In vivo Imagem de cálcio do rato Geniculado Gânglio Respostas ao Sabor Estímulo

Aqui apresentamos como expor o gânglio geniculado de um rato de laboratório vivo, anestesiado e como usar imagens de cálcio para medir as respostas desses conjuntos desses neurônios a estímulos de sabor, permitindo múltiplos ensaios com diferentes estimulantes. Isso permite comparações profundas das quais os neurônios respondem a quais tastantes.

Nos últimos dez anos, os avanços nos indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs) promoveram uma revolução na imagem funcional in vivo. Usando o cálcio como proxy para a atividade neuronal, essas técnicas fornecem uma maneira de monitorar as respostas de células individuais dentro de grandes conjuntos neuronais para uma variedade de estímulos em tempo real. Nós, e outros, aplicamos essas técnicas para visualizar as respostas dos neurônios de gânglios gênicos individuais para provar estímulos aplicados às línguas de camundongos anesthetizados vivos. O gânglio geniculado é composto pelos corpos celulares de neurônios gustativos que inervam a língua e o paladar anteriores, bem como alguns neurônios somatosensoriais que inervam o pinna da orelha. A imagem das respostas evocadas pelo sabor de neurônios de gânglios gênicos individuais com GCaMP forneceu informações importantes sobre os perfis de ajuste desses neurônios em camundongos do tipo selvagem, bem como uma maneira de detectar fenótipos de desocupação de gosto periférico em camundongos geneticamente manipulados. Aqui demonstramos o procedimento cirúrgico para expor o gânglio geniculado, aquisição de imagem de fluorescência GCaMP, etapas iniciais para análise de dados e solução de problemas. Esta técnica pode ser usada com GCaMP codificado transgenicamente, ou com expressão GCaMP mediada por AAV, e pode ser modificada para imagem de subconjuntos genéticos particulares de interesse (ou seja, expressão GCaMP mediada por Cre). No geral, a imagem in vivo de cálcio de neurônios de gânglios geniculados é uma técnica poderosa para monitorar a atividade de neurônios gustativos periféricos e fornece informações complementares para gravações mais tradicionais de chorda tympani de nervo inteiro ou ensaios de comportamento de paladar.

Um componente-chave do sistema de gosto periférico dos mamíferos é o gânglio geniculado. Além de alguns neurônios somatossensoriais que inervam o pinna do ouvido, o geniculado é composto pelos corpos celulares de neurônios gustativos que inervam a língua anterior e o paladar. Semelhante a outros neurônios sensoriais periféricos, os neurônios de gânglios geniculados são pseudo-unipolares com um longo axônio projetando periféricamente para as papilas gustativas, e centralmente para o núcleo do tronco cerebral do trato solitário¹. Esses neurônios são ativados principalmente pela liberação de ATP por células receptoras de paladar que respondem a estímulos de paladar na cavidade oral^2,3. ATP é um neurotransmissor essencial para sinalização de paladar, e receptores P2rx expressos pelos neurônios de gânglio gustativo são necessários para sua ativação⁴. Dado que as células receptoras de sabor expressam receptores de sabor específicos para uma modalidade de sabor particular (doce, amargo, salgado, umami ou azedo), tem sido hipótese que as respostas do neurônio gânglio gustativo a estímulos de sabor também seriam estreitamente ajustadas⁵.

Gravações nervosas inteiras mostraram que tanto o chorda tympani quanto os nervos petrosais superiores maiores conduzem sinais gustativos representando todas as cinco modalidades de gosto ao gânglio geniculado^6,7. No entanto, isso ainda deixou dúvidas sobre a especificidade das respostas neuronais a um determinado tastant: se houver a modalidade de sabor neurônios específicos, neurônios polimodais ou uma mistura de ambos. Registros únicos de fibras dão mais informações sobre a atividade de fibras individuais e suas sensibilidades químicas^8,9,10, mas essa metodologia limita-se à coleta de dados de pequenos números de fibras. Da mesma forma, gravações eletrofisiológicas in vivo de neurônios gânglios gênicos individuais de ratos dão informações sobre as respostas dos neurônios individuais^11,12,13, mas ainda perdem a atividade da população e produzem relativamente poucos registros de neurônios por animal. Para analisar os padrões de resposta dos conjuntos neuronais sem perder de vista a atividade dos neurônios individuais, novas técnicas precisavam ser empregadas.

A imagem de cálcio, especialmente utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificados como o GCaMP, proporcionou esse avanço técnico^{14,15,16,17,18}. GCaMP usa cálcio como proxy para atividade neuronal, aumentando a fluorescência verde à medida que os níveis de cálcio dentro da célula aumentam. Novas formas de GCaMP continuam a ser desenvolvidas para melhorar a relação sinal/ruído, ajustar cinética de ligação e adaptar-se para experimentos especializados¹⁹. O GCaMP fornece resolução de neurônios únicos, ao contrário de todo o registro nervoso, e pode medir simultaneamente respostas de conjuntos de neurônios, ao contrário de uma única fibra ou gravação de célula única. A imagem de cálcio do gânglio geniculado já forneceu informações importantes sobre os perfis de ajuste desses neurônios em camundongos do tipo selvagem^16,20, e identificou fenótipos de pericular de erro de giro em camundongos geneticamente manipulados¹⁸.

Uma grande dificuldade para aplicar técnicas de imagem de cálcio in vivo ao gânglio geniculado é que ele é encapsulado dentro da bula tympanica óssea. Para obter acesso óptico ao geniculado, uma cirurgia delicada é necessária para remover as camadas dos ossos, mantendo o gânglio intacto. Para isso, criamos este guia para ajudar outros pesquisadores a acessar o gânglio geniculado e a imagem que o GCaMP mediava respostas fluorescentes desses neurônios para provar estímulos in vivo.

Os protocolos animais foram revisados e aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas San Antonio.

1. Configuração pré-operatória

NOTA: Observe que a configuração inicial do equipamento não é tratada aqui, pois ela irá variar de acordo com o sistema de bomba, microscópio, câmera e software de imagem usados. Para obter instruções de configuração, consulte os materiais instrucionais fornecidos pelo fornecedor do equipamento. Para os equipamentos utilizados pelos autores, consulte a Tabela de Materiais.

1. Certifique-se de que o líquido flua através de todos os veículos (água) e linhas tastant. Se a linha estiver bloqueada, desconecte e lave com água. Se a linha estiver dobrada, massageie até que o líquido flua. Certifique-se de que o líquido começa e pára na deixa.
2. Uma vez que todas as linhas são confirmadas desbloqueadas, execute o veículo por 10 s e feche todas as válvulas.
3. Certifique-se de que o software de imagem esteja pronto com todas as variáveis necessárias (por exemplo, comprimento de teste, nomes de arquivos, taxa de quadros, etc). Usando o μManager, um pacote de software de aquisição de imagens de código aberto, insira 200 ms no campo rotulado tempo de exposição para um quadro por segundo de 5Hz, selecione x2 sob binninge pressione o botão rotulado Live. Quando o vídeo começar, pressione o botão no lado esquerdo rotulado roi. Isso resultará em um campo de visão 512x512.

2. Anestesiar e imobilizar o animal

NOTA: O protocolo a seguir é um procedimento terminal otimizado para camundongos de ambos os sexos pesando 18-35 g. Recomenda-se para uso com animais entre 10 e 12 semanas de idade. Pode ser usado com animais transgênicos expressando Indicadores de Cálcio Geneticamente Codificados (GECIs), como o Snap25-GCaMP6s, ou animais estereotaxicamente injetados com GECIs virais. Luvas, jaleco e máscara facial devem ser usados para o protocolo.

1. Scruff animal e realizar uma injeção intraperitoneal de Cetamina (100 mg/kg) e Xylazine (10 mg/kg). Avalie a profundidade da anestesia através de beliscão do dedo do dedo do sol antes de continuar.
2. Raspe a parte superior da cabeça amd a área cirúrgica na frente do pescoço.
3. Ligue a almofada de aquecimento e coloque o animal propenso na almofada.
4. Aplique pomada nos olhos do animal para evitar a secagem dos olhos.
5. Faça uma incisão (~1 cm) na linha média da cabeça para expor o crânio do animal. Remova o tecido conjuntivo usando um cotonete estéril para que o osso nu seja acessível. Use um aplicador de ponta de algodão para garantir que o crânio esteja seco.
6. Aplique ligação veterinária no crânio. Certifique-se de cobrir o crânio exposto. Espere a cola secar.
7. Em uma tampa de placa de Petri, misture e aplique uma camada de cimento dental no crânio. A parte traseira do aplicador de ponta de algodão usado na etapa 2.5 funcionará bem para este processo. Coloque o poste em cima do cimento dental e aplique uma segunda camada de cimento dental para sanduíche no poste no lugar do crânio.
8. Deixe descansar até que o cimento dental esteja seco e sólido. Quebre o aplicador de ponta de algodão ao meio e use as pontas pontiagudas para cutucar o cimento dental para testar. Se o cimento dental não ceder a ser cutucado, o animal pode ser transformado em uma posição supina.

3. Traqueotomia

1. Aplique esfoliação pré-cirúrgica na área cirúrgica. Pós-esfregar, faça uma incisão midline ~ 2 cm na pele da garganta do esterno para o queixo.
2. Retraia a pele e as glândulas sub-maxilais, com certeza expõem totalmente os músculos digastricos.
3. Encontre a costura na musculatura paratracheal, separe-a com dissecção sem cortes e retrate-se aberta.
4. Corte cuidadosamente uma abertura na parte superior da traqueia grande o suficiente para caber tubos de polietileno (I.D. 0,86 mm, O.D. 1,27 mm). Não corte mais do que a metade do diâmetro da traqueia. Insira tubos na traqueia em direção aos pulmões.
5. Reposicione os repositores para liberar a musculatura paratracheal e retrair as glândulas submaxilares.
6. Cola musculatura paratracheal junto sobre tubos com uma quantidade mínima de cola veterinária (ver Figura 1A).

4. Quebrar a bulla timpânica

1. Provoque suavemente o músculo digastric desejado (esquerda ou direita) para cima e retire o tecido conjuntivo. Corte na extremidade anterior do músculo, evitando vasos sanguíneos, e puxe para trás posteriormente até se livrar da bíprica.
2. Incline a cabeça para trás ligeiramente para levantar a bíprica. Localize o ramo da artéria carótida anterior ao ponto de inserção posterior do músculo digastric. Sinta-se apenas posterior a este vaso sanguíneo para a estrutura convexa da bímpana.
3. Procure uma costura na musculatura neste local (ver Figura 1B). Usando dois conjuntos de fórceps finos, dissecar sem cortes na costura até que o osso da bípria tympanic seja visível. Use retráteis para manter uma visão clara da bula timpânica.
4. Encontre a costura correndo de anterior para posterior na bula (ver Figura 1C). Usando uma sonda cirúrgica, faça um buraco no osso no centro desta costura. Use um conjunto de tesouras finas para cortar uma área circular no osso, tomando cuidado para não cortar os vasos sanguíneos anterior, posterior e profundo sob a bula.

5. Expondo o geniculado

1. Dentro deste buraco há um pedaço convexo de osso, esta é a cóclea. Anterior à cóclea é um músculo, o tensor tympani (ver Figura 1D). Usando a tesoura de mola, corte o tensor tympani e remova-o.
2. Faça uma pitada de dedo do dedo. Se o animal responder, dê uma mistura de cetamina/xilazina a uma dose de 1/3 para redosagem.
3. Prepare o fluido de irrigação e uma linha de sucção. Usando a sonda cirúrgica, faça um buraco no promontório coclear. Irrigar imediatamente o líquido que flui para fora e removê-lo com sucção. Este líquido fluirá mais ou menos continuamente a partir deste ponto e precisará ser tratado periodicamente.
4. Amplie o buraco na cóclea. Tome cuidado com o vaso sanguíneo que circunda a cóclea até a borda posterior e lateral.
5. Incline a cabeça do rato para a frente. Localize o buraco no osso temporal abaixo do que era a cóclea (ver Figura 1E). Tome nota do cume anterior a este buraco, este cume fica diretamente sobre o sétimo nervo.
6. Insira uma sonda cirúrgica no orifício e levante cuidadosamente o osso temporal para expor o sétimo nervo (ver Figura 1F). Faça um balanço de quanto do sétimo nervo é visível e se o geniculado não estiver totalmente exposto, incline a cabeça do animal para trás e tente puxar o osso do anterior para o nervo.
7. Se o gânglio ainda não é totalmente visível, puxe mais osso por baixo. Tenha muito cuidado para não colocar a sonda bem abaixo do osso, pois isso pode danificar o geniculado.

Figura 1: Exposição cirúrgica do gânglio geniculado. (A) Imagem da cavidade do pescoço do rato pós traqueotomia. A seta está apontando para o músculo digastrico deitado sobre a área cirúrgica explorada no resto da figura. (B) Imagem da região sob o músculo digastric previamente indicado. A seta indica a costura em musculatura para dissecção contundente. (C) Imagem do Tympanic Bulla. A seta indica costura no osso para quebrar com uma sonda cirúrgica. (D) Imagem da área cirúrgica após a abertura da bula. A seta inferior esquerda indica a cóclea, a seta superior aponta para o tensor tympani. Linha encaixotada indica área em (E) e (F). (E) Imagem da área cirúrgica após a fratura da cóclea e o conteúdo removido. A seta branca indica onde colocar a sonda cirúrgica referenciada na etapa 5.6 do protocolo. (F) Uma imagem do gânglio geniculado exposto. Seta indica corpo do sétimo nervo, triângulo tracejado envolve o gânglio geniculado. Painéis A-B, Escala = 5 mm. Painéis C-F, Escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Executar painel tastant

1. Use sucção para remover o líquido do geniculado. Opcionalmente coloque um ponto absorvente para ajudar a mitigar a infiltração e ajudar na navegação de microscópio.
2. Coloque o animal na almofada absorvente sob o microscópio. Localize o gânglio geniculado: marcos úteis incluem o buraco deixado na bula, o buraco no osso temporal e o sétimo nervo. Usando o filtro FITC/GFP no escopo da epifluorescência, verifique se há neurônios de glulato gênicoulatados expressados por GCaMP. Um objetivo de 10x (distância trabalhada 10mm) fornecerá resolução suficiente para acompanhar a atividade de células individuais, mas um objetivo de 20x (distância de trabalho de 12 mm) também pode ser usado.
3. Coloque a agulha dispensando a linha tastant firmemente na boca do animal. Coloque uma placa de Petri abaixo da boca do animal para pegar fluido.
4. Certifique-se de que a câmera está visualizando o campo de visão do microscópio. Sincronizar o início da gravação de vídeo com o início da apresentação tastant.
5. Durante a gravação, assista ao feed ao vivo para respostas, drift e seepage.
6. Se ocorrer a infiltração, sucede o líquido até que a visão do geniculado esteja clara e repita. Se ocorrer deriva, verifique se todas as partes do poste da cabeça estão firmemente apertadas. Se não ocorrermos respostas verifique se o líquido está fluindo e que o microscópio e a câmera estão focados no local adequado sem que nada obscurece o campo de visão.
7. Repita até que o número desejado de vídeos tenha sido obtido. Facilite suavemente os retráteis e repita os passos 3-6 do lado oposto.
8. Após os vídeos desejados terem sido obtidos para todos os gânglios desejados, eutanize o animal através de deslocamento cervical.

Seguindo o protocolo, um animal Snap25-GCaMP6s transgênico foi sedado, gânglios geniculados foram expostos, e tastant foi aplicado na língua enquanto o vídeo era gravado. O objetivo do experimento era definir quais tastantes provocavam respostas de cada célula. Tastants (AceK de 30 mM, 5 mM Quinine, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Ácido Cítrico)¹⁸ foram dissolvidos em água DI e foram aplicados na língua por 2 s separados por 13 s de água DI.

Figura 2: Respostas de neurônios de gânglio geniculado a tastants usando imagens in vivo GCaMP6s. (A) Imagem epifluorescente do gânion geniculado de um rato transgênico Snap25-GCaMP6s durante a linha de base como a água é perfundida sobre a língua. Linhas tracejadas indicam os limites aproximados do gânglio geniculado. O sétimo nervo craniano é rotulado como tal. (B) Instantâneo do mesmo gânglio em (A) como um tastant doce (AceK 30 mM) é aplicado na língua do mouse. Observe que vários neurônios individuais aumentam na intensidade da fluorescência. A caixa de linha tracejada indica célula de resposta doce usada na extremidade(C). (C) Traços de cinco neurônios indicando a amplitude de sua fluorescência mediada GCaMP6s em resposta a um painel de tastants composto por doce (30 mM acessulfame K), amargo (5 mM quinino); salgado (60 mM NaCl); umami (glutamato monopotássio de 50 mM e monofosfato de inosina 1mM); e azedo (ácido cítrico de 50 mM). As barras coloridas mostram a colocação e duração (2 s) do estímulo ao longo do tempo do experimento. Esses dados representativos não incluem uma resposta à umami. Neurônios individuais geralmente respondem a estímulos amargos e azedos (traço inferior) ^16,18,20. Painéis A-B, Escala = 5 mm. Painel C, barra de escala horizontal indica 6,5 segundos, barra de escala vertical indica limiar de 4% dF/F. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como pode ser visto na Figura 2,os estímulos de sabor aplicados na língua devem resultar em um rápido aumento transitório da fluorescência GCaMP, causando uma mudança notável no brilho entre os neurônios que respondem. O vídeo pode ser analisado com uma variedade de pacotes de software para produzir traços exibindo as alterações na fluorescência sobre a linha de base (dF/F) ao longo do tempo de regiões de interesse individuais (como neurônios individuais), mostrando assim as respostas de cada célula ao painel tastant. Em uma cirurgia bem sucedida, em uma linha transgênica Snap25-GCaMP6s, é típico ver respostas em 20-40 neurônios dentro de um único gânglio/campo de visão. Isso pode mudar dependendo da linha transgênica usada ou se o AAV-GCaMP for usado em seu lugar. Observe que a fluorescência da linha de base pode ser afetada por uma série de fatores, incluindo o nível de expressão do GCaMP, e possíveis danos às células durante a cirurgia. Alterações na intensidade da fluorescência acima de um nível limiar (tipicamente df/f > 3 vezes acima do ruído médio)^20,21 é considerada uma resposta positiva.

Para determinar o tempo de entrega de estímulos, o tempo necessário para o líquido fluir através das linhas deve ser medido para saber quando uma mudança de fluido realmente entra em contato com a língua. Para reduzir esse atraso, utilize uma taxa de fluxo moderada (5-10 ml/min) e um curto comprimento de tubulação que leva do coletor de perfusão até a cavidade oral. Normalmente, com os estímulos descritos aqui, a fluorescência começa quase imediatamente após a aplicação do tastant na língua e começará a desaparecer quase imediatamente depois que o tastant é interrompido e a cavidade oral é lavada com solução do veículo. Ao trabalhar com um estímulo desconhecido pode ser útil observar a mudança na fluorescência de uma região sem responder neurônios para comparar as mudanças globais na imagem.

Este trabalho descreve um protocolo passo-a-passo para expor cirurgicamente o gânglio geniculado e registrar visualmente a atividade de seus neurônios com GCaMP6s. Este procedimento é muito semelhante ao descrito anteriormente¹⁷, com algumas exceções notáveis. Primeiro, o uso de um poste na cabeça permite um ajuste fácil do posicionamento da cabeça durante a cirurgia. Em segundo lugar, em relação à entrega de estímulos, a abordagem de Wu e Dvoryanchikov flui estímulos de sabor através da tubulação esofágica¹⁷, enquanto este protocolo fornece líquido diretamente na boca com uma agulha de distribuição. Qualquer método pode ser usado para evocar com sucesso respostas de neurônios de gânglios, estimulando as papilas gustativas fungiformas e palatais.

Uma nota sobre a manutenção de um campo de imagem claro: depois de quebrar a cóclea, haverá infiltração contínua de fluido dentro da cavidade, inclusive diretamente sobre o gânglio geniculado. Também é possível que o sangramento obscureça o gânglio geniculado. Embora uma pequena quantidade de infiltração possa não ser suficiente para evitar imagens, mesmo pequenas quantidades de sangue podem ocluir inteiramente o gânglios. Essas questões podem ser tratadas de algumas maneiras. Primeiro, se a infiltração for relativamente menor, pode ser removida usando uma linha de sucção equipada com uma agulha de distribuição sem corte entre os ensaios. Alternativamente, o líquido também pode ser perverso longe do campo, colocando cuidadosamente pontos absorventes posteriores ou laterais ao sétimo nervo. Se o fluxo for particularmente ruim, pode ser necessário aplicar sucção à cavidade durante a imagem. Uma linha de sucção cuidadosamente colocada pode manter o gânglio limpo enquanto é aplicado em um local lateral, de modo a evitar ocultar os gânglios durante a imagem.

A imagem em si pode ser realizada usando diferentes estilos de configurações de microscópio, cada uma com suas vantagens e limitações de atendimento. Ao usar um escopo de epifluorescência^18,21, só é possível imaginar os neurônios mais superficiais. Outro problema com a imagem de epifluorescência é que os sinais de células mais profundas sairão como mudanças na fluorescência de fundo (fora da luz do foco) por isso tenha cuidado com a análise para não captar alterações de fluorescência de outras células no ROI. Para estruturas particularmente finas, como o gânglio geniculado, essas questões podem não ser problemáticas. O uso de um microscópio 2-fóton¹⁶ ou^{confocal 20} pode potencialmente permitir que células de imagem em camadas mais profundas.

É importante destacar algumas etapas críticas e formas de solucionar problemas comuns. Em primeiro lugar, deve-se notar que a análise vai variar consideravelmente dependendo do software utilizado. O software de código aberto, ImageJ fornece ferramentas suficientes para análise preliminar. Primeiro, remova pequenos artefatos de movimento usando o plugin estabilizador de imagem²², Use o ImageJ para calcular a alteração da fluorescência dividida pela fluorescência da linha de base (dF/F). Isso pode ser realizado usando uma das muitas macros de código aberto para ImageJ²³, a macro referenciada fornece notas de instalação detalhadas. Para outras macros, consulte sua documentação. Depois de corrigir para dF/F, utilize os botões para frente e para trás na parte inferior da pilha de imagens para observar as respostas das células a estímulos. Usando a ferramenta laço da barra de ferramentas, selecione células fluorescentes individualmente. Depois de selecionar um | de uso de células Pilhas | Plot-Z-Axis. Isso fornecerá informações suficientes para determinar perfis de resposta e analisar os eventos relacionados ao tempo de cada região de interesse (ROI). Análise mais avançada foi longo o domínio de scripts personalizados em Matlab, R, etc. No entanto, a popularidade da imagem de cálcio tem levado gradualmente ao desenvolvimento de múltiplos recursos de código aberto para análise, incluindo CaImAn, EZCalcium e mais^24,25.
A imagem de cálcio é uma ferramenta poderosa para examinar a atividade de conjuntos neurais com resolução de neurônios únicos. Devido ao pequeno tamanho do gânglio geniculado, este protocolo é especialmente poderoso porque todo o gânglio pode ser visualizado dentro de um único campo. No entanto, existem algumas limitações para essa técnica. Além das limitações comuns a todos os experimentos de imagem de cálcio, a abordagem cirúrgica descrita aqui é invasiva e deve ser realizada sob anestesia. Este é um procedimento terminal - o animal deve ser eutanizado imediatamente após a imagem. Portanto, essa abordagem cirúrgica não é apropriada para gravações acordadas/comportas.

Nos últimos anos, pesquisadores têm usado essa técnica para estudar perfis de resposta dos neurônios do gânglio geniculado^16,20,18. Trabalhos recentes se concentraram em potenciais marcadores genéticos que poderiam ser usados para manipular subpopulações dentro dos gânglios e mostrou como linhas transgênicas de driver cre e GCaMP dependentes de Cre podem ser usadas para identificar os perfis de resposta dessas populações²⁶. Outros trabalhos podem usar GCaMP com proteínas fotoativadas, como pa-mCherry para primeiro identificar e, em seguida, marcar células ativadas por tastants para então ser usado em imunohistoquímica ou na hibridização in situ²⁷. Também pode ser possível utilizar proteínas fotococo conversíveis dependentes de cálcio, como o CaMPARI, para o mesmo efeito, utilizando métodos experimentais muito semelhantes aos descritos aqui²⁸. Independentemente das perguntas e experimentos específicos, a imagem de cálcio oferece uma poderosa ferramenta para explorar os perfis de resposta dos neurônios envolvidos em qualquer número de atividades, e sua utilidade em explorar o sistema de paladar está apenas começando.

Os autores não têm conflito de interesses para relatar.

Os autores agradecem a S. Humayun pela criação de ratos. O financiamento para este trabalho foi fornecido em parte pelo Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) e nih-SC2-GM130411 para L.J.M.