The authors have nothing to disclose.

Todos os procedimentos e testes comportamentais foram aprovadas pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade MacEwan sob o protocolo número 06-11-12, que está em conformidade com o Conselho Canadense para as diretrizes do Animal Care para o cuidado e uso de animais de experimentação. 1. Prepare Tanques Dosagem, soluções e esquema de administração <ol><li> Preparar um esquema de administração de tal modo que os animais são doseados no mesmo ambiente e durante o mesmo tempo do dia a fim de evitar quaisquer confunde de tempo ou de polarização a estímulos visuais. </li><li> Obter o maior número, 1,5 L, tanques de desova de polipropileno claras idênticos como necessárias para o número de tamanhos de grupo. Utilização grupos de 8 peixes por tanque, o que permite por 2 grupos de peixe a ser testado por dia mais tarde no procedimento (ver etapa 3). Use um tanque de retenção e um tanque de dosagem por grupo (2x número total de grupos). <ol><li> Coloque 400 mm em todas as inserções de desova tanques de retenção. Fmal os tanques com água habitat ou água de osmose reversa na temperatura correta (de peixe-zebra, 25-28 ° C), que é consistente com o peixe temperatura são normalmente alojados em. NOTA: Não pode haver interações químicas indesejadas entre algumas drogas e os componentes químicos da água habitat tamponada. Nesta situação, usar água de osmose reversa tamponada com sais de aquário mínimo ou nenhum para a administração da droga, bem como para os grupos de controle. </li><li> Certifique-se de que os tanques estão em um ambiente neutro para evitar peixes condicionado a estímulos visuais externos durante a administração. </li></ol></li><li> Preparar a solução de fármaco. Misturar a quantidade apropriada de água com a droga habitat nos tanques de desova. Preparar a solução de etanol a 0,2% por combinação de 3 ml de um etanol de alto grau (95% de etanol não desnaturado) com 1,497 ml de água. Preparar a solução de etanol a 1,4% por combinação de 21 mL de etanol com 1479 ml de água. </li></ol> 2. A compensação Peixes e Ethanol Procedimento Administração <ol><li> Peixe cuidadosamente líquida de seus tanques de habitats e transferência para o tanque de retenção apropriado contendo a inserção de desova. Idealmente, abrigar o peixe na inserção de desova para eliminar compensação por completo. </li><li> Com todos os peixes em seus respectivos tanques de retenção, levante com cuidado a desova inserir fora do tanque de retenção e colocá-lo no tanque de solução droga apropriada (Figura 1A). <ol><li> Anote o tempo de dosagem, conforme necessário. Use 30 min em solução de etanol para o processo descrito aqui. </li><li> Se possível, tenha assistentes ajudar com a transferência de todos os grupos experimentais para a solução da droga ao mesmo tempo para garantir o tempo de dosagem precisa. Em alternativa, transferir um grupo de cada vez e manter o controle de dosagem vezes (Figura 1A) &#39;grupos individuais. </li></ol></li><li> No final do período de dosagem necessária, remover o peixe a partir da solução de etanol com cuidado levantando a inserção de desovapara fora da solução do fármaco e colocando suavemente de volta para o tanque de retenção. </li><li> Gentilmente net o peixe nos tanques de conservação e colocá-los de volta para seu habitat até a próxima vez a administração programada, ou coloque a desova inserir de volta para o tanque de retenção para eliminar compensação. </li><li> Como mencionado anteriormente, se possível, dentro dos parâmetros do equipamento de animais habitação, casa dos animais do mesmo tanque de desova e inserção que é utilizada como o tanque de retenção. Isto irá eliminar compensação completamente durante o processo de administração. </li></ol> 3. Teste Comportamental <ol><li> Obter uma luz / escuro arena de 9,5 centímetros de largura por 55 cm de comprimento e 9,5 cm de profundidade com um piso impermeável branco (Figura 1B). Cole papel não-reflexiva impermeável branco e preto para as paredes internas da arena usando velcro, com metade da arena coberta de branco e metade coberto de preto. Encher a arena a uma profundidade de 5 cm de altura com água a uma temperatura de habitat de 25-28 ° C. Manutain esta temperatura durante todo o teste. </li><li> Minimalize estímulos visuais externos através da construção de um cerco de três lados branco para a arena para situar-se em. Certifique-se de área de testes tem difundir iluminação superior que não causa reflexos na superfície da água, mas é suficientemente brilhante para o software de rastreamento de movimento, ou pós quantificação manual do -hoc a partir de imagens de vídeo. </li><li> Coloque a arena no recinto e definir os parâmetros de gravação e análise de movimento do software de rastreamento de comportamento. Defina a duração de teste para 5-15 min, dependendo da questão de pesquisa. NOTA: Aqui, usamos 5 min. </li><li> Transportar o grupo de peixes a ser testado para a área de pesquisa no tanque de habitat e colocá-los do lado de fora do gabinete arena. Aclimatar o peixe por 10 min. </li><li> Gentilmente net um peixe do grupo e local apropriado no centro da luz / Arena escuro, tendo a certeza de soltar o peixe quando é posicionada paralela ao longo eixo da arena para avoID de influenciar os resultados do peixe para a luz ou zona escura. </li><li> Comece comportamento gravação imediatamente depois que o animal é liberado. Preste atenção para os problemas de software com acompanhamento de peixe ou de peixe que salta ou congelamento. Girar a arena 180 ° depois de metade dos sujeitos foram testados para prevenir quaisquer confunde devido a preconceitos resultantes da qual a extremidade da arena está orientado para a extremidade aberta do invólucro. </li><li> Após o julgamento terminou, gentilmente net e retire o peixe da arena para um tanque ou tanque de habitat. </li></ol> 4. Análise <ol><li> Examine o tempo gasto na luz contra as zonas escuras. Para cada grupo e cada peixe, obter o tempo relativo gasto nas zonas claras e escuras e analisar usando um teste t uma amostra (ou teste de Wilcoxon para dados não paramétricos; diferença de (metade do tempo de julgamento total) 150 sec) para determinar se os grupos preferem significativamente uma área sobre a outra. </li><li> Para comparar preferências, calcular a prefeíndice de rence, subtraindo o tempo gasto na zona de luz a partir do tempo gasto na zona escura e comparar as diferenças entre grupos. t- testes pode ser utilizado para comparar dois grupos. Compare vários grupos com um one-way análise de variância, utilizando o teste post hoc HSD de Tukey onde (ou teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn teste post hoc para dados não paramétricos) necessário. </li><li> Compare a velocidade, número de transições de zona, sinuosos, e imobilidade entre os grupos. Use one-way análise de variância, utilizando o teste post hoc HSD de Tukey onde (ou teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn teste post hoc para dados não paramétricos) necessário. </li></ol>

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Os autores reconhecem Joshua Gallup para o uso de seu equipamento de fotografia utilizada para a Figura 1. Este trabalho foi apoiado por um Conselho de Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia (NSERC) Canadá Descoberta de subvenção (para TJH).

Estudos anteriores envolvendo a administração da droga no peixe-zebra simplesmente invocada compensação peixes para transportá-los a partir de seu tanque de casa para a solução de drogas 12,16. Rede nem sempre é consistente e frequentemente leva mais tempo do que o esperado, devido à resposta de fuga do peixe-zebra, que tem variabilidade individual significativa. Métodos de transferência tradicionais, embora úteis, pode ser melhorado através da diminuição da quantidade de tempo total dos peixes passar do lado de fora da água, assim como diminuir a quantidade de variabilidade no tempo de transferência entre os animais. Além de melhorar a praticabilidade, este método dá investigadores a capacidade para dosear grandes grupos de peixes simultaneamente numa solução para uma quantidade precisa de tempo. Métodos anteriores requerem ou dosagem de um único peixe, ou a tentativa de um lucro líquido de toda grupos de peixes ao mesmo tempo. O primeiro é lento e diminui o rendimento, enquanto que o último é uma tarefa difícil e incómodo. Além disso, os sistemas de rastreamento de movimento que cuma avaliação do comportamento dos peixes múltiplos de uma só vez pode se beneficiar com a precisão do método. Peixe pode ser transferido diretamente a partir da inserção de desova para a arena empolamento, o que garantiria perto a exposição simultânea a arena para todos os peixes. Utilizando esse novo método produziu resultados significativos quando implementado em três grupos de peixes-zebra ao longo de um período de 21 dias. Peixes controle recebeu nenhum álcool, peixe diariamente moderada recebeu uma pequena quantidade de álcool, uma vez por dia e, semanalmente, binge peixe recebeu uma grande dose de álcool uma vez por semana durante o período de 21 dias. Na tarefa de luz / escuro, o procedimento de dosagem não alterou a preferência normal do peixe-zebra para a zona escura sob condições de controlo. No entanto, após 2 dias de retirada do etanol, peixe-zebra no grupo diária moderada preferido a zona de luz da arena, uma reversão de preferência. A análise estatística confirma uma mudança significativa na zona de preferências. É possível que o doseamento procedure resultou em etanol, devido ao comportamento de procura de um lugar de preferência condicionada (CPP), com a procura de peixe etanol (um estímulo appetitive), e preferindo a zona de branco devido à sua semelhança em relação à área de doseamento brilhante. Uma pesquisa recente revela que a PPC pode ocorrer em peixes-zebra e em áreas onde peixe-zebra são doseados com etanol 17,18. Weekly binge-peixe não mostraram preferência dois dias postar etanol, e apesar de evidências sobre os mecanismos neurais responsáveis ​​por esse achado está faltando, é possível que doses esporádicas, mas grandes de álcool pode danificar o cérebro, possivelmente deixando peixe incapaz de discriminar entre as zonas. Outra vantagem que este procedimento de dosagem confere pesquisadores é a sua generalização. Como descrito, o procedimento produz resultados claros e úteis no peixe-zebra. No entanto, o procedimento não se limita apenas ao peixe-zebra. As restrições sobre o processo estão relacionadas com o tamanho e limites dos tanques de dosagem, os animais e testing aparelho, assim como a capacidade para analisar os dados. Com o uso do software de rastreamento de movimento, estudos recentes têm investigado muitas variáveis ​​adicionais ao longo de um julgamento. Branco habituação evasão, praças cruzados, locomoção habituação, a latência para a zona branca, natação errática, thigmotaxis (tempo gasto perto das muralhas de arena), e avaliação de risco também podem ser quantificados 14. É concebível utilizar este procedimento em outros organismos modelo, como o peixinho, que foram anteriormente utilizados para investigar o papel da tolerância e retirada 19. Os investigadores que esperam para investigar os efeitos de outros agentes farmacológicos ou toxinas ambientais, a utilização de outros ensaios comportamentais, ou outros animais marinhos ou de água doce, também poderia utilizar esta metodologia básica. Usando este protocolo é simples e eficaz. No entanto, se os resultados não forem os esperados, considere a solução de problemas do sistema de rastreamento de movimento para garantir a coleta de dados adequada. Tracking deve ser suave e preciso em todos os ensaios. O sistema de seguimento deve ser gravar o movimento do centro do corpo-a do peixe em todos os momentos. Qualquer salto ou movimento errático do rastreamento ponto devido a artefatos visuais, tais como reflexos de luz em ondinhas da água, ou as configurações de rastreamento inadequados podem confundir os resultados. Algumas discrepâncias nos resultados podem surgir a partir de pequenas diferenças no desenho arena ou ambientes de dosagem. Para ter a certeza de replicação, a arena deve ser tal como descrito, particularmente no que diz respeito ao uso de um chão branco para maximizar a eficiência de rastreamento em peixes-zebra. Com outros peixes que são de cor mais clara, um piso escuro deve ser usado para ajudar no rastreamento de movimento. Da mesma forma, a dosagem do peixe em um ambiente que é livre de quaisquer estímulos visuais que poderiam influenciar o peixe é extremamente importante. Qualquer cor distinta, padrão ou matiz que é perceptível para os peixes poderiam confundir os resultados. A, de cor clara fundo neutro semelhante à do sistema de habitação é recomendada. &lt;/ P&gt; Embora seja possível modificar este método como necessário para outras espécies de peixes, os resultados podem variar em termos de luz inata / preferência escuro 20-21. É também importante notar ainda o processo descrito aqui ainda faz com que algum stress. Embora a compensação é significativamente reduzida, o procedimento ainda envolve um período muito curto de tempo em que os peixes devem estar fora de água, eventualmente induzir uma resposta ao estresse. Ramsay e seus colegas descobriram que 22 zebrafish rendeu teve, pelo menos, o dobro dos níveis de cortisol em seu corpo em comparação com aqueles que não foram compensados. Desde cortisol é um hormônio ligado ao estresse 11 isso pode alterar a resposta comportamental que é medido. Enquanto o nosso método reduz compensação, não eliminá-lo. No entanto, ele dá aos pesquisadores a oportunidade de eliminar a incidência da compensação, se o desejarem por peixe-zebra habitação nas inserções de desova. Estudos futuros devem investigar se o uso da inser desovat para a transferência de peixe pode diminuir a resposta ao estresse em relação à compensação. Além disso, é extremamente importante para manter a administração vezes precisas e transferir vezes entre os grupos. Mudanças nas vezes ou grandes diferenças de dosagem no tempo gasto fora da água poderia alterar os resultados. Para reduzir possíveis efeitos circadianos, também é fundamental para dosar o peixe durante tempos semelhantes do dia. Na atual peixe experimento foram dosados ​​e testados dez horas - duas horas. Replicação exata e confiável deste procedimento baseia-se em repetir o protocolo com precisão.

O peixe-zebra (Danio rerio) é uma pequena espécie de teleósteos originárias da Índia que é um organismo modelo útil para um comportamental e médica 2,3 pesquisa. Peixe-zebra também são vulgarmente usado nos testes de várias substâncias farmacológicas, a fim de caracterizar o seu impacto sobre o comportamento. Vários dosagens e horários de administração de medicamentos têm sido utilizados para investigar o comportamento do peixe-zebra, após a administração de compostos tais como estimulantes 4, 5 e ansiolíticos etanol 6-8. Nosso laboratório tem investigado os efeitos de diferentes horários de administração de etanol sobre a ansiedade de peixe-zebra e locomoção no claro / escuro de ensaio bem validado 9, 20, também comumente referido como o ensaio scototaxic. Um novo método de administração de etanol foi desenvolvido para aumentar a eficiência de repetitivo, a administração diária ao longo de um longo período de tempo (21 dias) 6 </sacima&gt;. Métodos utilizados anteriormente eram práticos, no entanto, buscou-se desenvolver um método que reduz de compensação, com seus custos de tempo associados, e permitiu simultânea administração do fármaco de interesse para um grande número de peixes, precisamente cronometrado. Na pesquisa utilizando tradicional etanol, peixe-zebra são compensados ​​e transferido de um tanque para outro contendo a mistura apropriada de etanol e água 10-12. Enquanto este método é amplamente aceite, a compensação de peixe-zebra pode aumentar a variabilidade no tempo necessário para introduzir e remover o peixe a partir da solução da droga. Portanto, a exposição exacto para o composto de interesse pode variar durante o curso de uma experiência que envolve a administração repetida. Um método que reduz as fontes de decorrentes da variabilidade nos tempos de transporte de erro é, portanto, desejável. Com o nosso método, somos capazes de mover todos os peixes ao mesmo tempo, resultando em um tempo de dosagem idêntica em cada peixe. Após a exposição ao etanol (descrito aqui), peixe-zebra pode ser testado em qualquer númer de ensaios comportamentais, incluindo aqueles que avaliam a ansiedade. Dosagem grupos de peixes usando o novo método tem usos práticos além da capacidade de reproduzir com exatidão e padronizar a dosagem entre sujeitos e entre grupos de peixes. O advento de um novo software que permite o rastreamento de peixes múltiplos de uma só vez pode ver os pesquisadores utilizam nossos métodos para garantir a replicabilidade e precisão em seus experimentos. Considerando-se a utilização generalizada de peixe-zebra como um organismo modelo para neurociência comportamental, este método vai aumentar a eficiência e viabilidade em futuros estudos farmacológicos. No presente paradigma, um esquema de dosagem repetida foi empregado que aproximadamente espelha horários de consumo humano. Os peixes foram distribuídos aleatoriamente para um dos três grupos: controle, diária moderada, ou semanal-compulsivos. O esquema de administração foi de 21 dias de duração, escolheu porque excedeu significativamente os tempos de exposição em estudos anteriores 7. Peixes controle recebeu a zero alcohol, peixe diariamente moderada receberam 0,2% de álcool, uma vez por dia e, semanalmente, binge peixe recebeu 1,4% de álcool, uma vez por semana. A tarefa de luz / escuro foi usado para avaliar a ansiedade após 2 dias de abstinência. Este é um teste relativamente simples de administrar, que utiliza uma arena rectangular em que as paredes de um lado, são de cor branca e no outro lado são escuros 9. Peixe-zebra adulto robustamente preferem o lado negro da arena em condições de controle 6,9,13. O aumento da ansiedade é operacionalmente definido como significativamente mais tempo gasto na zona escura, e diminuiu a ansiedade pode ser assumida quando o peixe passa relativamente mais tempo gasto na zona de luz. Com o software de rastreamento de movimento, outras variáveis ​​informativos também podem ser quantificados, incluindo velocidade média, a imobilidade, serpenteando, e zona de transição 14. O método de dosagem desenvolvido no nosso laboratório pode aplicar-se a qualquer pesquisa em que os compostos solúveis em água são administrados a um ou mais zebrafish. Muitos outros agentes farmacológicos que podem beneficiar desta metodologia estão sendo testadas em peixes-zebra. Comumente os compostos testados incluem a nicotina, clordiazepóxido, buspirona, e escopolamina, que são dissolvidos de um modo semelhante ao etanol; misturando a quantidade apropriada do produto químico em água. Portanto, o escopo geral deste procedimento é muito mais ampla e não limitada ao etanol. Além disso, após a dosagem com medicamentos para vários dias, a tarefa de luz / escuro é apenas um dos muitos testes comportamentais que podem ser empregadas. Após a administração de drogas ou durante a abstinência, outros ensaios populares que podem ser utilizados incluem o teste de mergulho novo tanque de 15 e testes de comportamento social, tais como empolamento 16. O procedimento a seguir irá delinear um método eficiente de repetidamente transferir grupos de peixes ou peixes individuais em soluções que contêm um composto farmacológico de interesse. Além disso, o processo de teste de ansiedade com o teste de luz / escuroem grupos de peixe que se encontram em retirada depois de ser exposto a longas listas da administração do álcool irá ser descrito.

<table><tbody><tr><td>Three shelf benchtop housing system</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/research-systems/z-hab-system/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1.5 L Spawning tank w/400 &amp;mu;m baffle</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/consumables/tanks-lids-and-baffles/info/nursery-tank-and-baffles/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pure Grain Ethanol</td><td><a href="http://www.luxco.com/brands/vodka-neutral-spirits-neutral-spirits-everclear" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Luxco, INC</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ethovision XT Motion tracking software</td><td><a href="http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Noldus Information Technology</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td><a href="http://eshop.eppendorf.ca/categories/1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Eppendorf Canada</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light/Dark Arena</td><td>Custom</td><td></td><td>Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.</td></tr></tbody></table>

a novel method of drug administration to multiple zebrafish (danio rerio) and the quantification of withdrawal

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed. 
This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Para manter a precisão e controlo em estudos farmacológicos com peixe-zebra é importante para o tempo de duração da administração de etanol de forma consistente e com precisão, tal como descrito acima. O nosso procedimento pode aumentar o rendimento e a facilidade do procedimento de dosagem. A administração de etanol no horário ou uma compulsão semanal ou diária moderada resultou em níveis de ansiedade alterados, medidos com o teste de claro / escuro, em comparação aos controles. Quando testados dois dias após a última dose, peixe-zebra no grupo de controle (que não recebeu nenhum álcool, mas ainda assim foram transferidos para tanques de dosagem) exibido o padrão esperado de comportamento, com os gastos peixes controle muito mais tempo no lado escuro da arena ( Figura 2A) semelhante ao peixe-zebra ingênuo em outros estudos 6,9,13. Peixe no grupo binge semanal não mostrou preferência por zonas ou a claras ou escuras na tarefa quando testados dois dias depois de sua última administração de etanol (Figura 2B </strong&gt;). Curiosamente, os peixes no grupo moderada diária preferida significativamente o lado da luz da arena (Figura 2C); em contraste com o grupo de controlo. O índice de preferência indicou uma diferença significativa entre os grupos controle e diária moderada (Figura 2D). Não houve diferenças significativas na velocidade de natação, ou a imobilidade entre os grupos (Tabela 1), e, por conseguinte, este efeito não foi devido a um défice motor no peixe. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/51851/51851fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Transferência de Procedimento e Luz / Arena escuro Estas fotos ilustram o procedimento de transferência (A) Em primeiro lugar, os peixes estão situados no tanque de transferência (à esquerda).. Dosagem tanque contendo etanol é retratado (direita). (BC) Mover o peixe do tanque de transferência para a solução de etanol requer a researcher para levantar a inserção de desova fora do tanque de transferência e para o tanque de solução de etanol. (D) A luz / escuro como ilustrado arena de 9,5 centímetros de largura medida de 9,5 cm de profundidade e 55 cm de comprimento. Piso branco é usado, juntamente com as paredes pretas na metade da arena (esquerda) e paredes brancas na outra metade, criando uma zona de luz e escuridão. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/51851/51851fig2display.jpg" /> Figura 2: Os resultados representativos e trackplots do procedimento de dosagem de etanol em três grupos de peixes-zebra, após dois dias de abstinência. (A) A trackplot representante de um caminho único movimento de controle em todo o peixe-zebra 5 min de luz / escuro julgamento. Abaixo é o mesmo trackplot peixe-zebra representado como um mapa de calor, que é uma representação de cor do peixe-zebra movimento ao longo do ensaio, com base no tempo gasto o peixe no local representado por cada pixel. (B) A represtrackplot tante de um único peixe-zebra do grupo semanal-binge em todo o 5 min de luz / escuro tarefa. Abaixo está o mapa de calor do mesmo peixe-zebra. (C) A trackplot representante de um movimento único peixe-zebra diária moderada em toda a 5 min de luz / escuro julgamento. Abaixo está o mapa de calor do mesmo peixe-zebra. (D) O índice de preferência foi calculado para todos os grupos de tempo gasto na zona de luz do tempo gasto na zona escura subtração. Os números negativos indicam preferência pela zona escura. Números positivos indicam preferência para a zona de luz. Os resultados indicam uma diferença significativa na preferência entre os grupos controle e diariamente moderadas em dois dias de retirada * p &lt;0,05 (one-way ANOVA). Nota há também uma significativa preferência por escuro no grupo de controlo, p &lt;0,05 (teste t uma amostra, diferença entre 0), e uma significativa preferência por luz no grupo diária moderada, p &lt;0,05 (uma amostra &lt;em&gt; t -teste, diferença de 0). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51851/51851fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td height="43" rowspan="2" style="height:42px;width:125px;"></td><td style="width:89px;"> Velocidade </td><td style="width:100px;"> Imobilidade </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:89px;"> (Cm / seg) </td><td style="width:100px;"> (Seg) </td></tr><tr height="42"><td height="42" style="height:43px;width:125px;"></td><td style="width:89px;"> 2 dias Wd </td><td style="width:100px;"> 2 dias Wd </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:125px;"> Controlo (n = 13) </td><td style="width:89px;"> 9,1 ± 0,6 </td><td style="width:100px;"> 1,9 ± 0,6 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:125px;"> Compulsão (n = 14) </td><td style="width:89px;"> 9,8 ± 0,5 </td><td style="width:100px;"> 0,8 ± 0,2 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:125px;"> Crónica (n = 15) </td><td style="width:89px;"> 10,3 ± 0,5 </td><td style="width:100px;"> 2,5 ± 1,0 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Velocidade média e imobilidade durante o teste de claro / escuro. A velocidade média de natação (cm / seg) e imobilidade (seg) de um grupo representativo de peixe-zebra, após 2 dias de abstinência (média ± SEM). Aqui, não foram encontradas diferenças significativas em qualquer velocidade ou imobilidade. Usado com permissão de Holcombe et al., (2013).

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A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish Danio rerio and the Quantification of Withdrawal

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Um novo método de Drug Administration para Multiple peixe zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Ea quantificação da Retirada

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish (Danio rerio) and the Quantification of Withdrawal

12.1K visualizações.  MacEwan University. A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

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Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Pesquisa do câncer

Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of stress-related diseases and psychiatric disorders, yet further studies into the genetic and neuronal regulation of stress are still required to develop better therapeutics. The zebrafish provides a powerful genetic model to investigate the neural underpinnings of stress, as there exists a large collection of mutant and transgenic lines. Moreover, pharmacology can easily be applied to zebrafish, as most drugs can be added directly to water. We describe here the use of the 'novel tank test' as a method to study innate stress responses in zebrafish, and demonstrate how potential anxiolytic drugs can be validated using the assay. The method can easily be coupled with zebrafish lines harboring genetic mutations, or those in which transgenic approaches for manipulating precise neural circuits are used. The assay can also be used in other fish models. Together, the described protocol should facilitate the adoption of this simple assay to other laboratories.

This manuscript describes a simple method to measure stress behaviorally in adult zebrafish. The approach takes advantage of the innate tendency that zebrafish prefer the bottom half of a tank when in a stressful state. We also describe methods for coupling the assay with pharmacology.

Abordagens comportamentais para estudar estresse inato em zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

Comportamento

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizados análises comportamentais de alto rendimento em larvas do peixe

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neurociência

Optimized Intravenous Injection in Adult Zebrafish

Intravenous (IV) injection is widely recognized as the most effective and commonly utilized method for achieving systemic delivery of substances in mammalian research models. However, its application in adult zebrafish for drug delivery, stem cell transplantation, and regenerative and cancer studies has been limited due to the challenges posed by their small body size and intricate blood vessels. To overcome these limitations, alternative injection techniques such as intracardiac and retro-orbital (RO) injection have been explored in the past for stem cell transplantation in adult zebrafish. However, these techniques have their drawbacks, including the need for meticulous injection techniques or increased risk of mortality.
In this study, we have developed a refined and optimized IV injection procedure specifically tailored to adult zebrafish, addressing the challenges associated with their unique anatomy. To demonstrate the effectiveness of this technique, we performed successful IV injections of whole kidney marrow cells from Tg(mpo: EGFP) fish and FITC-dextran dye into adult Casper fish. The subsequent visualization of injected cells and dyes using a fluorescence microscope confirmed their successful delivery and engraftment within the zebrafish. Furthermore, we demonstrated that compared with the intracardiac and RO injections, the IV injection resulted in improved survival rates and engraftment efficiency in treated zebrafish. This approach enables precise delivery and localization of substances and holds great potential for large-scale drug and chemical screening using adult zebrafish. Additionally, the ability to visually track the injected cells and dyes provides invaluable insights into their engraftment, migration, and interactions with host tissues, enabling a more comprehensive evaluation of therapeutic effects and biological processes in zebrafish models.

Here, we present an optimized and effective protocol for the intravenous injection of cells or pharmacological agents into adult zebrafish, resulting in enhanced cell engraftment and increased survival rates of the treated zebrafish.

Injeção intravenosa otimizada em peixe-zebra adulto

Intravenous (IV) injection is widely recognized as the most effective and commonly utilized method for achieving systemic delivery of substances in ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish Adulto

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Biologia

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Medicina

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and pharmacological similarities to that of the mammals. GI intolerance during clinical testing of drug candidates is common and may pose a serious threat to human health. Testing for GI toxicity in preclinical mammalian models can be expensive in terms of time, test compound, and labor. The high-throughput method presented here may be used to predict GI safety issues. Compared to mammalian models, this method allows for more expedient assessment of test compound effects on GI transit while using low quantities of compound. In this method, larval zebrafish (7 days post fertilization) are fed food containing a fluorescent label. After feeding, each larval fish is placed into a well of a 96-conical-bottom-well plate and dosed with test compound (dissolved in water) or the vehicle. As gut transit occurs, fecal matter accumulates on the bottom of the wells, and the rate at which this happens is monitored by measuring fluorescence from the bottom of the well repeatedly over time using a plate spectrophotometer. The fluorescence from larvae in a given treatment group are averaged and these values are graphed along with standard error, for each measurement time, yielding a curve representing average transit of food over time. Effects on gut transit time are identified by comparing the area under the curve for each treatment group to that of the vehicle-treated group. This method detected changes in zebrafish GI transit time induced by drugs with known clinical GI effects; it can be employed to interrogate dozens of treatments for GI effects per day. As such, safer compounds can be quickly prioritized for mammalian testing, which expedites discovery and proffers 3Rs advancement.

The goal of this protocol is to measure the transit time of fluorescently labeled food through the gut of larval zebrafish in a high throughput fashion.

Elevado-throughput medição de tempo de trânsito do intestino usando Zebrafish Larval

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and ...

Injeção intraperitoneal otimizada para entrega de compostos em peixe-zebra adulto

An Intraperitoneal Injection Technique in Adult Zebrafish that Minimizes Body Damage and Associated Mortality

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as cardiomyopathy. Intraperitoneal (IP) injection is an important method that delivers compounds to the body for either testing therapeutic effects or generating disease models such as doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC). Currently, there are two methods of IP injection. Both&#160;methods have limitations when handling toxic compounds such as doxorubicin, which result in side effects manifesting as severe damage to the body shape and fish death. While these shortcomings could be overcome by extensive investigator training, a new IP injection method that has minimal side effects is desirable. Here, a unique IP injection method that is able to handle toxic compounds is reported. Consistently reduced cardiac function can result without incurring significant fish death. The technique can be easily mastered by researchers who have minimal experience with adult zebrafish.

Autor em destaque: Novo método de injeção intraperitoneal para modelos de cardiotoxicidade de peixe-zebra

A new intraperitoneal (IP) injection method in adult zebrafish is described. When handling toxic compounds such as doxorubicin, this procedure is more effective than the two previously reported IP methods. The technique is designed to be easily adopted by researchers with limited experience in the zebrafish model.

Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as ...

Um novo método de Drug Administration para Multiple peixe zebra (

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