Instituto Nacional de Saúde Grant DA024009, DK046367 &amp; T32DA007027.

Todo cuidado com os animais e os procedimentos experimentais foram de acordo e aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use a Virginia Commonwealth University. 1. Preparação de lamelas de vidro estéreis de poli-D-lisina e laminina revestidos em placas de 24 poços <ol><li> Todos os procedimentos para o passo 1 são realizados em condições estéreis, sob um capuz e com reagentes estéreis. Lamínulas de vidro e água deionizada duplo (DDH 2 O) devem ser esterilizados com antecedência. Preparação das placas pode ser feita de até duas semanas antes do isolamento do neurónio. </li><li> Sob o capô, use uma pinça estéril para colocar lamelas de vidro autoclavados em 12 poços de uma placa de 24 poços. </li><li> Prepare estoque poli-D-lisina antes do tempo. Adicionar 50 ml de ddH2O estéril a 5 mg de poli-D-lisina. Vortex e armazenar em 3 ml alíquotas a -20 ° C. Descongele alíquotas antes do uso. </li><li> Para uma concentração final de 1 ml de caldo de poli-D-lisina por cada 25 cm2: pipeta 80 ulEstoque de poli-D-lisina na parte superior de cada lamela de vidro (2 cm 2). Vamos solução para resolver 10 min. </li><li> Remover poli-D-lisina utilizando vácuo e lave com lamelas 3x estéril DDH 2 O. </li><li> Permitir que as placas para secar por pelo menos 2 horas sob o capô. </li><li> As placas podem ser armazenadas a 4 ° C ou - 20 ° C antes de se proceder ao revestimento da laminina. </li><li> Prepare estoque laminina antes do tempo. Descongele laminina no gelo e manter em gelo durante o uso. Dilui-se a uma concentração de 50 ug / ml; prestar atenção a concentração do lote; cada lote será diferente. Dependendo da concentração muito, cerca de 20 ml de ddH2O serão adicionados a cada frasco de laminina. Alíquotas (5 ml) e armazenar a -80 ° C. Descongelar as aliquotas sobre gelo antes da utilização. </li><li> Lamelas de revestimento com 5 mg / cm 2 laminina, pipeta de 200 mL de estoque laminina em cada lamela. </li><li> Incubar a solução de laminina em lamelas de 1 hora. </li><li> Aspirar solução laminina restante e lave uma vez com lamelasDDH 2 O. Evite superfície de lamelas de raspagem. </li><li> Loja de placas a 4 ° C por até duas semanas. </li></ol> 2. Preparação Prévia do Neuron Isolation Solutions <ol><li> Preparar a solução de Krebs (em mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 25 de NaHCO3, 11 de glucose, e 2,5 CaCl 2). Lugar 13,79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g de NaHCO3 (FW 84.01), 3,96 g de glicose (FW 180,2) e 0,555 g de CaCl2 (FW 111) em 2 L DDH 2 a 0. Frio a 4 ° C. </li><li> Prepara enxaguar meios (F12 com soro de bovino fetal a 10% (FBS) e antibiótico / antimicótico a): A uma garrafa de 500 ml de meio F12, adicionar 50 ml de FBS e 5 ml de Antibiótico / antimicótica líquido 100x (Gibco). </li><li> Prepara entérico meios neurónios (Neurobasal Um media com B-27, 2 mM de L-glutamina, 1% de FBS, 10 ng / ml, Glia Neurotr DerivadoFator ophic (GDNF), e Antibiótico / antimicótica líquido 100x). Para fazer estoque GDNF, adicionar 1 ml ddH2O a 10 mg GDNF e congelar volta em 50 mL alíquotas, armazenar a -80 ° C. Para um frasco para injectáveis ​​de suportes completos 50 neurónios, combinar 47,5 ml por meio Neurobasal, 1 ml de B-27 (50x), 500 ul de FBS, 500 ul mM de L-glutamina (Gibco), 50 ul de banco de GDNF, 200 e 500 ul de Antibiótico / Líquido 100x antimicótico. Meios é feita em pequenos lotes de 50 ml para assegurar a sua frescura de GDNF e para evitar a contaminação de grandes quantidades desta mistura de meios de comunicação celular caros. </li></ol> 3. Colheita Longitudinal Muscle / plexo mioentérico (PMLM) Preparação de Ratos <ol><li> Ética nacionais e institucionais apropriadas devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Adultos ratinhos Swiss Webster com um peso superior a 25 g (em geral, ao longo de 8 semanas de idade) são alojados em grupos de 6, antes das experiências. Os tecidos de dois ratos são usados ​​para o isolamento de neurónios entéricos ileal e glia e três ratinhos são usados ​​paraisolamento das células do cólon. </li><li> Prepare área cirúrgica. Reúna pequenas tesouras cirúrgicas, fórceps angulares, cotonetes, três copos de vidro de 200 ml e um copo de plástico / haste (pincel). Certifique-se de todas as fontes são muito bem lavados e lavados antes de usar para minimizar a contaminação. Esta etapa pode ser realizada um dia antes da experiência. </li><li> Colocar em solução de Krebs gelada e borbulhas com carbogénio (95% de oxigénio, 5% de CO 2) durante pelo menos 30 minutos para estabilizar o pH. </li><li> Ligar vários equipamentos e produtos químicos quentes para estabilizar a temperatura desejada; banho de água de calor (s) a 37 ° C, centrífuga legal para solução de 4 ° C, o lugar de Hank salina balanceada (HBSS) e 0,5% de tripsina em banho-maria (37 ° C ). Mídia neurônios completos e enxaguar mídia deve permanecer refrigerado. </li><li> Coloque 150 ml gelada borbulhava Krebs em três copos de vidro de 200 ml rotulados &#39;sujo&#39;, &#39;limpo&#39; e &#39;PMLM. Bolha copo rotulado &#39;PMLM&#39; com carbogen. </li><li> Após a aprovação do Comitê de Ética, euthanize mouse por deslocamento cervical ou asfixia CO 2. </li><li> Coloque o rato em decúbito dorsal sobre a superfície, a pele limpa cirúrgico com etanol 70%, e levantar a pele abdominal usando uma pinça. Com uma tesoura, a cavidade abdominal aberta e revelar órgãos digestivos internos. </li><li> Remover o comprimento do tracto gastrointestinal, levantando uma secção do íleo e revelando a sua mesentério. Snip através mesentério com uma tesoura para remover suavemente e desvendar o íleo eo cólon, tendo o cuidado para não puxar mesentério do íleo / cólon. </li><li> Depois de todo o comprimento do intestino é desvendado, remover o íleo, cortando através do intestino distal e proximal do estômago ao ceco Nota:. Este procedimento também pode ser realizada com o tecido do cólon através da remoção do cólon de distal para proximal do ceco para a o ânus. </li><li> Os tecidos podem ser divididos entre cólon proximal e distal, e jejenum e íleo. O restante deste procedimento irá se referir ao isolamento do íleo; tele é o mesmo procedimento para o isolamento de PMLM cólon. Coloque todo o íleo em um recipiente de vidro com gelo frio Krebs marcado &#39;sujo&#39;. </li><li> Criar uma ferramenta para limpar o íleo; contundente uma grande agulha de 20 G com uma pedra de arquivamento e anexá-lo a uma grande seringa (10 ml) contendo gelo frio Krebs. </li><li> Limpar a matéria fecal a partir do íleo pela secção do íleo em três ou mais peças de grandes dimensões. Remover uma secção do íleo do recipiente e colocar a agulha embotada para a extremidade de um pedaço do íleo. </li><li> Suavemente executar Krebs a seção do intestino até que toda a matéria fecal é removido em um recipiente separado. Coloque a secção limpa no recipiente de Krebs marcado &quot;limpa&quot;. Repita até íleo inteiro é limpo. </li><li> Para remover o PMLM, cortar o íleo em segmentos pequenos, cerca de 2-4 cm. Coloque um segmento de íleo numa vareta de vidro ou de plástico; íleo deve caber confortavelmente, mas não ser solto ou tenso (~ 2 mm). Comece a remoção do PMLM removendo delicadamente pedaços de mesentério ainda anexared para o tracto gastrointestinal (GI), utilizando um fórceps. Impedir que o tracto GI de rodar em torno da haste, fixando o tubo suavemente para a haste com o polegar. </li><li> Separa-se a PMLM a partir do músculo circular subjacente; primeiro esfregar suavemente a ponta da pinça segundo a linha inteira onde o mesentério foi ligado, a partir de cima para baixo do segmento, criando uma abertura suavemente no músculo longitudinal. Então provocar suavemente o músculo longitudinal com um cotonete umedecido com Krebs. </li><li> Comece na parte superior da abertura no músculo longitudinal e provocar distância utilizando o mais leve traço horizontal enquanto que a aplicação de pressão muito leve até ao músculo longitudinal só começa a separar a partir do músculo circular; fazer descer toda a faixa ao longo do ponto de fixação do mesentério. </li><li> Em seguida, começa a funcionar suavemente em torno do tubo gastrointestinal; movimento de cima para baixo e de trás como o músculo longitudinal é lentamente separada do músculo circular por todo o caminho volta do tubo. Quando concluído, oPMLM virão naturalmente fora o resto do tubo gastrointestinal. </li><li> Coloque a tira fina resultante do músculo longitudinal no copo marcado &#39;PMLM. Repetir para todos os segmentos. </li><li> Depois de todas as faixas de PMLM foram recolhidas a partir de um mouse, repita o procedimento para todos os outros ratos sendo usados. Lave os copos &#39;sujos&#39; e &#39;limpo&#39; antes de re-uso. </li><li> Lavar o PMLM 3x para remover a contaminação biológica. Preencha três 2 ml tubos Eppendorf com gelo frio Krebs. Coloque as tiras PMLM no primeiro tubo e centrifugação durante 30 segundos a 356 xg numa centrifugadora de refrigeração a 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e mover as tiras PMLM para a próxima Krebs tubo cheio limpo. Repita este procedimento para cada um dos tubos restantes. </li></ol> 4. Digest PMLM <ol><li> Preparar a solução de digestão colocando 13 mg de colagenase de tipo 2 e 3 mg de BSA, em 10 ml de solução de Krebs-borbulhar carbogénio. </li><li> Segmentos lugar do PMLM lavadas em solução de digestão e uso scissores para cortar PMLM em pedaços minúsculos. </li><li> Digest PMLM durante 60 min a 37 ° C em banho-maria com agitador enquanto era feito borbulhar suavemente com carbogénio. </li><li> Após a digestão completa é, recolher as células por centrifugação durante 8 min a 356 xg centrifugadora arrefecida até 4 ° C. </li><li> Deste ponto em diante, todos os procedimentos devem ser feitos em condições estéreis em uma capa de cultura celular! Todos os reagentes e recipientes devem ser esterilizados antes do uso. </li><li> Durante a centrifugação, preparar uma solução de tripsina 0,05% colocando 1 ml de tripsina a 0,25% aquecida e 4 ml de HBSS aquecida num tubo ml de cultura de células estéril 50. </li><li> Após a centrifugação, remover e descartar o sobrenadante. Não use um aspirador, o que provavelmente vai sugar o pellet celular, devido à baixa velocidade de centrifugação. Cuidadosamente remover o pelete de células e colocar em tubo limpo com 5 ml de solução de tripsina a 0,05%. </li><li> Digerir células em solução de tripsina a 0,05%, em banho de água a 37 ° C com agitação durante 7 min. Não exceda 7 min de tratamento de tripsina, total ou neurônios perecerá. </li><li> Neutralizar a tripsina com 10 ml de frio Enxaguada mídia após 7 min de tratamento tripsina. </li><li> Centrifugar as células durante 8 minutos a 356 x g. Remova e descarte de mídia. </li><li> Durante a centrifugação, o equilíbrio de uma secção de malha Nitex esterilizado no topo de um tubo de 15 ml de cultura de células estéril. </li><li> Após a centrifugação, remover e descartar o sobrenadante. Gentilmente mistura de células ressuspender por trituração em 3 ml de mídia neurônios completos. Evitar a formação de bolhas de ar durante este passo e todos os passos futuros em que mistura de células é triturado. Todas as triturações deve ser feito com muito cuidado. Filtrar a solução da célula através de Nitex de malha no tubo de 15 ml de cultura de células limpo. </li><li> Opcional: tubo de cultura de células Cap e coloque no misturador Hula refrigerado (ou qualquer mixer que proporciona rotação), com rolamento suave e inclinação para 30 min. Este passo é opcional, mas recomendada. </li><li> Opcional: Após misturador Hula, adicionar 2 ml a frio Enxaguada media para lavar as células. </li><li> Recolher as células por centrifugação (8 min, 356 x g). Retire e elimine o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 1200 ul de mídia neurônios completos. Triturar as células suavemente usando 1 ml ponteira de plástico. Não gera bolhas de ar. Pipeta lenta e suavemente até que a maioria dos pedaços são quebrados e as células são suspensas em líquido. </li><li> Adicionar 750 ul de meio completo para cada um dos 12 poços contendo uma lamela de vidro pré-revestido e adicionar 100 ul da solução de células trituradas. </li><li> Incubar neurónios em cultura celular incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Alterar metade dos media celulares a cada dois dias. </li><li> Os neurônios estão prontos para registros eletrofisiológicos após 1-2 dias em cultura. </li></ol>

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Os autores declaram que há grandes interesses conflitantes existe.

Animais usados Este protocolo foi otimizado para camundongos Swiss Webster. No entanto, este método é facilmente adaptável a outros mamíferos de pequeno porte, tais como ratos, e outras estirpes de ratinhos. Temos realizado com sucesso isolamentos preliminares com C57 e receptores μ-opióide knock-outs. No entanto, também é possível que outras estirpes de ratinhos pode ser problemática devido às variações morfológicas no tracto GI. Além disso, existem diferenças entre as estirpes conhecidas de ratinho (C57BL / 6 x Balb / c) no circuito neuronal da preparação PMLM 13, a qual pode afectar a mistura resultante de neurónios do isolamento final. Além disso, a idade deve ser tida em consideração quando se utiliza este método, tal como ocorrem perdas neuronais relacionadas com a idade no plexo mientérico que são específicos para os neurónios colinérgicos e sua correspondente da glia, e pode ser observada a partir de 12 meses de idade de 14 anos. Finalmente, ao adaptar este protocolo para outro especies de animais, devem ser tomados cuidados para assegurar que o plexo mientérico sai com o músculo longitudinal em vez de permanecer ligado ao músculo circular. De tecido usado Os neurónios e células da glia podem ser cultivadas tanto do íleo e do cólon usando este protocolo. Isolamentos ileal são mais fáceis de executar, devido a uma maior quantidade de tecido disponível e a facilidade com que o músculo longitudinal separa do músculo circular de espessura. Um mínimo de dois animais são necessários para ocupar de 12 poços da placa de 24 poços, para aplicações tais como electrofisiologia ou imunocitoquímica. O isolamento do material do cólon é muito mais problemático. O músculo longitudinal do cólon espessura é mais difícil de separar do músculo circular. Além disso, o músculo circular subjacente é mais fina no cólon, tornando-o mais susceptível às lágrimas. Além disso, os dois pontos é significativamente mais curto do que o íleo para três animais, no mínimo, são necessários para ocupar 12 wells de uma placa de 24 poços. Tanto o íleo e do cólon podem ser colhidas e semeadas separadamente a partir do mesmo animal, mas os animais adicionais ou o uso de menos área de plaqueamento de células será necessária para o isolamento do cólon. Duração de Cultura de Células Gravações electrofisiológicos são optimamente realizadas em isolado neurónios entéricos / gliais depois de 2 a 6 dias em cultura, as células nesta altura, são condições ideais arredondadas e flexível para fazer um selo de célula inteira. Após uma semana de cultura de células tornam-se mais lisa e mais visualmente diferenciado como as células aderem à placa. Ensaios imunocitoquímicos são melhor feito quando as células estão mais firmemente ligado à placa, em torno do dia 10, para evitar a perda de células durante vários passos de lavagem. Células entéricas do mouse foram mantidas em cultura por até três semanas. Os padrões de expressão do receptor e do neurotransmissor ao longo do tempo ainda devem ser estudados nestas culturas. No entanto, estudos anteriores sobre a sobrevivência neuronale bioquímicas / diferenciação morfológica em cobaia de neurónios entéricos isolamentos tradicionais descobriram que os neurónios sobreviveram até 15 dias e manter um elevado grau de propriedades morfológicas e histoquímicas até três semanas 8, o que sugere que os neurónios derivados de outras fontes animais podem fazer a mesma . Rendimento celular O rendimento global a partir de células esta técnica é de 12 cavidades de uma placa de 24 poços a partir de dois ratinhos quando se isola a partir do íleo. Este é um número relativamente baixo de neurónios comparado com o volume de tecido, tal como o plexo mientérico é constituído por menos de 1% do total de parede do intestino. Uma desvantagem deste método é que, para aumentar o número de células obtidas, é necessário aumentar o número de animais utilizados. Quando o número de animais são aumentados, sugere-se que vários membros do laboratório colaborar na primeira etapa do isolamento do PMLM. Isto reduz a quantidade de tempo que as células estão num estado interrompido antes definitivo pculo e isto aumenta a sobrevivência das células. Densidade celular Como escrito, este protocolo utiliza dois animais para se obter um isolamento ileal de confluência de células de baixa densidade (~ 10 - 40% medido após um dia de cultura). Plaqueamento de células de baixa densidade é ideal nesta metodologia para reduzir o risco de contaminação da cultura final. Também é útil quando única célula electrofisiologia é executada. O número de células pode ser aumentada pela utilização de mais animais ou reduzindo a área de revestimento final, mas aumenta o risco de contaminação. Para compensar esse problema quando densidades celulares mais elevadas são necessárias, nem aumentado passos de lavagem ou o aumento do uso de antibióticos é sugerido. Heterogeneidade celular Neurónios adquiridos utilizando estes protocolos são compostos de pelo menos duas populações funcionalmente distintas, como indicado pela caracterização electrofisiológica (Figura 3). No entanto, existem muitos tipos conhecidos<html> de neurônios com padrões de codificação neuroquímicos específicos encontrados na cobaia 15 eo mesmo é provavelmente verdadeiro do mouse. Esta heterogeneidade celular é uma vantagem e desvantagem dessa metodologia. Heterogeneidade celular é benéfica ao realizar estudos funcionais de uma única célula, observando as interações célula-célula ou imunocitoquímica, entre outros. Heterogeneidade celular pode ser particularmente vantajoso quando a estudar interacções neuronais / gliais em cultura (Figura 3). No entanto, a heterogeneidade da célula é um obstáculo para metodologias como imunoblot, em que as alterações na expressão de proteínas, etc, e não pode ser transferida para qualquer tipo de célula ou tipo neurónio. Exame da glia será menos problemática, já que só são mostrados dois subtipos de existir na preparação PMLM: intraganglionic e intramuscular glia entérico 16. Outros tipos de células podem também estar presentes nesta cultura, tais como as células intersticiais de Cajal ou fibroblastos. EP &quot;&gt; Células Galvanização Nesta metodologia, as células são plaqueadas em doze poços. Ocasionalmente, um ou dois desses poços irá desenvolver contaminação do primeiro dia depois do isolamento. Se isso ocorrer, as lâminas a partir das poços contaminados são prontamente descartados e o poço é enxaguado com etanol a 70% para matar a contaminação remanescente. Este protocolo pode ser modificado para a chapa de todas as células isoladas em menos cavidades ou num prato, e como resultado, o risco de contaminação irá aumentar. Novamente, quando se sugere os riscos de aumento de contaminação, medidas adicionais de lavagem ou uso de antibiótico aumentada. O líquido de antibiótico / antimicótico (Gibco) utilizado no protocolo consiste em anfotericina B, estreptomicina e penicilina. Outras combinações de antibióticos ou aumento das concentrações pode ser usada para otimizar a redução da contaminação durante a preparação do enxágüe e completar mídia neurônio. Anexação de Células As células são semeadas emlamelas revestidas com laminina e ácido poli-D-lisina. A laminina é importante na sobrevivência de neurónios entéricos e da glia, e estimula o crescimento de neurites e o desenvolvimento neuronal 17, e, como tal, é considerado essencial para este isolamento. No entanto, os factores de fixação alternativos para a poli-D-lisina, tal como a ornitina ou Matrigel, pode ser processado como desejado. Em conclusão, este isolamento proporciona uma cultura mista de glia de neurónios entéricos e adequadas para uma ampla gama de técnicas de estudo. Esta metodologia é fácil de dominar, barato e eficiente do tempo. É nossa esperança de que este modelo de célula irá contribuir para a compreensão de várias patologias associadas com o ENS.

O sistema nervoso entérico (ENS) é vasta rede de nervos e células da glia, que corre todo o comprimento do tracto gastrointestinal (GI). A ENS funcionalmente controla todos os aspectos da digestão, incluindo o peristaltismo, a absorção / secreção fluida, sensação de estímulos, etc (para revisão ver 1). Contém mais de 500 milhões de neurónios, mais do que o encontrado na medula espinhal, e contém todas as classes neurotransmissor que se encontra no cérebro. Além disso, o ENS é único na medida em que ele pode funcionar por reflexo, sem entrada a partir do sistema nervoso central 2. Compreender do ENS é crucial não apenas para compreender o seu papel fisiológico normal, mas entender seu envolvimento numa variedade de neuropatias, que podem ser congénita (doença de Hirschsprung), adquirida (Chagas), secundário para os estados de doença (gastroparesia diabética), a droga induzida (síndrome do intestino opióides), ou devido a uma lesão (íleo pós-operatório) 1. Além disso, os neurónios entéricos pode ser um reservoir para infecções virais (varicela zóster) 3. Devido às suas semelhanças com o cérebro e os elevados níveis de serotonina no intestino, os medicamentos que visam o tratamento de defeitos do sistema nervoso central, têm frequentemente efeitos secundários indesejáveis ​​sobre o ENS 2. É também de notar que muitas neuropatias tais como a doença de Alzheimer e doença de Parkinson mostra alterações celulares semelhantes nos neurónios entéricos longos antes da sua aparência em neurónios centrais, tornando-o acessível a ENS um modelo para estudar a patogénese destas doenças 4. Portanto, uma compreensão completa do ENS é uma necessidade em compreender os estados de doença e prevenir / prever os efeitos secundários farmacológicos. Os neurónios do ENS terem sido tradicionalmente estudada em cobaias utilizando preparações Wholemount 5-7 ou culturas de neurónios 8. Apesar da facilidade com que os neurônios podem ser estudados neste grande animal, este modelo tem muitas limitações, incluindofalta de linhagens geneticamente modificadas, a falta de reagentes específicos para a espécie, eo alto custo associado com ordenação e abrigando esses assuntos. O desenvolvimento de um modelo de sistema nervoso entérico murino tem a vantagem única de várias knock out sistemas, uma vasta gama de outras metodologias estabelecidas que podem ser usados ​​em conjunção com a técnica de cultura de células, e a capacidade de fornecer uma validação para o modelo de cobaia . O SNE é composta por três plexos que correm o comprimento do tracto gastrointestinal: o exterior do plexo mientérico (entre o músculo longitudinal e circular), que é o principal responsável pelas acções peristálticos do intestino, bem como os plexos submucosa e mucosa, ( encontrado em e dentro da mucosa, respectivamente), que controla em grande parte a absorção de fluido / secreção e a detecção de estímulos 1. Este método começa com o isolamento do músculo / plexo mientérico (PMLM) preparação longitudinal por raspagemfora a camada exterior do músculo do tracto GI. Isto reduz drasticamente a contaminação problemas que surgem quando a camada mucosa está envolvida no isolamento. Como um resultado, este processo é ideal para o estudo de controlo neuronal da motilidade em vez de acções secretoras do ENS. O método aqui apresentado resulta numa cultura mista de neurónios entéricos e glia. Pelo menos dois tipos diferentes de neurónios estão presentes, com base em observações anteriores, electrofisiológicos e imunocitoquímica 9. A presença de células gliais é altamente vantajosa, uma vez que não só são um importante tipo de células a estudar, por direito próprio, mas contribuem para a sobrevivência dos neurónios entéricos 10 e manter a expressão do receptor nativo na superfície de células neuronais 11. Além disso, as deficiências da glia entérico pode levar a doenças gastrointestinais, estados anormais de motilidade, cunhados 12 &#39;neuro-gliopathies&#39;. Portanto, a cultura ENS aqui apresentados resultados em vários tipos de células que estão maduros para a investigação. As vantagens desta metodologia são a facilidade de isolamento, os requisitos de ferramentas de baixo custo, e um curto espaço de tempo para dominar a técnica por pessoal de laboratório experientes. Limitações da metodologia incluem o baixo rendimento das células em geral a partir de volumes elevados de tecido ea exclusão de ENS neurônios de plexi da mucosa e submucosa. Este procedimento será altamente vantajosa para os estudiosos especializados em eletrofisiologia, imuno-histoquímica, PCR de uma única célula, e outras metodologias.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12-545-82</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">P6407- 5 mg</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:171px;">CELLTREAT</td>
			<td style="width:137px;">229124</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Laminin</td>
			<td style="width:171px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">354 232</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:291px;">ddH2O</td>
			<td style="width:171px;"> </td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;">Can prepare in lab </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">15 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">188261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">50 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">227261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP358-212</td>
			<td style="width:79px;">MW 58.44</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP366-500</td>
			<td style="width:79px;">MW 74.55</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaH2PO4 .2H2O</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">S369-3</td>
			<td style="width:79px;">MW137.99</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">MgSO4</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M7506-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 120.4</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S6014-5KG</td>
			<td style="width:79px;">MW 84.01</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">glucose</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">D16-1</td>
			<td style="width:79px;">MW 180.16</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">CaCl22H2O</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">C5080-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 147.02</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">F12 media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">11330</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:137px;">110-001-101HI</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antibiotic/antimycotic 100x liquid</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">15240-062</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Neurobasal A media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">10888</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">25030164</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF)</td>
			<td style="width:171px;">Neuromics</td>
			<td style="width:137px;">PR27022</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">8940</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-812-41</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">23-400-101</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">250 ml Graduated Glass Beaker</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-100-250</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 L Glass Erlenmyer flask</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-500-2000</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Plastic rod (child&#39;s paint brush)</td>
			<td style="width:171px;">Crayola</td>
			<td style="width:137px;">05 3516</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">Carbogen</td>
			<td style="width:171px;">Airgas</td>
			<td style="width:137px;">UN 3156</td>
			<td style="width:79px;">5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">10 ml Leur-lock Syringe</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">309604</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">305167</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Collagenase type 2</td>
			<td style="width:171px;">Worthington</td>
			<td style="width:137px;">LS004174</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:291px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td rowspan="2" style="width:171px;">American Bioanalytical</td>
			<td rowspan="2" style="width:137px;">AB00440</td>
			<td rowspan="2" style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-864-252</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Nitrex Mesh 500 &#181;M</td>
			<td style="width:171px;">Elko Filtering Co</td>
			<td style="width:137px;">100560</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Pipette Set</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">21-377-328</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharpeining Stone</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">NC9681212</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:195px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)</td>
			<td style="width:108px;">Nuaire</td>
			<td style="width:137px;">NU-425-400</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">10 L Shaking Waterbath</td>
			<td style="width:108px;">Edvotek</td>
			<td style="width:137px;">5027</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:283px;">Microcentrifuge 5417R</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">5417R</td>
			<td style="width:195px;">May use a single larger centrifuge with size adapters</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">Allegra 6 Series Centrifuge</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">366816</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">HuluMixer Sample Mixer</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15920D</td>
			<td style="width:195px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator</td>
			<td style="width:108px;">Nuiare</td>
			<td style="width:137px;">NU-4750</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">Analytical Balance Scale</td>
			<td style="width:108px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:137px;">XS104</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse

O sistema nervoso entérico é uma vasta rede de neurónios e células da glia a todo o comprimento do tracto gastrointestinal que funcionalmente controla a motilidade gastrointestinal. Um procedimento para o isolamento e cultura de uma população mista de neurónios e células da glia do plexo mientérico é descrito. As culturas primárias podem ser mantida durante mais de 7 dias, sendo as ligações entre os neurónios em desenvolvimento e glia. A tira de músculo longitudinal com o plexo mientérico é anexa separada do músculo circular subjacente do cólon ou do íleo do rato e submetidos a digestão enzimática. Em condições estéreis, a população de neurónios e células gliais isolado são conservados no interior do sedimento após centrifugação e semeadas em lamelas. Dentro de 24-48 horas, neuritos ocorre e os neurónios podem ser identificados por meio de marcadores pan-neuronais. Depois de dois dias em cultura, os neurônios disparam potenciais de ação isolados, como observado por estudos patch clamp. Além disso, a glia entérico também podem ser identifIED, pela coloração GFAP. A rede de neurônios e células gliais em estreita aposição forma dentro de 5-7 dias. Neurónios entéricos podem ser individualmente e directamente estudada usando métodos tais como a imuno-histoquímica, electrofisiologia, imagiologia de cálcio, e PCR de uma única célula. Além disso, este procedimento pode ser realizado em animais geneticamente modificados. Esta metodologia é simples de executar e barato. Em geral, este protocolo apresenta os componentes do sistema nervoso entérico de uma forma facilmente manipulada de modo a que podemos descobrir melhor a funcionalidade do ENS em estados normais e de doença.

<html> Imediatamente a seguir ao isolamento de células PMLM derivados, neurónios e outros tipos de células não serão prontamente evidentes. Estar, células redondas de fenótipo indistinta pode ser visto, bem como detritos de tecido a partir de fragmentos de tecido digerido e do tecido conjuntivo. Este destroços é de nenhum interesse e será em grande parte removido com a primeira mudança de media em dois dias. Não tente limpar os slides antes disso, como as células viáveis ​​saudáveis ​​serão removidos também. Depois de um dia de cultura, os neurônios começam a mostrar crescimento de neuritos. A identificação específica de neurónios pode ainda ser indistinto neste momento. Desde que as células são aderentes suficiente para transferir para uma câmara experimental, que estará pronto para estudo electrofisiológico após um dia de cultura. No entanto, as células são mais aderentes depois de dois dias de cultura e ideal para estudos da função (electrofisiologia, imagiologia de cálcio) a partir de cerca de 2 - 5 dias. ent &quot;&gt; características morfológicas do neurônio se tornar distinto após cerca de uma semana em cultura (Figura 1). immunocyctochemical características ideais podem ser identificados após cerca de 10 dias, quando os neurônios exibir projeções longas e crescer em um quase&quot; ganglionar &quot;, como forma intercalada com glia ( Figura 2). Esta coloração sugere que pode ser possível estudar as interacções sinápticas destas células utilizando esta metodologia. Após um dia em cultura, os neurónios são reconhecidos pela sua seno that ou não «característica definidora &#39;, o potencial de acção (Figura 3). Electrofisiologicamente, eles podem ser funcionalmente classificadas em pelo menos dois tipos neuronais: neurónios que contêm um pós-hiperpolarização e aumentou relações de corrente / densidade de sódio e potássio e os neurónios que não têm uma pós-hiperpolarização e significativamente menos condutância de sódio e de potássio (Figura 4). AHP n positivos e negativoseurons parecem estar relacionados com AH e S neurônios visto no trabalho de guiné anterior, respectivamente. AHP neurônios positivos (AH neurônios) tem múltiplas projeções longas originários de todo o corpo celular, enquanto os neurônios negativos AHP (S neurônios) tem uma longa projeção que se ramifica muitas vezes. Isto, em conjunto com a codificação imunocitoquímicos na Figura 1, sugere que a população de neurónios é muito heterogénea. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50688/50688fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50688/50688fig1.jpg" /> Figura 1. Caracterização imuno-histoquímica de neurônios entéricos e glia isoladas do músculo longitudinal mouse. Microscopia confocal revelou β-III-tubulina coloração específica neuronal (Abcam, coelho, 1:1.000) no músculo longitudinal toda montagem ileal (A) preparação do mouse. As células isoladas a partir de lpreparações de plexo músculo / mientérico ongitudinal (PMLM) contêm neurónios (B; β-III-tubulina, Abcam, coelho, 1:1000), que coraram positivamente para calbindina (C) (Chemicon, coelho, 1:1000) e calretinina (D) (Swant, coelho, 1:2.000). Células da glia (E) foram visualizados com o marcador específico da glia GFAP (Chemicon, ratinho, 1:500). Os anticorpos foram visualizados via apropriada cabra anticorpo secundário Alexa 488 (verdes, Molecular Probes, 1:1.000) 0. Os núcleos foram visualizados utilizando Hoescht 33342 (azul, CG, 1 ug / ml). Nenhuma coloração foi observada quando o anticorpo primário foi omitido (F). . Modificado e reproduzido a partir de Smith, TH, et al Morphine Diminui entérica excitabilidade do neurônio através da inibição dos canais de sódio PLoS One, doi:... 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50688/50688fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> &lt;./ P&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50688/50688fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50688/50688fig2.jpg" /> Figura 2. Os neurónios e células da glia isoladas a partir do músculo longitudinal do rato crescer em estreita proximidade um do outro. Imagens de microscopia confocal indicam os neurónios (verde, β-III-tubulina, Abcam, coelho, 1:1000) e células da glia (vermelho, GFAP, Chemicon, rato , 1:500) facilmente crescer adjacentes uma à outra e parecem interagir in vitro. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50688/50688fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver figura maior</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50688/50688fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50688/50688fig3.jpg" /> Figura 3. Eletrofisiologia de neurônios entéricos cultivadas e células gliais. No cumodo de fixação rrent, todos os neurônios (A) exibido potenciais de ação sobre injeção de corrente. Glia (B) não têm potenciais de ação, mas não exibir grandes potenciais electrotonic em resposta à injeção de corrente. Protocolos em A &amp; B início com uma injeção de corrente de -0,01 nA e aumentar a 0,09 nA em onze 0,01 nA etapas. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50688/50688fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50688/50688fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50688/50688fig4.jpg" /> Figura 4. Neurônios cultivados a partir do íleo do rato são uma população heterogênea electrofisiologicamente. No modo pinça de corrente, uma injeção de corrente de 0,09 nA em neurônios resulta em potenciais de ação. S neurônios (A), retornar imediatamente ao potencial de repouso da membrana fepois de estimulação. AH-tipo neurónios (B) exibem um afterhyperpolarization (AHP) após estimulação, em que o potencial de repouso da membrana desce abaixo da linha de base, antes de regressar lentamente para o valor inicial. . Modificado e reproduzido a partir de Smith, TH, et al Morphine Diminui entérica excitabilidade do neurônio através da inibição dos canais de sódio PLoS One, doi:.. 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).

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An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Nós demonstramos um protocolo de cultura de células para o estudo directo de componentes neuronais e gliais do sistema nervoso entérico. Um neurônio / glia cultura mista em lamelas é preparado a partir do plexo mioentérico de rato adulto fornecendo a capacidade de examinar neurônio individual e função glia por eletrofisiologia, imuno-histoquímica,<em&gt; Etc</em&gt;.

Um<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

26.7K visualizações.  Virginia Commonwealth University. Nós demonstramos um protocolo de cultura de células para o estudo directo de componentes neuronais e gliais do sistema nervoso entérico. Um neurônio / glia cultura mista em lamelas é preparado a partir do plexo mioentérico de rato adulto fornecendo a capacidade de examinar neurônio individual e função glia por eletrofisiologia, imuno-histoquímica, Etc.

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Neurociência

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Uma preparação semi-intactas isolada do Rato Vestibular epitélio sensorial de Eletrofisiologia e de alta resolução Microscopia de dois fótons

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Um<em&gt; In Vitro</emPreparação Muscle-nervo&gt; Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...