Os autores gostariam de agradecer a Lirui Du para a construção do vetor pCAGAdDU e Oliver Gorka para a prestação do protocolo de fixação.

1. A clonagem de um gene de interesse num vector de entrada <ol><li> Clonar o gene de interesse num vector de entrada. A amplificação por PCR do gene seguido por ligação blunt-end num vector de topoisomerase acoplado (por exemplo, pENTR / D-TOPO) ou enzima de restrição mediada clonagem pode ser utilizado para este procedimento. </li></ol> 2. Transferir o gene de interesse para o pCAGAdDu Destino Vector <ol><li> Transferência do gene de interesse a partir do vector de entrada no vector de destino por LR recombinação (por exemplo, mistura de Gateway LR Clonase Enzima II). Isto irá criar o vector de expressão de adenovírus (Figura 1). </li><li> Linearizar 10 ug do vector de expressão de adenovírus numa digestão de restrição PacI, precipitar o ADN e ressuspender em água a uma concentração de 3 ug por 100 ul. A linearização liberta as repetições invertidas virais (ITRs), que são necessários para a replicação e encapsidação do vADN Iral em partículas de vírus. </li></ol> 3. A geração do vírus lisado Primária <ol><li> Semente de 1 x 10 5 células HEK293A em 2 ml de meio de cultura celular (DMEM, 10% FBS, 5% de PenStrep) em um poço de uma placa de 6 poços e incubar as células durante 6-14 horas a 37 ° C num 10% incubadora de CO 2 para permitir que adiram. As células devem ser, em seguida, a cerca de 50% de confluência. </li><li> A lipofecção: Transferência 6 ul de reagente jetPEI em 94 ul de 50 mM de NaCl, de forma breve vórtice. Adicionar a solução da mistura de 100 ul vector de adenovírus linearizado enquanto vórtex e incubar essa mistura de transfecção durante 15 - 30 min à temperatura ambiente. </li></ol> Executar todas as etapas nas condições de biossegurança adequadas para infecção adenovírus! <ol start="3"><li> Dispensar a solução gota a gota sobre a célula contendo HEK293A bem e incubar as células a 37 ° C e 10% de CO 2. Quando se utiliza um marcador de fluorescência, avaliar a transfeeficiência cção visualmente após 12-36 horas usando um microscópio de fluorescência invertido. Adicionar 0,5 ml de meio fresco a cada 3 dias. </li><li> Verifique a cada 2 - 3 dias com um microscópio de luz ou de fluorescência para efeitos citopáticos (CPE), que são áreas com células ampliadas e arredondadas que começam a destacar. Isto é indicativo de geração de vírus eficiente. Após a ocorrência de zonas mais amplas de CPE (Figura 3), vai demorar 24-72 horas antes de todas as células são infectadas. </li><li> Quando todas as células apresentam sinais de CPE, mas antes de uma separação total das células ocorre, separar as células por pipetagem suave e transferência de células com o sobrenadante (SN, 3-5 mL) para um tubo de poliestireno de 15 ml. </li><li> Congelar as células no SN em gelo seco durante 15 - 20 min e descongelar-los rapidamente a 37 ° C depois da ruptura das células. Repetir este-e-ciclo congelação-descongelação (F / CT) mais duas vezes. Manter o lisado de vírus primário em gelo para o uso dentro de um dia ou de congelar a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Qualquer F adicional/ TC irá reduzir o título de vírus por 30 - 50%. </li></ol> 4. Amplification vírus <ol><li> Sementes e crescer as células HEK293A a 90% de confluência num prato de 14 cm de tecido de cultura. </li><li> Infectar as células com metade do lisado de vírus principal (1.5 - 2,5 ml) e incubar as células durante pelo menos 36 horas. Quase todas as células infectadas devem ser, em seguida, o que pode ser determinado por microscopia de fluorescência. Para a re-amplificação de um stock de virus já amplificado (ou seja, mais concentrado), infectar HEK293A a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 50 (ver 6.3). </li><li> As células devem ser colhidas quando todos eles mostram CPE, mas antes de desapego. Com a produção de vírus eficiente este estado é alcançado dentro de 48 horas após a infecção. (Se demorar até uma semana, considerar uma outra rodada de amplificação, aumentando a quantidade de estoque adenovírus usado para a infecção descrito no ponto 4.2.) </li><li> Retire as células por pipetagem suave e células de transferência e SN para um tubo de poliestireno de 50 ml. Girar células para baixo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o SN e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de meio ou SN (ca. 1 mL). </li><li> Realizar 3 F / CT perturbar as células e centrifugar a 800 xg durante 15 min a 4 ° C. Retire a SN que contém as partículas virais (isto é, o lisado de vírus concentrado), e do lisado de vírus aliquota para armazená-lo a -80 ° C. </li></ol> 5. Vírus Titer Determinação <ol><li> Semente 10 5 células A549 por cavidade em cinco poços de uma placa de 12 poços em 1 ml de meio e deixar as células aderir durante 6 horas. </li><li> Use 1 ul de adenovírus concentrado (descongeladas em gelo) para realizar uma diluição em série em meio (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) e adicionam-se 10 ul por poço. Deixar um poço não infectado para ajustar o gating em citometria de fluxo. </li><li> Após 36 horas, retire a SN, lave com células PBS e detach (por exemplo, por tripsinização). Para precauções de risco biológico, é recomendado para corrigir cells em 100 uL de paraformaldeído 4% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente e lavagem com PBS uma vez. </li><li> Faça uma análise FACS de expressão do marcador da infecção. Plot &#39;ul de lisado viral aplicado »contra o número absoluto de células infectadas (Figura 4). Determinar o intervalo linear da infecção e calcular o título de vírus por ml não diluído a partir da curva padrão no intervalo linear utilizando x = 1.000 ul. </li></ol> 6. Infecção celular T <ol><li> Isolar células T CD4 naive / descanso de DO11.10 tg; camundongos tg CARΔ1 usando MACS (Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II) ou FACS classificação (CD4 + CD25-CD62L-CD44 +). </li><li> Para as experiências de pequena escala, pipetar um volume adequado de lisado viral para obter um MOI de 50 para um poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo. </li><li> Adicionar até 4 x 10 5 células T num volume final de infecção de 50 ul, em meio de células T (RPMI 1640, 10% de FBS, 5% de PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essencialvitamina, 1x L-glutamina, 1:250.000 mercaptoetanol, HEPES 10 mM). Exemplo: Uma MOI de 50 será utilizado para infectar 3 x 10 5 células T; o título viral é de 3 x 10 9 mL1 Vírus de volume = MOI x número de células T / título viral = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml </li></ol> Nota: para a infecção do número de células maiores, ampliar usando um MOI de 50 em um volume de infecção de 165 mL por 10 6 células T virgens em um tubo de poliestireno com o copo solta (até tp 3 ml por tubo). <ol start="4"><li> Incubar as células durante 90 min a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Gire as células a 300 xg por 5 min à temperatura ambiente, tire SN, ressuspender em 200 mL PBS. Centrifugar novamente e tirar SN. </li></ol> (Opcional: as células podem ser lavadas outra vez para remover o vírus de forma mais eficiente) <ol start="6"><li> Ressuspender as célulasem 200 ul de meio de células T sem os anticorpos estimulantes e sem IL-2 ou outras citocinas e descanse por 40 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora para permitir a expressão do gene de interesse antes da activação. </li></ol> 7. Ativação de células T e Polarização <ol><li> Pipetar um volume de anti-CD3 e anti-CD28 contas acoplados que é igual ao número de células (por exemplo, 4 x 10 5) em um copo pequeno de reagente, adicionar o volume 10 vezes maior de PBS e colocá-los em um ímã para 2 min . Retire o sobrenadante e ressuspender as esferas em 200 ul de meio de polarização (Tregs: meio de células T + 1 ng / ml de TGF-p, com 100 U / ml de IL-2). </li></ol> Nota: As células também pode ser activado usando pratos de cultura de tecidos revestidas com anticorpos anti-CD28 e anti-CD3, ou de uma forma específica do receptor de células T usando DO11.10 irradiados BALB / c esplenócitos pulsadas com o péptido de ovalbumina 323-339 antigénio. <ol start="2"><li> Centrifuge descansou a células de antes, tirar o SN e Ressuspender as células em 200 mL meio de polarização contendo anti-CD3 e anti-CD28-anticorpo acoplado contas. Incubar durante 72 horas a 37 ° C numa incubadora de 5% de CO 2, sem alterar médio. </li></ol> 8. T fixação das células e coloração para Citometria de Fluxo <ol><li> Lave as células: Gire as células a 300 xg por 5 min à temperatura ambiente, tire SN, ressuspender em 200 mL PBS. Centrifugar novamente e tirar SN. Executar todas as etapas de lavagem em conformidade. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul de solução de coloração de células fixável mortos e incubar durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as células, ressuspender em 100 ul de PBS, adicionar 100 uL de paraformaldeído 4% em PBS, incubar 15 min a RT. </li><li> Lavar as células, ressuspender em 200 ul deles gelada metanol a 70% em PBS, e incubar durante 30 min em gelo. </li></ol> Nota: As células podem ser tratadas a partir de agora, sem precauções de risco biológico!<ol start="5"><li> Preparar 60 ul mestre de mistura de 60 ul de PBS + 10 ug / ml de Fc-bloco (anti-FCR3 para bloquear a ligação inespecífica). Lavar as células, ressuspender-los em 40 ul de PBS + anti-FCR3 e incubar 15 min a RT. </li><li> Adicionar 20 ul de PBS + anti-FCR3 contendo 1 ug de PE-anti-anticorpo acoplado Foxp3, misturar bem e incubar a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lave as células duas vezes em PBS e analisar as células de um citómetro de fluxo. </li></ol>

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Os autores declaram que não há conflito de interesse.

Geração de vírus e Titulação Para obter resultados de transfecção ideais, a qualidade ea quantidade de linear vetor aparecem mais importante. Não foram observados efeitos negativos sobre a produção primária a partir de um lisado supercrescimento inicial da cultura, desde a infecção prosseguir rapidamente uma vez que a produção de vírus eficiente ocorre. No entanto, a produção de vírus por células HEK293A pode ser afectada por inserções longas que reduzem a eficiência. Alg...

Tregs são cruciais para manter a tolerância imunológica e diminuir as respostas imunes overshooting. Tregs suprimem a ativação de células T espectador. Por conseguinte, a ablação de Tregs conduz à autoimunidade fatal e auto-destruição dirigida por células T activadas 1. Tregs desenvolvem-se no timo durante a selecção negativa de células T CD4-positivos precursores única, mas também podem diferenciar na periferia das células T CD4 + naive com a estimulação de antigénio de baixa dose com 1,2 subóptima de co-estimulação. Tímico Tregs parecem suprimir a auto-imunidade de tecidos, contra auto-antigénios, enquanto periférica Tregs têm sido implicadas no fornecimento de tolerância no intestino ou do pulmão. Estes induzida Tregs potencialmente prevenir a ativação de células T após o reconhecimento de antígenos estranhos na mucosa, incluindo antígenos ambientais dos alimentos e do ar, bactérias comensais, e alérgenos 3,4. Além disso, as Tregs são cruciais para estabelecer a tolerância aos péptidos materna e fetal 5 préventilação doença do enxerto-versus-hospedeiro 6. Ao mesmo tempo, também Tregs mediar efeitos indesejados por meio da atenuação de vigilância imunitária de células tumorais 7,8. O recurso marca de Tregs é a expressão do subconjunto-especificar o fator de transcrição Foxp3, um fator de transcrição contendo domínio fork-cabeça que é necessário e suficiente para conferir função Treg 9,10. Algumas vias de sinalização que podem induzir a expressão de Foxp3 é conhecido. No entanto, os processos moleculares que controlam, regulam, modulam ou Treg diferenciação em resposta ao receptor de células T desencadeamento forem menos bem compreendidas. Tregs pode muito eficazmente ser induzida in vitro através da estimulação das células T CD4 + naive com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 na presença de TGF-p e IL-2 11. Como o Tregs emergentes são funcionais in vivo, a manipulação de moléculas que promovem a diferenciação de Treg tem um enorme potencial para futuro therapies, por exemplo, o tratamento de asma, doença de Crohn, e transplante de 11,12. Por outro lado, a modulação terapêutica de moléculas para bloquear a diferenciação Treg podem proporcionar benefícios em futuras abordagens de tratamento combinado dos pacientes com tumor. Em ensaios de diferenciação in vitro têm sido fundamentais para a descrição de alterações moleculares que estão associados com a diferenciação subconjunto de células T. No momento, as tentativas experimentais para pesquisa ou na tela para produtos de genes que controlam a diferenciação de células T são dificultados pelo facto de que os métodos mais comuns de expressão do gene ectópico falhar em células T naive. Por exemplo, a transdução retroviral, electroporação e só são eficazes em células T activadas. Em contraste com as expectativas iniciais, transdução lentiviral, que é tipicamente eficaz em células em repouso, requer pre-activação de células T naive por citocinas 13. Além disso, a transferência de cDNA ou mRNA durante electroporaçãoenvolve a despolarização da membrana plasmática, que se confere características de activação das células T e pode mesmo mobilização de Ca2 + sinalização e ativar proteínas NFAT (observação e ref inédito. 14). Da mesma forma, para a transdução retroviral, as células T virgens tem que ser ativado para 18 - 40 hr. Durante este tempo, a ruptura da membrana nuclear durante a divisão celular ocorrer e permite a subsequente integração do genoma do vector retroviral 15. Estes métodos não são, portanto, capazes de dirigir a regulação molecular inicial do encontro de células T inicial com o antigénio, que é a etapa determinante de diferenciação da célula T helper. Transdução adenoviral é conhecido para conferir a expressão do gene ectópico transitória em um número de tipos de células humanas que expressam o receptor para o adenovírus humano de Coxsackie (CAR). Procede sem necessidade de activação celular ou na progressão do ciclo celular. A expressão de superfície de CRA é essencial para a ligação e internalização do vírus eficiente, e a expressão transgénica da versão truncada CARΔ1 sob um promotor específico de células-T foi encontrada para processar timócitos de ratinho e as células T sensíveis a infecção adenoviral 16. Mais importante, o transgene não se alterar o desenvolvimento de timócitos ou a diferenciação in vitro de células T CD4 + naive em subconjuntos diferentes (dados não mostrados; Ref. 17.). Adenovírus mediada transdução de células T foi usado anteriormente para superexpressão 17,18 e knock-down abordagens 19,20. As células T transgénicas podem ser purificados a partir comercialmente disponível DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. e ref 17.). Importante, a transdução adenoviral permite uma elevada expressão de um gene de interesse em células T virgens sem induzir sinais óbvios de activação. As células T permanecer ingênuo (CD44 baixo, CD62L high) e de repouso (CD25 -, CD69 -) após infectiem e podem ser activadas e diferenciadas em Treg semelhante a células não infectadas. Produção de adenovírus recombinantes pode ser conseguida após a transfecção de células com plasmídeos HEK293A adenovirais (Figura 1). Estes plasmídeos contêm, tipicamente, o adenovírus tipo 5 do genoma humano com os genes E1 e E3 eliminados para processar os adenovírus recombinantes de replicação incompetente 21. Células HEK293A complementar a deficiência de replicação como eles foram imortalizados através da integração estável de adenovírus cortado 22. Como vectores adenovirais são grandes (~ 40 kb) e, consequentemente, não é adequado para a clonagem da enzima de restrição mediada tradicional, utilizou-se o sistema Gateway. O gene de interesse é, inicialmente, clonado num vector de entrada mais pequena, a partir da qual ele pode ser facilmente transferido para o vector adenoviral de destino por via da reacção de recombinação lambda (LR) 23. Construímos o pCAGAdDu vectorcombinando o promotor CAG (promotor de actina de galinha e intensificador de CMV), com uma cassete de expressão contendo LR locais flanqueando o marcador procariota selecção ccdB 24. Esta cassete de expressão está fundido com um local de entrada interno do ribossoma (IRES), elemento que permite a co-expressão do marcador de infecção melhorada proteína fluorescente verde eucariota (eGFP), que está fundido com uma sequência que contém a hormona de crescimento bovina poli (A) do sinal. Escolhemos as sequências de cis-reguladoras CAG, uma vez que o promotor de CMV prototípico foi encontrado para ser altamente dependente da activação e, portanto, desfavorável para a expressão de genes em células T naive. Aqui, nós fornecemos um protocolo eficiente para a diferenciação Treg vitro e um método para a transdução de células T CD4 naive sem activação (Figura 2). O método permite a expressão gênica ectópica ou derrubar CD4 anteriores diferenciação de células T no estado ingênuo. Ele permite testar o efeito de uma overexpressed gene de interesse durante os eventos de sinalização início após a estimulação inicial até TCR compromisso subconjunto de células T. Nossos experimentos de validação também fornecem a base para estabelecer a aplicação adenovírus semelhante na diferenciação de outros subgrupos de células T, como Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, ou células TFH.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

As células T reguladoras (Tregs) são essenciais para proporcionar a auto-tolerância imunológica, bem como para certos antigénios estranhos. Tregs podem ser gerados a partir de células T CD4 + naive in vitro com TCR-e co-estimulação na presença de TGF-p e IL-2. Isso tem um enorme potencial para futuras terapias, no entanto, as moléculas e vias de sinalização que a diferenciação de controle são em grande parte desconhecidos. As células T primárias podem ser manipulados através da expressão ectópica de genes, mas os métodos comuns não conseguem atingir a mais importante do estado ingénuo da célula T antes do reconhecimento do antigénio primário. Aqui, nós fornecemos um protocolo para expressar genes ectópicas nas células T CD4 ingênuas in vitro antes de induzir a diferenciação Treg. Aplica-se a transdução com o adenovírus deficiente em replicação e explica a sua geração e produção. O adenovirus pode demorar até inserções grandes (até 7 kb), e podem ser equipadas com os promotores para alcançar alta e transitória OVEREXPression nas células T. Ele efetivamente transduz células T rato ingênuos se expressar um receptor adenovírus Coxsackie transgênicos (CAR). Importante, após a infecção, as células T permanecem ingénuo (CD44 baixa, alta CD62L) e de repouso (CD25 -, CD69 -), e podem ser activadas e diferenciadas em Tregs semelhante a células não infectadas. Assim, este método permite a manipulação de diferenciação de células T CD4 desde o seu início. Ele garante que a expressão gênica ectópica já está em vigor quando os eventos de sinalização início da estimulação inicial TCR induz alterações celulares que, eventualmente, levar em Treg diferenciação.

A produção de vírus Para a geração de títulos elevados de vírus, o período de colheita de células HEK293A na produção de vírus ou de amplificação de primário de vírus é crucial. Representativos fluorescentes e as imagens de contraste de fase com os sinais visuais de produção de vírus estão apresentados na Figura 3. O CPE, foram observadas 10 dias após a transfecção de células com um HEK293A pCAGAdDu vector de controlo sem inserção. CPE são caracteriz...

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Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T reguladoras<em&gt; In vitro</em&gt;.

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.8K visualizações.  Helmholtz Zentrum München. Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T reguladoras In vitro.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

Preparação de CD4<sup&gt; +</sup&gt; As células T para Análise de GD3 e GD2 gangliï¿½idos Membrane Expressão por microscopia

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...