos, seguido por um transplante de células-tronco neurais.

Neural Stem Cell Transplantation em Experimental contusão Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

neural-stem-cell-transplantation-experimental-contusive-model-spinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

12.9K visualizações.  University of Milan.  A lesão medular é uma condição traumática que causa grave morbidade e mortalidade elevada. Neste trabalho, descrever em detalhes um modelo contusão de lesão medular em ratos, seguido por um transplante de células-tronco neurais. 

Vídeo: Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) cases 1 and is the ultimate cause of death in patients with the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS) 2.
ALS is a devastating neurological disorder that is characterized by relatively rapid degeneration of upper and lower motor neurons. Patients ultimately succumb to the disease on average 2-5 years following diagnosis because of respiratory paralysis due to loss of phrenic motor neuron innnervation of the diaphragm 3. The vast majority of cases are sporadic, while 10% are of the familial form. Approximately twenty percent of familial cases are linked to various point mutations in the Cu/Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) gene on chromosome 21 4. Transgenic mice 4,5 and rats 6 carrying mutant human SOD1 genes (G93A, G37R, G86R, G85R) have been generated, and, despite the existence of other animal models of motor neuron loss, are currently the most highly used models of the disease.
Spinal cord injury (SCI) is a heterogeneous set of conditions resulting from physical trauma to the spinal cord, with functional outcome varying according to the type, location and severity of the injury 7. Nevertheless, approximately half of human SCI cases affect cervical regions, resulting in debilitating respiratory dysfunction due to phrenic motor neuron loss and injury to descending bulbospinal respiratory axons 1. A number of animal models of SCI have been developed, with the most commonly used and clinically-relevant being the contusion 8.
Transplantation of various classes of neural precursor cells (NPCs) is a promising therapeutic strategy for treatment of traumatic CNS injuries and neurodegeneration, including ALS and SCI, because of the ability to replace lost or dysfunctional CNS cell types, provide neuroprotection, and deliver gene factors of interest 9.
Animal models of both ALS and SCI can model many clinically-relevant aspects of these diseases, including phrenic motor neuron loss and consequent respiratory compromise 10,11. In order to evaluate the efficacy of NPC-based strategies on respiratory function in these animal models of ALS and SCI, cellular interventions must be specifically directed to regions containing therapeutically relevant targets such as phrenic motor neurons. We provide a detailed protocol for multi-segmental, intraspinal transplantation of NPCs into the cervical spinal cord ventral gray matter of neurodegenerative models such as SOD1G93A mice and rats, as well as spinal cord injured rats and mice 11.

Neural precursor transplantation is a promising strategy for protecting and/or replacing lost/dysfunctional cervical phrenic motor neurons in spinal cord injury (SCI) and the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS). We provide a protocol for cell delivery to cervical spinal cord ventral horn in rodent models of ALS and SCI.

Intra Transplante de Células de Segmentação Chifre Cervical Ventral em Esclerose Lateral Amiotrófica e lesão medular traumática

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) ...

Medicina

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory testing in rat SCI models is needed. However, until recently, no single testing approach had been validated for SCI so that standardized methods have not been implemented across labs. Additionally, available testing methods could not be implemented acutely or when severe motor impairments existed, preventing studies of the development of SCI-induced allodynia3. Here we present two validated sensory testing methods using von Frey Hair (VFH) monofilaments which quantify changes in tactile sensory thresholds after SCI4-5. One test is the well-established Up-Down test which demonstrates high sensitivity and specificity across different SCI severities when tested chronically5. The other test is a newly-developed dorsal VFH test that can be applied acutely after SCI when allodynia develops, prior to motor recovery4-5. Each VFH monofilament applies a calibrated force when touched to the skin of the hind paw until it bends. In the up-down method, alternating VFHs of higher or lower forces are used on the plantar L5 dermatome to delineate flexor withdrawal thresholds. Successively higher forces are applied until withdrawal occurs then lower force VFHs are used until withdrawal ceases. The tactile threshold reflects the force required to elicit withdrawal in 50% of the stimuli. For the new test, each VFH is applied to the dorsal L5 dermatome of the paw while the rat is supported by the examiner. The VFH stimulation occurs in ascending order of force until at least 2 of 3 applications at a given force produces paw withdrawal. Tactile sensory threshold is the lowest force to elicit withdrawal 66% of the time. Acclimation, testing and scoring procedures are described. Aberrant trials that require a retest and typical trials are defined. Animal use was approved by Ohio State University Animal Care and Use Committee.

We describe two tactile sensory testing methods for acute or chronic periods of spinal cord injury in rats. These validated procedures can detect the development and maintenance of allodynia-like sensations.

Aguda e crônica teste sensorial tátil após a lesão medular em ratos

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

Um Modelo contundente de lesão da medula espinhal cervical unilateral Usando o Impactor horizonte infinito

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Use of genetically modified mice enhances our understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders such as a spinal cord injury (SCI). Freehand manual control used to produce a laceration model of SCI creates inconsistent injuries often associated with a crush or contusion component and, therefore, a novel technique was developed. Our model of cervical laceration SCI has resolved inherent difficulties with the freehand method by incorporating 1) cervical vertebral stabilization by vertebral facet fixation, 2) enhanced spinal cord exposure, and 3) creation of a reproducible laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm in depth without associated contusion. Compared to the standard methods of creating a SCI laceration such as freehand use of a scalpel or scissors, our method has produced a consistent lesion. This method is useful for studies on axonal regeneration of corticospinal, rubrospinal, and dorsal ascending tracts.

A novel technique to create a reproducible in vivo model of cervical spinal cord laceration injury in the mouse is described. This technique is based on spine stabilization by fixation of the cervical facets and laceration of the spinal cord using an oscillating blade with an accuracy of &plusmn;0.01 mm.

Controlada por laceração do colo do útero em camundongos

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is described to obtain a consistent model of severe SCI. Use of a stereotactic frame and computer controlled impactor allows for creation of reproducible injury. Hypothermia and urinary tract infection pose significant challenges in the post-operative period. Careful monitoring of animals with daily weight recording and bladder expression allows for early detection of post-operative complications. The functional results of this contusion model are equivalent to transection models. The contusion model can be utilized to evaluate the efficacy of both neuroprotective and neuroregenerative approaches.

A contusion model of severe spinal cord injury is described. Detailed pre-operative, operative and post-operative steps are described to obtain a consistent model.

Um modelo de contusão grave de lesão medular em ratos

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing reliable cervical SCI is difficult due to lack of satisfactory methods of vertebral stabilization. The conventional method to stabilize the spine is to suspend the rostral and caudal cervical spine via clamps attached to cervical spinous processes. &#160;However, this method of stabilization fails to prevent tissue yielding during the contusion as the cervical spinal processes are too short to be effectively secured by the clamps (Figure 1). &#160;Here we introduce a new method to completely stabilize the cervical vertebra at the same level of the impact injury. &#160;This method effectively minimizes movement of the spinal column at the site of impact, which greatly improves the production of consistent SCIs. &#160;We provide visual description of the equipment (Figure 2-4), methods, and a step-by-step protocol for the stabilization of the cervical 5 vertebra (C5) of adult rats, to perform laminectomy (Figure 5) and produce a contusive SCI thereafter. &#160;Although we only demonstrate a cervical hemi-contusion using the NYU/MASCIS impactor device, this vertebral stabilization technique can be applied to other regions of the spinal cord, or be adapted to other SCI devices. &#160;Improving spinal cord exposure and fixation through vertebral stabilization may be valuable for producing consistent and reliable injuries to the spinal cord. &#160;This vertebral stabilization method can also be used for stereotactic injections of cells and tracers, and for imaging using two-photon microscopy in various neurobiological studies.

Vertebral stabilization is necessary for minimizing variability, and for producing consistent experimental spinal cord injuries.&#160; Using a customized stabilizing apparatus in conjunction with the NYU/MASCIS impactor device, we have demonstrated here the proper equipment and procedure for generating reproducible hemi-contusive cervical (C5) spinal cord injuries in adult rats.

Um método de estabilização Novel Vertebral para a Produção de contusão Lesão Medular

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controlado Modelo Impact Cortical para lesão cerebral traumática

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter connected to a radio transmitter into the femoral artery of rats that underwent a T4 spinal cord transection with or without grafting of embryonic brainstem-derived neural stem cells expressing green fluorescent protein. Compared to other methods such as cannula insertion or tail-cuff, telemetry is advantageous to continuously monitor blood pressure and heart rate in freely moving animals. It is also capable of long term multiple data acquisitions. In spinal cord injured rats, basal cardiovascular data under unrestrained condition and autonomic dysreflexia in response to colorectal distension were successfully recorded. In addition, cardiovascular parameters before and after SCI can be compared in the same rat if a transmitter is implanted before a spinal cord transection. One limitation of the described telemetry procedure is that implantation in the femoral artery may influence the blood supply to the ipsilateral hindlimb.

We present a protocol for using a radio-telemetric system to record cardiovascular parameters in T4 spinal cord transected rats eight weeks after embryonic brainstem neural stem cell grafting into the lesion site. Telemetry is an advanced technique to accurately evaluate cardiovascular function in conscious freely moving spinal cord injured rats.

Um sistema de rádio-telemetria para monitorar a função cardiovascular em ratos com Medula Espinhal transecção e Embryonic Stem Neural enxertos de células-

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Use Synergetic de células neuronais precursoras e Peptídeos de auto-montagem em Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...