Preparando um ⁶⁸Ga-rotulado arginina glicina aspartato (RGD)-peptídeo para angiogênese

A_vα β₃ integrina é um tipo de proteína de adesão que é altamente expressa em células endoteliais ativadas submetidos a angiogênese. Assim, avaliar a integridade da integrina é de grande interesse em Oncologia. Aqui, apresentamos um método para preparar radiopeptides Ga-rotulado de ⁶⁸e um método para avaliar sua eficácia biológica.

A_vα β₃ integrina é uma molécula de adesão heterodimérica envolvidos na angiogênese e migração de células do tumor. A integrina é overexpressed em células endoteliais tumor angiogênico, onde normalmente tem uma baixa concentração. Esta expressão específica de α_vβ₃ torna um biomarcador válido para antiangiogênica e drogas de imagem. Como uma modalidade de imagem funcional, tomografia por emissão de pósitrons (PET) fornece informações sobre bioquímicos e fisiológicos muda na vivo, devido a sua alta sensibilidade única na escala nanomolar. Daí, baseada em radiometal radiofármacos de PET recebeu grande atenção para a quantificação não-invasivo de angiogênese do tumor. Este artigo fornece um protocolo sistêmico para preparar um novo peptídeo radiometal-etiquetados para a avaliação da angiogênese. Este protocolo contém informações sobre confiabilidade radioquímica, Lipofilicidade, absorção celular, estabilidade de soro e propriedades farmacocinéticas. A ⁶⁸Ga-RGD-peptídeo é um dos ligantes PET representativas em direção α_vβ₃ integrina. Aqui, apresentamos um protocolo para preparar um ⁶⁸Ga-RGD-peptídeo e a avaliação da sua eficácia biológica.

Angiogênese é um processo biológico que é caracterizado pelo desenvolvimento de novos vasos sanguíneos. Entre muitos fatores angiogenetic, α_vβ₃ integrina está associada a invasividade, porque a integrina é altamente expressa em vasos de tumor angiogênico mas está ausente no tecido normal¹_.

Radiolabeled peptídeos de ligação ao receptor, com domínio de aspartato (RGD) glicina de arginina, que tem uma elevada afinidade para os receptores integrinas α_vβ₃ , são considerados promissores angiogênese agentes^2,3 de imagem ^{, 4 , 5 , 6 , 7}. foram criados vários radiofármacos para PET e suas propriedades biológicas foram validadas em vários modelos animais^8,9,10,11. Em termos de um radionuclídeo, ⁶⁸Ga tem várias vantagens sobre outros radioisótopos. Em primeiro lugar, tem uma elevada acessibilidade para utilizadores e é economicamente vantajoso porque um ciclotron não é necessária. Em segundo lugar, ⁶⁸Ga-baseado os medicamentos radiofarmacêuticos produzem alta resolução espacial comparada com a tomografia por emissão de fóton único computadorizada (SPECT), permitindo a quantificação mais precisa. Por último, o Half-Life 67,71 minutos de ⁶⁸Ga pode ser suficiente para a preparação de pequenos peptídeos ou proteínas.

Para produzir um complexo estável com ⁶⁸Ga, foram desenvolvidos muitos quelantes. Quelantes representativas são o ácido 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic (Roberta), ácido 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-etilenodiaminotetracético (DOTA), ácido 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic ácido (DTPA) e N, N'-di(2-hydroxybenzyl) etilenodiamina-N, N'-ácido diacetic (HBED). NOTA tem sido relatado para formar um complexo altamente estável com ⁶⁸Ga (log estabilidade constante 30.98)^12,13,14.

O objetivo do presente estudo é fornecer um protocolo conciso para o desenvolvimento de um novo radiopeptide (Figura 1). Por exemplo, preparamos ⁶⁸Ga-rotulado RGD-peptídeos e presentes métodos de avaliação biológica destes análogos em um modelo de transplante.

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de pesquisa em protocolos aprovados pelo Instituto de Coreia de radiológica e Comitê de estudos médico Ciências Animal. Todos os reagentes e solventes foram comprados e utilizados sem mais purificação. NOTA-RGD-peptídeos foram preparadas de acordo com a literatura métodos¹⁵.

Cuidado: ⁶⁸Ga emite tanto pósitrons e raios gama. Todos os experimentos, incluindo contacto directo ou indirecto com substâncias radioactivas, devem ser efectuados por treinados e autorizados pelo pessoal. Ao manusear materiais radioativos, devem ser usados equipamento de proteção adequado, blindagem, distintivo do dosímetro de radiação e anéis e um medidor de pesquisa.

1. radioativos RGD-peptídeos com ⁶⁸GaCl₃

Nota: ⁶⁸Ga (t_1/2 = 68 min, β⁺ = 89% e CE = 11%) foi obtido o ⁶⁸Ga / gerador de Ge de⁶⁸.

1. Eluir a ⁶⁸GaCl₃ do gerador com 4 mL de 0,05 M de HCl.
2. Purga com nitrogênio a 80 ° C por 30 min secar ⁶⁸GaCl₃ (333 kBq, 1 mL) em um frasco de reação de 5 mL.
3. Adicionar uma solução de peptídeo-RGD (100 µ g) em 1 M de acetato de sódio (100 µ l, pH 5-6) para o frasco de reação contendo ⁶⁸GaCl₃ da etapa 1.2.
4. Aqueça a mistura de reação a 80 ° C por 5 min. Então, acalme-se até à temperatura.
5. Purifica o produto bruto com a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Use o seguinte sistema: uma coluna de C-18, uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, um declive gradiente de acetonitrilo de 1.17%/min (5% - 40% em 30 min) e componentes de eluição: A = 0,1% ácido trifluoroacético (TFA) em acetonitrila, B = 0,1% TFA na água.
   Nota: O HPLC é equipado com um fotodiodo matriz e um detector de radioatividade. A ⁶⁸Ga-RGD-peptídeo foi coletado em um tempo de retenção de 12,5 min (Figura 2).
6. Purifica o resultante ⁶⁸Ga-RGD-peptide usando um sistema de extração de fase sólida.
   1. Transferir a solução através de um cartucho de fase reversa C18 e lave com 2 mL de solução salina.
   2. Eluir ⁶⁸Ga-RGD-peptídeo com 0,7 mL de etanol a 95%. Remover o solvente a 80 ° C sob gás nitrogênio por 20 min e reconstituir com fosfato salino (PBS) antes do uso.
   3. Filtrar o radiolabeled do produto através de um filtro de 0,22 µm estéril e formular em 1 mL de solução salina estéril.
7. Verificar o rendimento de radioquímica por cromatografia de camada fina rádio (TLC).
   1. Spot 1 µ l sobre uma placa de cromatografia de camada fina instantânea (ITLC, 10 cm de comprimento). Desenvolva a placa em uma câmara contendo o eluente (ácido cítrico em solução aquosa 0,1 M, pH 5,0) até 9 cm de distância do local.
      Nota: O fator de retenção para ⁶⁸Ga-RGD-peptide é 0 e o factor de retenção não tenha reagido ⁶⁸Ga^{3 +} é 1.
8. Calcule a atividade final específica da relação de radioatividade correspondente para a não-radioactividade como nmol/MBq.
   Nota: Após a injeção de 100 µ l de formulado ⁶⁸Ga-RGD-peptide para HPLC, a quantidade de componente não-radioativo foi calculada a partir da curva de calibração padrão usando nonradioactive Ga-RGD-peptídeo.

2. in Vitro absorção celular

Nota: Células de glioblastoma humano Uppsala 87 Glioma maligno (U87MG) foram cultivadas em meios da águia modificados de Dulbecco (DMEM), suplementados com 10% fetal bovino soro e 1% penicilina-estreptomicina. As células foram cultivadas em pratos de 150 mm a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO₂umidificada. As células foram colhidas ou dividir por tripsinização: tripsina 0,25% (p/v) e 0,02% (p/v) ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS a 37 ° C, por 3-5 min.

1. Células de U87MG sementes em placas de 6-poços em uma densidade de 1 x 10⁶ células/poço.
2. Incube as celulas com ⁶⁸Ga-RGD-peptide (111 kBq) a 37 ° C para 30, 60, 90 e 120 min. preparar as amostras em triplicata.
3. Lavar as células 2 x com 2 mL de PBS e colheita por tripsinização. Use tripsina 0,25% (p/v) e 0,02% (p/v) o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS a 37 ° C por 3-5 min.
4. Recolha a suspensão de células (500 µ l) e medida em um contador-γ.
5. Calcule a porcentagem absorção do composto pelas células por % (contagens nas contagens de células/total).

3. in Vitro estabilidade de soro

1. Adicione 500 µ l de soro rato recentemente preparada, 500 µ l de soro humano e 500 µ l de PBS. Incube a mistura a 37 ° C por 2 h.
2. Avaliar por ITLC os intervalos de tempo especificado (30, 60, 90 e 120 min). Manchar a alíquota de 1-2 µ l da mistura para a placa ITLC (fase móvel: ácido cítrico de 0,1 M). Desenvolva a placa como na etapa 1.7.
   Nota: ⁶⁸Ga^{3 +} é esperado para mover-se com a frente do solvente, Considerando que o composto rotulado permanecerá na origem.

4. determinação da Lipofilicidade

1. Adicionar ⁶⁸Ga-RGD-peptide (3,7 MBq, 3,7 µ l) para o sistema de octanol-PBS (1:1, v/v, total 1 mL).
2. Misture os frascos vigorosamente durante 5 min à temperatura ambiente e centrifugar 10.000 x g por 5 min à temperatura ambiente.
3. Tirar 100 µ l amostras de cada camada e medir a radioatividade com um contador de γ. O valor relatado log P baseia-se na média das três amostras.

5. tumor modelo

Nota: Camundongos BALB/c (6-8 semanas velho, fêmea, n = 23) foram utilizados para este estudo. Os ratos foram posteriormente utilizados para estudos de PET (n = 3) e biodistribuição (n = 20) quando os volumes de tumor chegaram a 200-300 mm³ (1-2 semanas após o implante).

1. Carrega pilhas do tumor em 28 G, seringas de insulina 1/2 polegada.
2. Injete células de U87MG (5 x 10⁶) em 100 µ l de PBS para a região do braço esquerdo.
3. Anestesia o mouse com 2% de isoflurano em gás oxigênio durante a injeção de célula.
   1. Certifique-se de que o mouse tem sido anestesiado pela perda do pedal retirada reflexa seguir beliscar com a pinça entre os dedos do pé direito traseiro. Não abandone um animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.

6. quantificação in Vivo de α_vβ₃ integrina usando PET

1. Anestesia os ratos com 2% de isoflurano em oxigênio.
   1. Certifique-se de que o mouse tem sido anestesiado pela perda do pedal retirada reflexa seguir beliscar com a pinça entre os dedos do pé direito traseiro. Não abandone um animal até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
2. Coloque a cabeça no centro do pórtico do PET.
3. Administre por via intravenosa solução Ga-RGD-peptide (MBq 7.4, 200 µ l) a ⁶⁸para o enxerto do mouse modelo através da veia da cauda para 1 min.
4. Ao mesmo tempo, realizar um PET scan no modo de lista (análise dinâmica) para 150 min.
   Nota: Os dados brutos de PET foram reconstruídos por um frame de tempo definido pelo usuário (isto é, cada 30 min). Após a verificação do animal de estimação, uma varredura de microtomografia computadorizada (CT) (50 kVp de raios-x, 0.16 mA) foi conduzido para a correção da atenuação.

7. biodistribuição Ex Vivo

1. Injete a veia da cauda do modelo do rato de xenoenxertos ⁶⁸Ga-RGD-peptide (0.37 MBq, 200 µ l). Anestesia o mouse com 2% de isoflurano em gás oxigênio durante as injeções.
   Nota: Camundongos BALB/c, conforme descrito na seção 5, foram divididos em quatro grupos e sacrificados em pontos de tempo diferente (n = 5 por grupo).
2. Acorda os ratos imediatamente após a administração de ⁶⁸Ga-RGD-peptídeo e sacrificá-los em 30, 60, 90 e 120 min postinjection com a eutanásia de dióxido de carbono.
   Nota: Os tecidos de interesse foram extraídos. Alvos selecionados foram o sangue, músculo, coração, pulmão, fígado, baço, estômago, intestino, rins, ossos e tumor.
3. Pesar o tecido e medir a radioatividade com um contador de γ.
   Nota: Os resultados foram expressos como a percentagem de dose injetada por grama de tecido (% ID/g).

A quelação de ⁶⁸GaCl₃ com o NOTA-RGD-peptide era simples, sendo o rendimento radiolabeling 99%. Impurezas de reação foram removidas com êxito como mostrado na Figura 2. A pureza radioquímica de ⁶⁸Ga-RGD-peptídeo era superior a 99%, sendo atividade específica ao final da síntese 90-130 MBq/nmol (Figura 3).

A absorção de célula valores para ⁶⁸Ga-RGD-peptídeo foram de 1,49%, 0,85%, 0,36% e 0,39% aos 30, 60, 90 e 120 min, respectivamente. Estabilidade de soro mostrou que ⁶⁸Ga-RGD-peptide permaneceu quase intacto após 2 h de incubação com humanos ou soro de rato, bem como a PBS (> 92% estabilidade a 2 h). O coeficiente de partição (log P) foi de 2,96, indicando alta Lipofilicidade. PET mostrou uma absorção elevada inicial nos órgãos principais, incluindo o fígado, rim, coração, músculo e tumor. No entanto, no final do período (90-150 min), a região do tumor foi visualizada claramente. A relação tumor-à-músculo em 90 min foi 17.57 e permaneceu inalterada, indicando estabilidade cinética. A biodistribuição ex vivo mostrou que a radioatividade acumulada no tumor 6.19, 4.96, 4.44 e 4.39 (% ID/g) em 30, 60, 90 e 120 min, respectivamente. Os resultados do experimento ex vivo estavam em conformidade com o no vivo conclusões PET (Figura 4).

Figura 1 : Diagrama de fluxo dos procedimentos experimentais. Esta figura mostra uma visão esquemática do desenvolvimento de radiofarmacêutico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Purificação de ⁶⁸Ga-RGD-peptide por HPLC. Azul é sinal de radioactividade e preto é sinal de ultravioleta (UV). O comprimento de onda UV é 314 nm. O eixo x é o tempo e o eixo y é unidade de absorvância (AU). A ⁶⁸Ga-RGD-peptídeo tem 12,4 min de tempo de retenção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Estrutura de ⁶⁸Ga-RGD-peptídeo e sua pureza radioquímica. O ITLC de ⁶⁸Ga-RGD-peptide mostrou alta pureza radioquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : PET imagem latente (superior) e ex vivo dados de biodistribuição para ⁶⁸ Ga-RGD-peptide (baixa). Dados de animais foram expressos na escala de SUV de 0 a 5. Dados de biodistribuição mostrados são a média ± o desvio-padrão de cinco ratos em cada ponto de tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

No presente estudo, apresentamos um protocolo para preparar um radiopeptide visando α_vβ₃ integrina e sua avaliação biológica. Desenvolvimento de drogas tradicional envolve um procedimento complicado. Requer uma grande quantidade de material de referência e um tempo relativamente longo de avaliação. Embora a metodologia sugerida não pode substituir o processo de avaliação delicado, este sistema pode ser usado para fins de triagem. Esta proposta sistema reduziria consideravelmente o tempo e custo.

Na última década, muitos radiolabeled RGD-peptídeos têm sido muito estudados como radiotracers para tumores¹⁶de imagem. Para obter os medicamentos radiofarmacêuticos promissoras para ensaios clínicos, abordagens sistêmicas para o desenvolvimento de drogas devem ser fornecidas. Viabilidade de radioquímica, alta seletividade-afinidade para o alvo, estabilidade metabólica e farmacocinética adequada são quatro grandes preocupações. Para um estudo de PET de rotina, um rendimento razoável de radioquímica garante a confiabilidade dos radiofármacos. As questões de alta afinidade (> nM) e seletividade (> 100 x) para o destino proteína também sejam preenchidas. Em termos de farmacocinética, o palpador de PET do candidato é rapidamente excretado do tecido não-alvo e tem um tempo de retenção longa no tumor, permitindo uma relação elevada do alvo-de-referência. Os medicamentos radiofarmacêuticos candidato não devem ter metabólitos problemático na vivo que poderia aumentar a ligação não-específica e fornecer imagens de baixo contraste. É importante avaliar as características abrangentes, porque cada termo influencia as outras propriedades, que não são independentes.

O radiopeptide introduzido nesta pesquisa tem propriedades de drogas, como apropriadas. A ⁶⁸Ga-RGD-peptídeo tem um alto rendimento de radioquímica de 99%, estabilidade metabólica e Lipofilicidade adequada. No experimento em vivo , a radiopeptide exibiu alta seletividade (relação de tumor-de-referência = 17.57), e os dados de biodistribuição ex vivo também mostraram absorção significativa do tumor (até 6.19% ID/g).

Os autores não têm nada para divulgar.

Este trabalho foi apoiado por um programa de desenvolvimento da pesquisa nacional Fundação da Coreia (NRF) subvenção financiada pelo governo coreano (n º 2017M2A2A6A02019904) e pesquisa Nuclear.