Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Kathleen Mathers, Dr. Jean-Philippe Mocho e Yolanda Saavedra Dr. Torres para a sua ajuda para a realização eletroporação no utero em procedimentos assépticos, e Wood Hayley por sua ajuda para preparar os desenhos. EP foi apoiado por uma Federação de longo prazo de europeus Sociedades Bioquímicas (FEBS) comunhão e um Medical Research Council (MRC) comunhão de desenvolvimento de carreira, MAH por um Wellcome Trust concessão de Elizabeth Fisher e Victor Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW por um EMBO longo prazo companheirismo e RA por uma bolsa de estudo do MRC. Este trabalho foi suportado por uma concessão do projeto do Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) e por um FG Grant-in-Aid do Medical Research Council (U117570528) para

No Reino Unido, os ratos estão alojados, criados e tratados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Ministério do Interior sob o Animal (Scientific Procedures) Act 1986. 1. Preparação: Solução de DNA e Agulhas <ol><li> Purificar DNA plasmídico com um kit de endotoxinas Maxi preparação livre. Preparar solução de DNA do plasmídeo para injecção para as concentrações desejadas em água e adicionar Fast Green (concentração final de 0,05%) para visualizar injectáveis. A eficiência de electroporação é altamente dependente da concentração de DNA. Uma concentração de 1 ug / uL é geralmente utilizado. Esta concentração é suficiente para visualizar os neurónios eletroporados sem afectar o seu desenvolvimento. No entanto, de acordo com o promotor utilizado no vector de plasmídeo (nível de expressão baixo com o promotor do citomegalovírus / potenciador, o nível de expressão forte com o citomegalovírus imediata potenciador precoce e fusão promotor de galinha β-actina (CAG) promotor), bem como o tamanho ea<html> estabilidade da proteína expressa, esta concentração pode ser ajustada (0,25 ug / uL de 5 ug / uL). </li><li> Puxe agulhas de vidro usando um puxador de micropipeta. </li></ol> 2. Preparação da Cirurgia <ol><li> Autoclavar instrumentos cirúrgicos e tampão fosfato salino (PBS). </li><li> Preparar solução analgésica em PBS (A buprenorfina, concentração, Vetergesic final de 30 ug / ml). Pesar o rato grávida e injectar por via subcutânea de 0,1 mg / kg de Vetergesic pelo menos 30 minutos antes da cirurgia. Durante este tempo, preparar a área cirúrgica. Girar sobre as almofadas de aquecimento ea câmara de recuperação. Coloque PBS estéril em banho de água quente e todos os instrumentos esterilizados e materiais sobre campos estéreis. Coloque os eletrodos de platina em um copo cheio de PBS e se conectar à electroporator. Encher a agulha com a solução de ADN, utilizando uma ponta de microloader, ligar a agulha para o titular capilar e comprimir fora da ponta da agulha com um fórceps. </li></ol>e_title &quot;&gt; Cirurgia 3. Antes da injecção de ADN e electroporação <ol><li> Anestesiar um rato grávida (E14.5-E15.5) com isoflurano em transportadora de oxigênio (oxigênio 2 l / min), utilizando uma câmara de indução anestésica. Aguarde até que o animal perde postura. </li><li> Transfira o animal a um &quot;pré-cirurgia&quot; máscara. Coloque uma gota de gel olho em cada olho para prevenir ulceração da córnea dos olhos, enquanto a mãe está sob anestesia geral. Use um barbeador elétrico para depilar os pêlos do abdômen. Limpe a área raspada uma vez com clorexidina para cabelos voando. </li><li> Transferir o animal a uma segunda máscara na área cirúrgica. Posicione o mouse com a sua volta na almofada de aquecimento. Inicie a cirurgia, quando o reflexo pedal foi perdida. </li><li> Coloque a máscara e luvas estéreis. Cobrir o animal com uma cortina estéril (com um pequeno orifício sobre o abdómen) para impedir que os tecidos e os instrumentos de ser contaminado por as áreas da pele que não foram raspadas e desinfectados. Limpe a área raspada umpelo t 3 vezes com clorexidina. Use um cotonete estéril diferente a cada vez. Use um bisturi para fazer uma incisão vertical ao longo da linha média (~ 1 polegada de comprimento) através da pele. Com uma tesoura, faça uma incisão semelhante do músculo do abdômen ao longo da linha alba (linha branca, composta principalmente de colágeno do tecido conjuntivo). </li><li> Escolha os embriões mais acessíveis e colocar a pinça de anel entre dois embriões e, cuidadosamente, puxar a corrente embrionário para fora da cavidade abdominal. Deste ponto em diante, manter os embriões hidratados com estéril pré-aquecido PBS. </li></ol> N microscópio é necessário para visualização. 4. A injecção de ADN e electroporação <ol><li> Comece com um dos embriões mais laterais, tornando mais fácil manter o controle de que os embriões foram electroporadas. Não puxe muito sobre os embriões, pois isso vai aumentar o risco de hemorragia. Manipular a posição do embrião no interior do saco amniótico, utilizando a pinça de anel eestabilizar a cabeça dos embriões entre os anéis. Aperte delicadamente para empurrar o embrião mais perto da parede uterina. </li><li> Com a outra mão, tomar o titular capilar e inserir a agulha cuidadosamente para o meio do hemisfério para alvejar o ventrículo lateral. Pressionar o pedal para injectar cerca de 1 uL de solução de ADN misturado com Fast Green (menos de 1 uL de estudar dendritos). Você deve observar o corante verde enchimento do ventrículo lateral. Etapas críticas: - A nitidez da agulha é fundamental para furar corretamente na parede uterina. É importante para minimizar o movimento da agulha na superfície da parede uterina e após a inserção no ventrículo, porque um alargamento do furo irá resultar na perda de fluido amniótico e morte do embrião. Evite vasos penetrantes de sangue na parede uterina, pois isso irá resultar em sangramento e morte embrionária. - É importante que não se injectar um volume demasiado grande de DNA para o ventrículo lateral, pois irá induzirhidrocefalia (não ultrapassar 2 ul a E14.5). O volume de DNA é ajustada de acordo com a finalidade da experiência. Se 1μl é geralmente utilizado para a maioria das experiências, um volume menor de DNA (aproximadamente 0,5 uL) é necessária para dendrite e análise coluna vertebral. Na verdade algumas células isoladas precisa ser orientado a fim de visualizar e medir o caramanchão dendrítica de neurônios eletroporados. </li><li> Colocar os eléctrodos nos lados da cabeça de embriões com a pá (+) positivo sobre o mesmo lado que o ventrículo injectado para electroporação córtex ou no lado oposto do ventrículo injectado para electroporação hipocampo (Figura 2). Em seguida, aplique cinco 30V pulsos elétricos (50 ms de duração) em intervalos de 1 seg. Etapa crítica: Evite aplicar corrente através da placenta como isso vai resultar na morte do embrião. Todos os embriões em um mouse de grávida pode ser electroporados, geralmente com o mesmo DNA construir para evitar qualquer confusão. No entanto, uma diminuição da cirurgia longo<html> é a taxa de sobrevivência de embriões. A cavidade abdominal não deve ser aberto mais tempo do que 30 min. </li></ol> 5. Pós-cirurgia eletroporação- <ol><li> Depois electroporating os embriões, adicione PBS na cavidade abdominal e usar a pinça de anel para substituir o corno uterino na sua localização original. Suturar a parede abdominal e da pele com fio de Vicryl suturas absorvíveis. </li><li> Colocar o animal em uma câmara de recuperação até que acorda (min geralmente 5-10) e depois transferir numa gaiola colocado sobre uma almofada de aquecimento. </li></ol> 6. Pós-operatório Verificar o comportamento dos ratos para avaliar dor, sofrimento ou angústia e pesar os animais de 24 he 48 h após a cirurgia. Se necessário, analgésicos pode ser administrada para minimizar a dor e desconforto. 7. Processamento de tecidos Colete os embriões eletroporados ou filhotes nas fases embrionárias ou pós-natal necessários para o experimento. ove_content &quot;&gt; - Para a análise em fases embrionárias (por exemplo, para estudar a proliferação celular ou migração): Euthanize mãe através de deslocamento cervical e coletar os embriões. Após decapitação, seleccionar os cérebros que foram correctamente electroporado, como indicado pela quantidade e localização do sinal fluorescente, visualizado através do crânio utilizando um binóculo fluorescente. Dissecar o cérebro fora do crânio e corrigir durante a noite em PFA 4% e, em seguida, em lugar de sacarose a 20% / PBS durante a noite. Incorporar em outubro composto, congelamento a -80 ° C e secção usando um criostato. - Para a análise em fases pós-natal (por exemplo, para estudar dendritos e as espinhas): Anestesiar os filhotes ou ratinhos adultos com injecção intraperitoneal de pentobarbitona (40-60 mg / kg) e executar a perfusão transcardial com PBS, seguido de PFA a 4% em PBS. Dissecar o cérebro fora do crânio e pós-correção em 4% PFA durante a noite. Após lavagens em PBS, seção do cérebro usando um vibratome (100 seções M para dendrite análise). Montar as seções no Aqua Poli / montagem usando 0.16-0.19 lamínulas mm de espessura para dendritos de imagem e espinhas. 8. Os resultados representativos A Figura 3 mostra exemplos de células eletroporados no córtex cerebral (Figuras 3A, B), na CA1 (Figuras 3C, D) e no giro dentado do hipocampo (Figuras 3E, F). Tipo selvagem ratinhos foram electroporadas em E14.5 com uma construção de GFP (APC-b-EGFPm5 silenciador 3) e os cérebros foram colhidas no dia pós-natal (P) 14. Por injecção de um pequeno volume de solução de ADN (0,5 uL ou menos de uma solução a 1 ug / uL), algumas células são rotulados, o que permite a visualização da arborização dendrítica de isolados GFP + de células (Figura 3), bem como as suas espinhas em maior ampliação (Figura 4). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;forte&gt; Figura 1. Representação esquemática de protocolos de electroporação que podem ser usados ​​para estudar dendritos e as espinhas. (A) A electroporação de uma GFP construir para comparar os dendritos e as espinhas em ratinhos de tipo selvagem e mutante. (B) A electroporação de GFP-shRNA (GFP é expresso a partir do mesmo construto) para comparar os dendritos e as espinhas em ratinhos electroporado com um shRNA específico para construir um gene de interesse (X) ou um shRNA controlo. (C) IUE pode ser usado em conjunto com um sistema indutivel Cre, a fim de restringir a expressão do shRNA para o período de tempo desejáveis. Nesta experiência, um vector que expressa uma forma da recombinase Cre que pode ser activado por 4-hydroxytamoxifen (CAG-ER T2 CREER T2; 1 ug / uL) 10, é electroporado em conjunto com um vector de expressão de uma shRNA específica em um dependente Cre forma (1 ug / uL, e com um indicador de recombinação (CALNL-GFP construto, GFP induzível por expressão de Cre;. 1 ug / uL) 10 A eficiêncy do knockdown pode ser melhorada pelo aumento da concentração do shRNA, bem como aumentar CAG-ER T2 CREER concentração T2. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> Figura 2. Controle espacial da eletroporação. Esta figura mostra onde posicionar os eléctrodos de pás de acordo com o local de injecção de DNA, a fim de atingir o córtex cerebral ou no hipocampo. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> Figura 3. A visualização do mandril dendrítica de células electroporadas no útero, no córtex cerebral e hipocampo. (A, B) secções coronal mostrando GFP + células piramidais no córtex cerebral, (CD) em células piramidais CA1 do hipocampo e (E, F), células granulares no giro dentado em P14. Uma construção de GFP (APC-b-EGFPm5 silenciador 3) foi electroporado em E14.5. Maiores imagens ampliação (B, D, F) mostram que IUE é um método eficiente para visualizar dendrites. Barras de escala representam 50 um (B, D e F), 150 uM (A, C, E). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> Figura 4. Visualização das espinhas dendríticas em neurônios P14 que foram eletroporados in utero em E14.5 com GFP expressar construir. (A, B) imagens de alta ampliação de espinhos de dendritos basais de neurônios piramidais do hipocampo. Barras de escala representam 5 mm (A) e 2 m (B).

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. 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Não há conflitos de interesse declarados.

IUE é uma ferramenta poderosa para manipular a expressão do gene não só no espaço, mas também no tempo. Nós mostramos aqui que esta técnica pode ser utilizada para visualizar e manipular geneticamente dendritos e as espinhas no córtex cerebral e hipocampo de ratos. Além das vantagens citadas anteriormente, é de notar que IUE, em contraste com Golgi método, pode ser combinado com imuno-histoquímica ou hibridação in situ, o que permite por exemplo para o fenótipo das células eletroporados. Também é importante mencionar que este procedimento não induz malformações cerebrais evidentes, apesar da sua invasividade relativa. Além disso, ao nível celular, IUE não modifica as propriedades electrofisiológicas dos neurónios electroporado 13. Enquanto a nossa demonstração centra-se na visualização de morfologias dendríticos e da coluna, IUE de neurónios corticais ou do hipocampo em E14.5 também poderia ser usado para estudar outros eventos de desenvolvimento, tais como a formação de axónio e orientação. Em adicionarition, o mesmo tipo de protocolo pode ser implementado em outras etapas do desenvolvimento embrionário para atingir diferentes populações. Por exemplo, um paradigma electroporação developmentally muito tarde na cortical E18.5 pode ser realizada para dirigir a expressão em células progenitoras astrocíticos 1. De modo semelhante, enquanto que um electroporação do hipocampo em E14.5 permite orientar CA1-CA3 progenitores de neurónios piramidais e progenitoras denteado, ao mesmo tempo, uma electroporação tardia do hipocampo (E18.5 ou pós-natal) permitiria para alvejar grânulo denteado diferente progenitores 14. Neste caso, o volume injectado de DNA pode ser aumentada, bem como a intensidade de corrente. Transgenes introduzidas pelo EIA parecem manter-se epissómico e são, portanto, perde a partir de células seguintes divisões celulares sucessivas. Em células pós-mitóticas tais como neurónios, no entanto, os transgenes epissomais permanecem activas durante meses após a electroporação permitindo estudos de longo prazo 13, 15. Em nosso estudo, observamos GFP brilhante + células até 7 semanas após o nascimento (o último ponto de tempo analisamos), indicando que embrionário direcionamento de corticais ou do hipocampo precursores neuronais utilizando resultados de IUE na expressão persistente do transgene de primeiros pontos no tempo de desenvolvimento até para a vida adulta. Uma limitação de corrente da técnica é que é difícil de exercer um controlo fino sobre o número total de células eletroporados. No entanto, por diminuir o volume injectado de solução de ADN, que têm mostrado que é possível para rotular algumas células e para visualizar o arborização dendrítica de isolados GFP + de células, bem como as suas espinhas. A dimensão da área transfectado pode também ser ajustada através da modificação dos parâmetros da electroporação, tais como a intensidade da corrente e do número de impulsos ou o diâmetro das pás electroporação. Ao todo IUE é um método que é fácil de implementar, rápida eeficiente para estudar dendritos e as espinhas in vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Preparação das agulhas e solução de ADN para a injecção </td></tr><tr><td> Endofree Kit Maxi Plasmid </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Verde rápido </td><td> Sigma </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato capilares de vidro 1,0 milímetros OD x 0,58 mm ID </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader dicas </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> Para pipetas Eppendorf 0,5 ul ul-10/2-20 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td> Material para cirurgia </td></tr><tr><td> Extra Fino tesoura de íris </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinças curvas </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps do anel </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> Suporte de agulha </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pinça Graefe </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura absorvível Vicryl </td><td> Ethicon Inc (Johnson &amp; Johnson) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> Campos estéreis 30cm x 45 cm </td><td> Buster </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> Swabs estéreis </td><td> Shermond </td><td> Huby-340 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Cotonetes </td><td> Limpo Cruz Co., Ltd </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina (Vetergesic) </td><td> Alstoe Saúde Animal </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorexidina </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Viscotears Eye </td><td> Novartis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Abbott Laboratories </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, pentobarbitona de sódio 20% </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Eletroporação </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Tweezertrod Platinume cinco milímetros </td><td> BTX, Harvard Apparatus </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet microinjector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> Pedal para FemtoJet microinjector </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> Titular capilar </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Processamento de tecidos </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas de microscópio </td><td> ThermoScientific (Menzel-Glaser) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Menzel-Glaser </td><td></td><td> 22 x 50 mm # 1,5 </td></tr><tr><td> Do Aqua Poly / mount </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

Na eletroporação útero (IUE) tornou-se uma poderosa técnica para estudar o desenvolvimento de diferentes regiões do sistema nervoso embrionário 1-5. Até à data, esta ferramenta tem sido amplamente utilizada para estudar a regulação da proliferação celular, diferenciação e migração neuronal principalmente no córtex cerebral em desenvolvimento 6-8. Aqui temos detalhe nosso protocolo para electroporate no útero do córtex cerebral eo hipocampo e fornecem evidências de que esta abordagem pode ser utilizada para estudar os dendritos e as espinhas nestas duas regiões cerebrais. Visualização e manipulação de neurônios em culturas primárias têm contribuído para uma melhor compreensão dos processos envolvidos no dendrito, coluna vertebral e desenvolvimento da sinapse. No entanto neurónios crescentes in vitro não são expostos a todas as pistas fisiológicas que podem afectar dendrite e / ou formação de coluna e de manutenção durante o desenvolvimento normal. O nosso conhecimento das estruturas dendríticos e coluna <em&gt; in vivo em ratinhos de tipo selvagem ou mutante vem principalmente a partir de observações utilizando o método de Golgi-Cox 9. No entanto, a coloração de Golgi é considerado ser imprevisível. Na verdade, grupos de células nervosas e tratos de fibras são rotulados de forma aleatória, com áreas específicas, muitas vezes aparecendo completamente coradas enquanto as áreas adjacentes são desprovidas de coloração. Estudos recentes têm mostrado que IUE de construções de fluorescentes representa um método atraente alternativa para estudar dendritos, espinhas, bem como sinapses em ratinhos mutantes / de tipo selvagem 10-11 (Figura 1A). Além disso, em comparação com a geração de orifícios de rato, IUE representa uma abordagem para executar uma rápida perda de ganho e estudos funcionais na população específica de células durante uma janela de tempo específico. Além disso, IUE foi usado com sucesso com a expressão indutível gene ou induzível RNAi se aproxima para refinar o controlo temporal sobre a expressão de um gene ou shRNA 12. Estas vantagens da IUE têm, assim, opened novas dimensões para estudar o efeito da expressão do gene / supressão em dendrites e as espinhas não só em determinadas estruturas cerebrais (Figura 1B), mas também num ponto de tempo específico de desenvolvimento (Figura 1C). Finalmente, IUE fornece uma ferramenta útil para identificar as interações funcionais entre os genes envolvidos no dendrito, coluna e / ou desenvolvimento da sinapse. Com efeito, em contraste com os métodos de outros genes de transferência, tais como vírus, é muito simples para combinar RNAi múltipla ou transgenes na mesma população de células. Em resumo, IUE é um método poderoso que já contribuiu para a caracterização dos mecanismos moleculares subjacentes a função cerebral e doença e deve também ser úteis no estudo da dendritos e as espinhas.

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Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Este artigo descreve em pormenor um protocolo para electroporate no útero do córtex cerebral eo hipocampo em E14.5 em ratinhos. Mostramos também que este é um método valioso para estudar dendritos e espinhas nessas duas regiões cerebrais.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

visualization-genetic-manipulation-dendrites-spines-mouse-cerebral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

17.9K visualizações.  MRC National Institute for Medical Research. Este artigo descreve em pormenor um protocolo para electroporate no útero do córtex cerebral eo hipocampo em E14.5 em ratinhos. Mostramos também que este é um método valioso para estudar dendritos e espinhas nessas duas regiões cerebrais.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Neurociência

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...