Nova abordagem para gravação simultânea da atividade do nervo simpático Renal e pressão arterial com infusão intravenosa em consciente, ratos desenfreados.

Ratos anestesiados exibem não-fisiológicos pressão arterial sistêmica, que impede a avaliação significativa do tônus autonômico, dada a íntima relação entre a pressão arterial e o sistema nervoso autônomo. Assim, um método novo para a atividade do nervo simpático renal simultaneamente recorde e a pressão arterial com infusão intravenosa em ratos conscientes é descrito.

Nervos simpáticos renais contribuem significativamente para fenômenos fisiológicos e fisiopatológicos. Avaliar a atividade do nervo simpático renal (RSNA) é de grande interesse em muitas áreas de pesquisa, tais como a doença renal crônica, hipertensão arterial, insuficiência cardíaca, diabetes e obesidade. Avaliação inequívoca do papel do sistema nervoso simpático, portanto, é imperativa para a adequada interpretação dos resultados experimentais e compreensão dos processos da doença. RSNA tem sido tradicionalmente medido em roedores anestesiados, incluindo ratos. No entanto, os ratos geralmente apresentam muito baixa pressão arterial sistêmica e instabilidade hemodinâmica durante várias horas durante anestesia e cirurgia. Interpretação significativa do RSNA é confundida por este estado de não-fisiológicas, dado a relação íntima entre tônus nervoso simpático e o estado cardiovascular. Para resolver essa limitação das abordagens tradicionais, desenvolvemos um novo método para medir a RSNA em ratos conscientes, movimentando-se livremente. Os ratos foram instrumentados cronicamente com radio-sensores para monitoramento contínuo da pressão arterial, bem como um cateter de infusão venosa jugular e eletrodo bipolar personalizados para gravação directa da RSNA. Após um período de recuperação de 48-72 horas, a taxa de sobrevivência foi de 100% e todos os ratos se comportou normalmente. Neste ponto de tempo, RSNA foi gravado com sucesso em 80% dos ratos, com sinais viáveis adquiridos até 4 e 5 dias pós cirurgia em 70% e 50% dos ratos, respectivamente. Fisiológicos de pressão arterial foram registrada em todos os mouses (116±2 mmHg; n = 10). RSNA gravado aumentado com comendo e de aliciamento, tão bem estabelecida na literatura. Além disso, RSNA foi validado pelo bloqueio ganglionar e modulação da pressão arterial com agentes farmacológicos. Neste documento, um método eficaz e gerenciável para gravação clara do RSNA em camundongos conscientes, movimentando-se livremente é descrito.

Interesse em utilizar ratos em diversas áreas de investigação biomédica continua a expandir-se com o desenvolvimento de inúmeros modelos geneticamente modificados. Na maior parte, os avanços técnicos tem acompanhado o aumento do uso de ratos em fisiologia e agora há uma impressionante selecção de dispositivos miniaturizados, desenvolvido especificamente para medir parâmetros fisiológicos importantes em camundongos. Embora direto de dispositivos de telemetria para medição de autonômica Tom nervoso no rato consciente foram disponíveis para mais de uma década, dispositivos miniaturizados para avaliar a atividade do nervo em camundongos conscientes não estão atualmente disponíveis. Os investigadores tipicamente contornar essa limitação, avaliando a contribuição do sistema nervoso autônomo com métodos indirectos (ou seja, plasma ou urina de catecolaminas, bloqueio autonômico farmacológico, análise espectral dos padrões de sangue pressão/pulsação)¹.

Enquanto essas abordagens fornecem informações valiosas, o resultado é uma imagem global do tom geral autonômica, ao invés de revelar a contribuição discreta de populações isoladas dos nervos para o fenômeno sob investigação. Alternativamente, direto da gravação da atividade dos nervos específicos foi executado em ratos anestesiados, que constitui uma infinidade de preocupações. É extremamente difícil de manter estável pressão de sangue dentro da faixa fisiológica em um rato anestesiado por várias horas após a cirurgia. Na verdade, esses tipos de experimentos, pressão arterial é muitas vezes não declarada ou apresentado em níveis extremamente baixos (ou seja, 60-80 mmHg vs > 100mmHg em um rato consciente)². A fragilidade do sistema cardiovascular exibida em preparação um rato anestesiados muitas vezes impede a avaliação significativa da atividade do nervo autonômico, dada a relação de co-dependência entre pressão arterial e tônus simpático^{3, 4}.

Para resolver essa limitação, um novo método para gravação directa da atividade do nervo simpático renal (RSNA) em consciência, ratos desenfreados, imperturbados dentro de suas gaiolas para casa foi desenvolvido. Tanto a abordagem cirúrgica e experimental para o sucesso da implementação dessa técnica é descrita em detalhe. Esta preparação permite que o investigador gravar simultaneamente a pressão arterial através de radiotelemetria além RSNA, com a capacidade adicional de infundir por via intravenosa agentes turísticos sem perturbar o mouse.

Vinte e quatro horas depois da cirurgia, comportar-se normalmente de ratos e não apresentam sinais de dor ou sofrimento. Experimentais gravações então podem começar pós-operatório de 48 a 72 horas, enquanto o mouse repousa confortavelmente em sua gaiola em casa, com acesso irrestrito à comida, água e enriquecimento ambiental. Clara RSNA traços são apresentados e as respostas características desta população de nervo a movimentos físicos normais do animal (tais como comer e grooming) são demonstradas além de modulação farmacológica da pressão arterial sistêmica. A qualidade e a especificidade do sinal RSNA mais é validada pelo bloqueio ganglionar. Este manuscrito inclui o complemento audiovisual para uma descrição inicialmente publicada esta técnica⁵.

Todos os procedimentos experimentais estão em conformidade com os institutos nacionais de guia da saúde para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de uso do centro médico da Universidade de Mississippi e institucional Cuidado Animal.

1. os animais e habitação

1. Ratos de casa (24-35 g) após a chegada na instalação de animais de laboratório institucional.
2. Oferece ratos padrão chow roedor e água ad libitum em todas as fases do protocolo experimental em um ambiente controlado de temperatura e umidade.

2. personalizada fabricação do eletrodo implantável RSNA

Nota: Construa o eletrodo RSNA implantável pelo menos alguns dias antes do procedimento cirúrgico agendado para acomodar a cura e tempo de esterilização (descrito abaixo).

1. Corte três comprimentos iguais de inox isolado múltiplo-stranded fio, 250 mm cada (diâmetro de fio desencapado 0,0254 mm, 0,14 mm revestido). Use uma lâmina de bisturi (de preferência #11) que tira cerca de 15 mm do material de isolamento para expor o metal subjacente de uma extremidade de cada um dos comprimentos de fio.
   1. Solde um conector único pino macho (bronze com chapeamento de ouro) para o exposto pode final de apenas dois dos fios para criar pistas de eletrodo bipolar (figura 1A). Deixe o final do terceiro comprimento do fio desencapado. Isto funcionará como o fio terra.
   2. Deslize um curto-circuito (~2.0 - 2,5 cm) pedaço de tubo de termo-retráctil de diâmetro 1,6 mm sobre o conector de pino e arame para cobrir completamente a articulação recém soldada entre o fio e o pino conector.
      Nota: A ponta do conector de pino que será conectado ao headstage amplificador deve permanecer exposta.
   3. Segure o fio acima de um injetor de calor com um par de alicates pequenos ou hemostatos encolher a tubulação de calor-sensível e isolar electricamente a conexão entre o fio e o conector de pino. Repita para o segundo conector de fio/pino.
2. Corte um comprimento de 200 milímetros de tubos de polietileno (PE 90; diâmetro interno 0,86 mm, diâmetro externo 1,27 mm). Grupo de três fios (duas leva + fio à terra) e introduzir as extremidades intocadas a tubagem PE 90, segmentação-los juntos através de, a extremidade aberta do tubo (figura 1B).
   Nota: O PE 90 tubos funções como uma bainha para agrupar e proteger o eletrodo conduz e fio à terra.
   1. Identificar o fio terra e puxe-o através da bainha do PE 90 um pouco mais para distingui-lo de leva o eletrodo bipolar.

3. construção da ponta do eletrodo

1. Visualize as intocado extremidades dos fios eletrodo com um microscópio de dissecação. Rosqueie as três pontas soltas do eléctrodo através um 5 mm - longo pedaço de pequenos tubos de polietileno (PE 10, diâmetro interno de 0,28 mm, diâmetro externo 0,61 mm) para ligar os fios do eléctrodo juntos.
   1. Passe um pedaço de 1,5 mm deste tubo PE 10 para os fios de três eletrodos. Avança este tubo para descanso 2,0 mm afastada a peça inicial de 5 mm de PE 10.
   2. Passe um segundo pedaço de 1,5 mm de tubo de PE 10 sobre as pontas dos dois fios eletrodo bipolar para cobrir e isolar as pontas e separá-las do fio de terra (Figura 1).
2. Apare qualquer excesso de comprimento dos fios com uma tesoura.
3. Cole as peças individuais do tubo de PE 10 aos fios do eléctrodo com uma pequena gota de cola de cianoacrilato líquido de fórmula. Coloque uma agulha de 25 calibre embotadas na extremidade do tubo cola para melhorar o controle e reduzir o derramamento.
   1. Coloque a ponta da agulha na junção entre o PE 10 e fio, então dispense uma pequena gota de cola e visualizar a colagem do revestimento interior do tubo de PE.
   2. Permitir que a cola totalmente curar durante a noite.

4. boa preparação da ponta do eletrodo para gravação

1. Descascar o revestimento isolante das pontas de eletrodo bipolar e a ponta do fio-terra com uma lâmina de bisturi #11. Não perturbe ou danos à base de vários fios encalhados como isso afetará a qualidade do sinal do RSNA.
2. Aperto o eletrodo construído entre a 5,0 mm e 1,5 mm PE 10 âncoras com curvas fórceps e dobre os fios para formar um ângulo de 90° (Figura 1).
   Nota: Esta manobra deverá posicionar as pontas de eletrodo bipolar acima o fio de terra, numa posição ideal para berço o feixe de nervos.

5. construção de ancoragem Pedestal

1. Construção de um pedestal para estabilizar o eletrodo conduz a região mid Escapulário do mouse em cima de exteriorização cortando um pedaço de 3 cm de tubo de polietileno (diâmetro interno 2,70 mm, diâmetro externo 4,00 mm).
   1. Segure o tubo com a pinça e derreta uma extremidade em um injetor de calor. Pressione a extremidade aquecida de tubo perpendicular a uma superfície de metal legal para criar um cume arredondado ou "flange".
   2. Passe este pedestal para o eletrodo construído, tal que a flange está apontando em direção a ponta do eletrodo.
      Nota: A combinação do PE 90 bainha e pedestal irá proteger os contatos eletrodo uma vez exteriorização do animal.

6. esterilização do eletrodo implantável concluído

1. Pacote do eléctrodo preenchido individualmente em sacos de esterilização e ozônio esterilizar (TSO₃) antes da implantação.
   Nota: Consulte com facilidade de esterilização do hospital local sobre um tipo específico de saco de esterilização e procedimento, como isso é diferente entre as instituições.

7. anestesia e preparação para a cirurgia

1. Administre analgesia 20 minutos antes do início da cirurgia (meloxicam de 2 mg/kg, S.C.). Coloque o mouse em uma câmara de indução infundida com oxigênio a 100% da classe médica. Ajuste configurações de vaporizador para aumentar o percentual de isoflurano anestésico em incrementos de 0,5 para chegar a 4%. Avaliar o avião cirúrgico avaliando o reflexo em resposta à pressão suave aplicada com os dedos ou almofadas do pé da frente e posteriores dos membros bem como diminuição da frequência respiratória.
   1. Transferir o animal para a mesa cirúrgica e manter a anestesia com isoflurano 1,5 a 2%, através de um cone de nariz, uma vez que atingiu o avião cirúrgico e já não apresenta o reflexo de dedo-pinch. Repetir a resposta de dedo-pinch periodicamente e avaliar frequência respiratória ao longo de todo o procedimento cirúrgico. Aplica a pomada oftálmica aos olhos para evitar ressecamento.
   2. Manter a temperatura de corpo normal do animal em todos os momentos com almofadas de gel-enchido calor isothermal e mesa cirúrgica correspondente. Armazenar as almofadas isotérmicas em banho maria a 37° C e substituir as almofadas sempre que necessário durante a cirurgia para manter a temperatura corporal fisiológico.
   3. Administrar o glicopirrolato (50-70 µ g/kg, por via subcutânea (S.C.)) para evitar a produção excessiva de secreções das vias respiratórias imediatamente após a indução da anestesia. Administre esta dose de glicopirrolato uma segunda vez no ponto médio do procedimento cirúrgico (passo 9.1).
   4. Realizar todos os procedimentos cirúrgicos sob condições assépticas. Certifique-se de todos os instrumentos cirúrgicos foram autoclavados antes da cirurgia agendada. Limpe o campo cirúrgico, conforme descrito abaixo (7.2.1) e manter a esterilidade durante o procedimento.
      1. Use uma máscara de rosto, vestido da isolação autoclavados e luvas estéril de uso único. Limpe todos os equipamentos de grande porte como a lâmpada de pescoço de cisne, dissecando o escopo e mesa cirúrgica com etanol a 70%. Periodicamente durante o procedimento, aplica o etanol a 70% para as luvas cirúrgicas para garantir a esterilidade.
2. Remova o cabelo do flanco esquerdo do animal, a região ventral do pescoço e região dorsal midscapular com cortador de pelos de animais pequenos seguido por creme depilatório (fórmula de pele sensível).
   1. Limpar a pele desses dois campos cirúrgicos com 3 alternando aplicações de solução de limpeza cirúrgica (10% iodopovidona) e 70% de etanol. Prepare o campo cirúrgico com uma aplicação final da solução de limpeza cirúrgica.

8. cirúrgica implantação do eletrodo RSNA

1. Posicione o mouse do seu lado direito com extremidade rostral, apontando para a esquerda do cirurgião, expondo o flanco esquerdo do animal. Faça uma incisão de 5 mm na pele da região midscapular com um bisturi (#11).
   Nota: Este é o local em que os contatos de eletrodo RSNA vão ser exteriorized.
   1. Uma segunda incisão (< 20 mm) na pele sobrejacente o flanco esquerdo, perpendicular à coluna vertebral e 2mm de caudal para a caixa torácica. Uma agulha de aço inoxidável de 13G por via subcutânea desta incisão para a incisão no local da saída dorsal de túnel.
      Nota: As bordas afiadas da agulha para deixar um liso, não-ponta do arquivo.
   2. Passe o eléctrodo RSNA implantável esterilizado (passos 2 - 6) através da agulha de 13G. Puxe a agulha de 13G para deixar a ponta do eletrodo, mentindo sobre o músculo abdominal do flanco esquerdo. Deixe um segmento dos fios eletrodo deitado sob a pele e os restantes comprimentos emergindo a incisão dorsal.
2. Coloque a ponta do eletrodo para o lado. Fazer uma incisão no músculo abdominal diretamente subjacentes da incisão na pele feita em 8.1.1. Separe a gordura e tecido conjuntivo, ao longo do músculo traseiro com pequenos aplicadores com ponta de algodão para expor o rim esquerdo.
   1. Abrir o campo cirúrgico com microretractores e retrair o rim. Fazer para não esticar o renal feixe vasculonervoso, que será irreversivelmente danificar os nervos renais e impedem a gravação do sinal RSNA viável.
      Nota: Microretractores de aço podem ser formados a partir de um clipe de papel padrão e um comprimento de seda 4-0. Assegure que esses retractores também são esterilizados com os instrumentos cirúrgicos, a fim de preservar a técnica asséptica.
3. Visualize o feixe vasculonervoso renal com o auxílio de um potente microscópio de dissecção. Identifica o pacote do nervo renal, que tipicamente (mas não sempre) é executado junto com a veia e artéria renal. Disse o feixe de nervos os tecidos circundantes com pinça fina, em linha reta.
   Nota: O pacote de nervo renal aparece opaco, com uma "corda" reflexiva aparência, única em comparação com os vasos linfáticos, que aparecem claros.
   1. Manipule o feixe de nervos o mínimo possível. Não toque, esticar ou pegar o feixe de nervos, a qualquer momento. Não perturbem vasos sanguíneos bem fornecendo o nervo, ou ducto linfático renal porque isto irá comprometer a viabilidade do nervo e produzir pooling de fluido linfático contínuo em torno do nervo/eletrodo, que obstrua ou obliterar completamente o sinal de coragem.
   2. Deixar o feixe de nervo renal intacto, que ajudará a preservar a viabilidade a longo prazo do nervo, bem como manter contato estável entre o nervo e o eletrodo (ou seja, um nervo seccionado pode escorregar de eletrodos com tempo e movimentos naturais do corpo).
4. Introduza a ponta do eletrodo RSNA no abdômen. Ajuste sua posição tal que o fio de ponta e chão de eletrodo bipolar é perpendicular ao feixe vasculonervoso renal. Ainda mais, ajuste a posição do eletrodo tal que o fio terra tem bom contato com os tecidos subjacentes e o eletrodo não comprimir os vasos renais, comprometendo a circulação renal (Figura 1).
5. Levanta o feixe de nervo renal com pinças em ângulo. Deslize a ponta do eletrodo por baixo do nervo, deixando o nervo em contato direto com ambos os fios.
   1. Coloque um pequeno pedaço de filme de parafina entre os fios nervo/bipolar e o terceiro fio (terra) (Figura 1).
      Nota: Embeba esterilizar o filme de parafina em etanol a 70% por 24 horas e enxágue em soro fisiológico estéril antes da implantação.
   2. Remover qualquer sangue ou fluido ao redor do nervo/eletrodo com absorvente pequena lanças como qualquer fluido deixada em torno do nervo ou fios eletrodo irão impedir ou extinguir o sinal do nervo.
   3. Teste a qualidade do sinal do RSNA rapidamente se desejado (configuração descrita abaixo).
      Nota: Isto deve ser feito rapidamente como a exposição ao ar secará o nervo e comprometer sua viabilidade.
   4. Aplica um elastómero de silicone do dois-componente para a unidade de nervo/eletrodo, assegurando que as piscinas de silicone sob e em torno do nervo para fornecer a isolação elétrica completa (ou seja, não simplesmente uma gota em cima do nervo).
      Nota: Certifique-se que as pontas de eletrodo também são revestidas em silicone. O fio terra deve permanecer em contacto com o tecido subjacente e assim elastômero não necessita de piscina debaixo deste fio. Evite aplicar uma desnecessariamente grande quantidade do elastômero de silicone, pois potencialmente pode impedir o fluxo de sangue renal, ou tornar-se desalojado com movimentos naturais do corpo com o tempo.
   5. Permitir que 1-2 minutos para o elastómero de silicone curar completamente, então cuidadosamente Levante as bordas externas do silicone "bola" com fórceps e aplique uma pequena quantidade de líquido fórmula adesivo cirúrgico.
      Nota: tenha cuidado para não aplicar uma quantidade excessiva dessa cola, pois pode prejudicar a circulação ou se espalhou para o nervo e comprometer sua viabilidade.
6. Feche a incisão abdominal com suturas absorvíveis, descontínuas (5-0). Feche a pele sobrejacente de forma semelhante com o mesmo material de sutura.

9. a implantação de Radiotelemeter de pressão arterial

1. Reposicione o mouse em suas costas, com a extremidade rostral apontando para o cirurgião. Ajuste o cone do nariz anestesia conforme necessário. Administre a segunda dose de glicopirrolato neste ponto (ver 7.1.3).
2. Fazer uma incisão na pele da região do pescoço com um bisturi (#11), começando desde logo abaixo do maxilar inferior do animal e estendendo-se logo acima da caixa torácica. Separe o tecido glandular para expor os músculos do pescoço subjacente. Expor a artéria carótida comum esquerda e separar dos tecidos circundantes.
   Nota: Tomar muito cuidado para não danificar o nervo vago, como isso pode levar a aumento de mortalidade pós-cirúrgica.
   1. Passe três pedaços de material de sutura seda 6-0 debaixo da artéria. Posicione uma sutura rostral, tanto quanto possível e amarrá-lo para ocluir o vaso. Posicione um segundo meio de sutura ao longo do comprimento do navio e amarre frouxamente. Posicione a última sutura tão caudalmente possível e amarre frouxamente.
   2. Retrair a sutura mais rostral e segura para o cone do nariz com um pequeno pedaço de fita umbilical. Retrai a sutura mais caudal com pinças micro-mosquito para restringir o fluxo de sangue no vaso.
   3. Faça uma pequena incisão na parede do vaso com uma tesoura de mola bem como rostral quanto possível. Introduza o cateter de radiotelemeter de pressão arterial de rato o navio e avance para a sutura de caudal.
      1. Amarre a sutura média para temporariamente estabilizar o cateter, liberar a retração de caudal e avançar a cateter 10mm. gravata sutura ao redor do cateter para fixar no lugar.
   4. Túnel do corpo de telêmetro para uma bolsa subcutânea ao longo do flanco direito.

10. a implantação e a exteriorização do cateter venoso Jugular

1. Use pequenos aplicadores com ponta de algodão para expor a veia jugular direita. Passe dois pedaços de material de sutura seda 6-0 em torno do navio.
   1. Uma sutura de posição rostral, tanto quanto possível e gravata para ocluir o vaso. Posicione a segunda sutura tão caudalmente possível e gentilmente retrair para parar o fluxo de sangue no vaso.
   2. Use tesoura de Primavera para fazer uma pequena incisão na parede do vaso mais próximo a sutura rostral quanto possível. Cateterismo da veia com tubulação de calor-esticado (O.D. 1,02 mm, esticado para OD 0,64 mm), que é pre-preenchido com soro fisiológico estéril.
      Nota: Certifique-se que a ponta do cateter é cortada com um bisturi para produzir um chanfro arredondado para evitar perfuração do vaso. Determinar o volume de fluido no cateter (espaço morto) de referência (ver etapas 14.4-14,6 abaixo).
      1. Avance o cateter ~ 8mm na veia. Fixe o cateter por atar as suturas de seda ao redor do navio e cateter, bem como aplicação de uma pequena gota de cola de cianoacrilato fórmula gel.
2. Coloque o mouse sobre seu lado esquerdo. Túnel do cateter intravenoso do pescoço para sair na região dorsal midscapular usando uma agulha de aço inoxidável de 13G.
3. Reposicione o mouse nas costas dele. Feche a incisão de pescoço com suturas descontínuas.
4. Coloque o animal na posição de bruços. Passe um pequeno botão subcutâneo ao cateter venoso. Fixe o botão sob a pele com suturas. Passe a mola de aço inoxidável correspondente sobre o cateter venoso e fixá-lo ao botão de pele para proteger o cateter.

11. fixar o eletrodo exteriorizado leva

1. Fixe o pedestal de polietileno protegendo que o eletrodo conduz ao músculo subjacente com adesivo de tecido. Suture a pele sobrejacente sobre a flange para mais apoio.

12. pós-cirúrgica recuperação

1. Aplique a pomada antibiótica para todas as incisões.
2. Administre a medicação analgésica. Administre doses adicionais de medicação analgésica conforme necessário durante o período de recuperação se o animal mostra sinais de dor ou sofrimento.
3. Coloque o mouse em uma gaiola metabólica forrada com fundamento de cavaco de madeira e papel toalha para recuperar. Monitorar continuamente o animal e não deixar sozinho até que recupere a consciência e pode manter a prostração esternal. Introduza o enriquecimento ambiental, comida e água (ad libitum) neste ponto.
4. Eletrodo de bobina leva para fora da gaiola até a hora do experimento.
5. Coloque a gaiola sobre uma almofada de calor quente nas primeiras 24 horas de recuperação. Conecte a mola de aço inoxidável e cateter intravenoso para um sistema de giro/infusão para infusão contínua de soro fisiológico durante o período de recuperação (0,5 mL/h).
6. Garantir que o animal continua a ser alojados individualmente em uma gaiola dedicada devido à natureza do cateter exteriorizado e eletrodo conduz.

13. experimental Setup para pressão arterial de gravação e RSNA

1. Equipe uma mesa de antivibração superior de aço inoxidável com uma simples gaiola de Faraday.
   Nota: Esta gaiola de Faraday pode ser construída com uma malha de tela de quadro e alumínio de madeira. A gaiola de Faraday/tabela para eliminar qualquer ruído elétrico eletricamente à terra.
2. Coloque um receptor de radiotelemetria pressão arterial dentro da gaiola de Faraday.
3. Conecte o receptor de radiotelemetria para o adaptador de saída de pressão associada. Ligue este adaptador para um sistema de aquisição de dados para registro da pressão arterial on-line.
4. Solda dois conectores pino fêmea que são gratuitos para os conectores de pino macho de eletrodo (bronze com chapeamento de ouro) até o fim de um par, blindado PVC isolou o cabo. Solde os opostos deste cabo emparelhado para plugues de banana. Conecte os plugues de banana para um headstage de pré-amplificação (amplificação de X 10).
5. Este pré-amplificador Conecte um amplificador diferencial. Ajuste as configurações para amplificar o sinal do nervo x10, 000. Ajustar as configurações de filtro, como segue: corte baixo, 100Hz; Alto corte, 1000Hz.
6. Coloque a gaiola em casa contendo o mouse para o receptor de radiotelemetria localizado dentro da gaiola de Faraday, 48 a 72 horas após a cirurgia. Ligue a sonda de radiotelemetria para gravar sinais de pressão arterial.
   Nota: Aclimatar o mouse, colocando a gaiola em casa no setup ao longo de 1 semana antes da cirurgia é o ideal.
7. Desenrole as pistas de eletrodo e ligue os pino conectores do eletrodo bipolar pino fêmea conectores correspondentes descritos acima (13,4) para começar a gravar RSNA.
8. Exibir e gravar simultaneamente sinais de pressão arterial on-line com um computador, enquanto infundindo soro fisiológico ou solução de interesse. Gravar dados a uma velocidade mínima de 2500 amostras por segundo.

14. protocolo Experimental e validação da RSNA sinal da amostra

1. Certifique-se de ratos são confortáveis em sua gaiola em casa, desenfreada com livre acesso à comida e água. Siga as orientações institucionais cuidados com animais para verificar o comportamento e a aparência normal.
2. Os ratos no mesma temperatura e umidade controlada sala na qual RSNA gravação terá lugar da casa. Certifique-se de infusão intravenosa continua conforme descrito acima.
3. Permitir que pelo menos 30 minutos de estabilização, uma vez que o animal situa-se na configuração da gravação acima descrita antes da gravação de uma hora de pressão de linha de base e dados RSNA. Certifique-se que o animal está descansando tranquilamente durante a gravação, desde que o movimento natural está associado com aumento no tônus simpático. Nota Quando o animal se move diretamente sobre o rastreamento digital durante a gravação, então isto pode ser tidas em conta durante a análise.
4. Testar a resposta do barorreflexo pelo primeiro lentamente injetar um bolus de nitroprussiato de sódio (2,5 µ g/g de peso corporal em um volume de 25 µ l de soro fisiológico) para a linha de infusão. Lentamente, liberar a linha com soro fisiológico de ~ 50 µ l. Certifique-se de espaço morto de cateter está desmarcado. Registro de pressão arterial e RSNA para 2 a 5 minutos.
5. Lentamente, injete um bolus de fenilefrina (20 µ g/g de peso corporal em 25 µ l de solução salina). Lave com soro fisiológico de ~ 50 µ l. Certifique-se de espaço morto de cateter está desmarcado. Registro de pressão arterial e RSNA por mais 10 a 15 minutos.
6. Verificar a natureza pós-ganglionares do sinal do nervo injetando-se lentamente o bloqueador ganglionar, hexametônio (50 µ g/g de massa corporal em soro fisiológico a 25 µ l) na linha de infusão em bolus. Lavar com soro fisiológico ~ 50 µ l. Certifique-se de espaço morto de cateter está desmarcado. Continue a gravar por vários minutos.
7. Use a atividade residual que permanece após a administração de hexametônio como uma estimativa do ruído de fundo para uso na análise da RSNA (descrito abaixo).
8. Eutanásia o mouse com uma overdose de isoflurano (dosagem gradual em incrementos de 0,5 até 5%) e continuar a gravação RSNA por mais 30 minutos. Nota: O sinal restante também pode ser usado como uma estimativa do ruído de fundo para a análise da RSNA.

15. análise de dados

1. Uso o software de aquisição de dados para analisar cru pressão de sangue e vestígios RSNA.
   1. Integrar digitalmente e onda completa rectificar o rastreamento RSNA cru, usando este software. Selecione "Absoluto Integral" para configurações integrais; aplica uma deterioração constante de tempo em 0,1 segundos⁶.
   2. Analise o sinal RSNA integrado (exibido em unidades de µV·s) para cada segmento do protocolo experimental. Desconsidere os segmentos da gravação quando o animal aconteceu estar se movendo. Tome pelo menos 3 medições para a linha de base e parcelas experimentais de experimento, respectivamente.
   3. Analise a RSNA a nível de pressão arterial mínima e máxima alcançada por nitroprussiato de sódio ou fenilefrina, respectivamente, para avaliar a sensibilidade do barorreflexo.
   4. Média as medições individuais tomadas acima para cada parte do protocolo experimental, para produzir um valor único.
   5. Quantificar a resposta RSNA calculando a variação percentual da RSNA da linha de base, que é designada no 100%⁷. Análise estatística completa conforme apropriado.
      Nota: Neste exemplo, a análise estatística da resposta do RSNA de nitroprussiato de sódio e fenilefrina foi concluída com um t de Student; significância foi aceite com valores de P < 0,05.

Seguindo o protocolo descrito, taxa de sobrevivência foi de 100% - todos os mouses instrumentados neste estudo sobreviveu e se recuperou bem, seguindo o procedimento cirúrgico. Dentro de 24 horas de preparação cirúrgica, todos os ratos se comportou normalmente, exibindo o típico comer, comportamentos de aliciamento e exploratórias. Os animais não mostraram qualquer sinal de dor ou sofrimento neste momento. 48 horas após a cirurgia, um sinal RSNA verificável e claro foi gravado em 10 dos 12 ratos. Este sinal foi mantido nestes ratos 72 horas pós-cirurgia, no entanto uma RSNA verdadeiro sinal foi gravado em 7 (70%) de camundongos por dia 4 e em apenas 5 (50%) camundongos por dia 5 pós-cirurgia. Ratos que não exibem um sinal RSNA de alta qualidade devido ao ruído elétrico ou contaminação por sinais de eletrocardiograma ainda estavam em boa saúde até ao momento da eutanásia.

Pressão arterial em pós-operatório de 48 horas a ratos consciente foi 116±2 mmHg, com uma correspondente frequência cardíaca média de bpm 596±22 (n = 10). Gravação simultânea de uma amostra representativa de pressão arterial e RSNA neste momento demonstrou claramente visíveis e caracteristicamente rítmicos estouros da RSNA (Figura 2). Os aumentos típicos da RSNA esperado com as atividades como comer e de aliciamento, como diretamente observado e anotado por pessoal, estiveram também presentes (Figura 3). Alta qualidade RSNA foi igualmente registada sequencialmente em 50% dos ratos sob investigação até 5 dias após a preparação cirúrgica (Figura 4). Pressão arterial e frequência cardíaca manteve-se estável durante o período de investigação de 5 dias e valores não eram diferentes daqueles que registraram seguindo até 10 dias de recuperação pós-cirúrgica (tabela 1)⁸.

Para validar o sinal RSNA e verificar que isso na verdade é arrastado com o barorreflexo arterial, pressão arterial farmacologicamente foi manipulada com uma injecção intravenosa de nitroprussiato de sódio e fenilefrina. RSNA caracteristicamente aumentado em resposta à redução induzida por nitroprussiato de sódio da pressão arterial; por outro lado, RSNA foi praticamente silenciado após o aumento de fenilefrina-induzido da pressão arterial (Figura 5). Quantitativamente, nitroprussiato de sódio, diminuição da pressão arterial de 62±3 mmHg, o que correspondeu a uma elevação da RSNA 77±9% acima dos níveis de base (n = 5; P < 0.05, Figura 6). Da mesma forma, após administração de fenilefrina, pressão arterial chegou a 137±6 mmHg, que reduziu a RSNA 79±2% abaixo do nível de base (n = 5; P < 0.05, Figura 6). Além disso, RSNA foi completamente eliminado após bloqueio ganglionar com hexametônio (Figura 7), que estabelece a natureza pós-ganglionar do sinal RSNA.

Figura 1: construção e colocação do eletrodo implantável nervo simpático renal. Representação esquemática do projeto e recomendada a colocação do eletrodo implantável nervo simpático renal. (A) bipolares pistas equipado com conectores de pinos e um terceiro fio à terra. (B) os fios são rosqueados através de 90 tubos de polietileno (PE) para proteger os contatos exteriorizados. (C) Design de ponta do eletrodo, a fim de separar os contatos bipolares o fio terra. (D) ponta o eletrodo é dobrada em um ângulo de 90° para facilitar a posição ideal; o feixe de nervo renal é colocado perpendicularmente aos fios de bipolares e filme à base de cera laboratório isola as pontas do fio terra que está em contacto com o tecido subjacente. Reproduzido com permissão de⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Representante de gravação da pressão arterial e renal simpático nervo atividade (RSNA). Rastreamento de amostra demonstrando a gravação simultânea de sistêmica da pressão arterial, RSNA e RSNA integrado em um rato consciente, calmamente descansando 48 horas após a preparação cirúrgica. Reproduzido com permissão de⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resposta da atividade do nervo simpático renal (RSNA) para atividade física normal. Representante de rastreamento com gravação simultânea de sistêmica da pressão arterial, RSNA e RSNA integrada em duas horas de ratos consciente, 48 e 72 após a cirurgia, na linha de base e (A) após o início do aliciamento ativo ou (B) tranquilo comendo. A seta grande denota o início da atividade física do resto. Reproduzido com permissão de⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Viabilidade de sinal de atividade de nervo simpático renal a longo prazo (RSNA). Sequenciais gravações representativas de pressão arterial e RSNA em um rato consciente, calmamente descansando, vários dias após a preparação cirúrgica. (A) há 2 dias, (B) 3, (C) 4 dias e depois da cirurgia (D) 5 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Arrastamento do sinal de atividade (RSNA) do nervo simpático renal com o barorreflexo arterial. Representante gravação de pressão arterial e RSNA em um rato consciente em repouso durante (A) da linha de base e após a administração endovenosa subsequente de nitroprussiato de sódio (B) seguido de (C) fenilefrina. Reproduzido com permissão de⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Quantificação do responsivity simpática renal, a pressão arterial. Resposta quantitativa da pressão arterial e a atividade do nervo simpático renal (RSNA) a manipulação farmacológica com nitroprussiato de sódio e fenilefrina. (A) significa pressão arterial no início do estudo (barra preta; 116±2 mmHg) e após administração intravenosa subsequente de nitroprussiato de sódio (barra cinza; 62±3 mmHg) e fenilefrina (bar aberto; 137±6 mmHg). (B) correspondente a resposta RSNA durante o nitroprussiato de sódio (barra cinza; 77±9%) ou fenilefrina (bar aberto; - 79±2%). RSNA é expressa uma mudança percentual da linha de base, média ± SEM. * diferença significativa da linha de base (p < 0.05, n = 5). Reproduzido com permissão de⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Pós-ganglionar natureza da atividade do nervo simpático renal (RSNA). Rastreamento representativo da pressão arterial e RSNA no (A) da linha de base, (B) imediatamente após o bloqueio ganglionar com hexametônio e (C) post-mortem. Reproduzido com permissão de⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Média arterial pressão e batimentos valores basais em camundongos instrumentados por 5 dias consecutivos após a cirurgia. Reproduzido com permissão de⁵.

Aqui temos descrito, demonstrado e validado um método novo para avaliação orientada do RSNA em ratos conscientes, livres para mover-se e descansar confortavelmente em suas gaiolas para casa. Após a implantação cirúrgica de um radiotelemeter de pressão arterial, um cateter de infusão intravenosa permanente e um eletrodo bipolar personalizados do RSNA, ratos recuperaram da cirurgia e foram deixados sem ser perturbado por 48 a 72 horas. Camundongos permaneceram confortavelmente estabelecidos em sua gaiola em casa em todos os momentos (incluindo períodos experimentais) com acesso irrestrito à comida, água e enriquecimento ambiental. Toda manipulação experimental que se seguiu pelo investigador era remoto e não desassossego dos animais. Em relação à qualidade e interpretação do sinal RSNA, esta abordagem completamente removido as complicações fisiológicas indesejáveis e inevitáveis da anestesia e trauma cirúrgico, bem como a retenção e outras fontes de estresse físico e mental para o animal. Assim, estes fatores de confundimento sérios que invariavelmente impacto a interpretação das medições de atividade do nervo simpático, efetivamente, foram eliminados.

Todos os mouses estavam de boa saúde e exibida logo em pós-operatório de 24 horas, comportamentos típicos tais como brilho, atividade, capacidade de resposta, comendo, bebendo, aliciamento também comportamento exploratório e brincalhão. Todos os animais expostos a estas características e activamente com o enriquecimento ambiental fornecido independentemente se foi ou não um sinal RSNA viável capaz de ser gravado. Embora o tempo de recuperação necessário para completamente restaurar a pressão arterial normal, seguir a implantação da sonda radiotelemetric é declaradamente desde 4-7 dias⁹, pressão arterial retorna ao normal muito mais cedo, como demonstrado pelos valores aqui relatados para a pressão arterial e frequência cardíaca. Com efeito, estes parâmetros cardiovasculares são equivalentes às anteriormente relatados da mesma forma instrumentada animais a que foram autorizados à 10 dias para se recuperar de cirurgia^8,10.

A escolha de usar sondas de radiotelemetric para medida da pressão arterial sobre um cateter cheios de líquido foi proposital, pois isso reduz o estresse em ratos e também produz mais claro e confiável de sangue e sinais de pressão de pulso e de valores de frequência cardíaca¹¹. Usando a tecnologia de telemetria para registro da pressão arterial constitui uma vantagem adicional desde que a necessidade frequentemente liberar e manter que o fluido cheio de cateter arterial com soro fisiológico heparinizado, que inevitavelmente perturba o animal, é completamente eliminada. Além disso, a abordagem de exteriorizing cirurgicamente, ancoragem e protegendo o cateter intravenoso e eletrodo bipolar leva são ideal em comparação com outros relatórios descrevendo o armazenamento temporário dos principais em uma bolsa subcutânea¹², desde nossa abordagem evita mesmo breve re-anestesia e manipulação cirúrgica do animal imediatamente antes de uma gravação experimental, que, sem dúvida, perturbar o mouse e comprometer a qualidade e interpretabilidade de requintadamente sensível sistema nervoso dados.

Este método produz verdadeiros sinais RSNA, cuja qualidade comprovado pelas explosões características de actividade eléctrica claramente distinguível de ruído de fundo em um ambiente descontraído, calmamente descansando do mouse. Além disso, RSNA mostrou receptividade típica para atividade física no animal tais como aliciamento e tranquila comendo como relatado na literatura^13,14. Dada a característica aumenta no RSNA esperado com movimento natural ou estado de alerta do animal, assim, é imperativo para observação e excluir esses períodos de tempo para efeitos de análise experimental e se concentrar em segmentos da gravação durante o qual o animal está descansando tranquilamente. Isso ajuda a evitar possíveis erros de interpretação dos dados. Outros fatores que podem levar a interpretações erradas de dados incluem o ruído elétrico ou interferência, bem como a contaminação de sinal com ECG pulsos¹⁵. Movimentação excessiva da porção exteriorização de leva o eletrodo também pode influenciar a qualidade do sinal do RSNA e pode aparecer como uma linha de base instável ou "oscilando". Às vezes essas fontes de sinal interferência pode aparecem e espontaneamente desaparecerem durante uma gravação perfeitamente clara e devem ser excluídos da análise^5,15,16. Uma consideração adicional é o tempo em que as gravações são obtidas. É importante notar que pressão arterial e RSNA variam de acordo com o ritmo circadiano, por isso é ideal para realizar experimentos ao mesmo tempo do dia para evitar este fator potencialmente confundimento. Neste estudo, nós não observaram significativa variabilidade da pressão arterial e RSNA devido circadianos oscilações como registramos todos os parâmetros entre 10:00 e 18:00 - bem dentro do ciclo de luz do dia da instalação de alojamento dos animais. Outro componente importante deste relatório é a validação do sinal RSNA, que como demonstrado, na verdade é arrastado com o barorreflexo arterial. Dada a rápida redução e elevação da RSNA em paralelo com a queda farmacologicamente induzida e aumento na pressão arterial sistêmica, o barorreflexo arterial estava certamente intacto - que por si só demonstra essa implantação oclusiva do radiotelemetria cateter em uma artéria carótida não interfere com a função cardiovascular normal. O virtual desaparecimento do sinal do RSNA mediante bloqueio ganglionar com outras mais confirma gravação do RSNA pós-ganglionares.

Seria ideal para fornecer um longo período de recuperação pós-cirurgia para os ratos, no entanto, nós e os outros neste campo reconhecem que mantendo a viabilidade a longo prazo dos nervos autonômicos em animais cronicamente instrumentados, especialmente ratos, continua a ser um desafio. Embora a qualidade de sinal RSNA diminuiu ao longo de vários pós-operatório de dias, ainda era possível gravar confiantemente RSNA verdadeiro durante pelo menos 3 dias consecutivos em todos os mouses e até 5 dias em cerca de metade dos animais. Esta realização em si significa um avanço no campo dos estudos autonômicos em camundongos. Além disso, este método maximiza o uso de animais transgénicos preciosos, como é possível gravar várias experimental e ensaios no mesmo animal em dias diferentes, claro, permitindo a randomização de ordem experimental e gravação de base apropriada de controle antes de cada experimento¹⁷. É encorajador ver relatórios bem sucedidos de gravações de nervo simpático a longo prazo realizados em roedores consciente^18,19,20 , incluindo avanços em nervo Telemétrico gravação de tecnologias para ratos ^15,21. Miniaturização desta tecnologia para uso no mouse consciente está próxima e, entretanto, nós nos esforçamos para melhorar esta técnica para aumentar a longevidade das fibras do nervo simpáticas para estender a janela experimental e talvez permitir mais um tempo de recuperação pós-cirurgia. No entanto, esse método continuará a ser um alternativa/complemento útil e facilmente acessível e disponível para todos os desenvolvimentos futuros no nervo Telemétrico, tecnologia de gravação em ratos, que exigem um investimento em equipamento dedicado e regular dispositivo manutenção.

A necessidade de técnicas confiáveis para avaliar a função autonômica e cardiovascular em ratos nunca foi tão grande, considerando o interesse crescente no rato transgénico modelos no campo da pesquisa biomédica. Grandes progressos em muitas áreas da fisiologia, no entanto, há ainda muito para ir em termos de padronização e otimização de abordagens para avaliar a função autonômica no mouse. Até à data, não há uma medição descrevendo de relatório de atividade do nervo sensorial ao rato consciente¹². Esta abordagem descreve a medição da actividade de nervos sensoriais da bexiga e envolve a anestesia e a manipulação cirúrgica de cateteres colocados por via subcutânea, imediatamente antes da gravação experimental, bem como a contenção física dos ratos durante o curso do protocolo experimental¹². Esses fatores são conhecidos fatores de stress que são completamente evitadas com a abordagem actual, que certamente pode ser adaptada para a gravação de uma variedade de nervos, de interesse para além de nervos renais. Mais recentemente, foram relatadas medições de nervo simpático em camundongos conscientes, no entanto, estas medidas são grandemente conduzidas horas após preparação cirúrgica, com nenhuma menção de analgésico administração²². Além desses relatórios, função autonómica tenha sido avaliada caso contrário exclusivamente em ratos anestesiados. Uma revisão completa da literatura produz uma multiplicidade de abordagens, horas de duração duração experimental, combinações/doses anestésicas, ventilação mecânica e muitas vezes criativas medidas tomadas para sustentar os ratos num estado tendo alguma semelhança com o fisiológica (ou seja, o oxigênio soprado diretamente na direção do nariz do animal)^23,24,25,26,,^{27,28,29, 30,31}. Entre estes estudos, relatórios dos valores de pressão arterial estão ausentes, ou muitíssimo baixo - abaixo da faixa fisiológica da pressão arterial sistêmica². Isto é problemático em muitos níveis, mas especialmente então quando intervier adequada avaliação da função autonômica nestes animais, dada a ligação estabelecida entre a pressão arterial e Tom autonômica. Agentes anestésicos próprios impacto diretamente o tônus simpático, com muitos relatórios sugerindo que a anestesia amortece a atividade simpática. De fato, evidências demonstram que uretano, o anestésico mais amplamente escolhido para nervo agudo gravação experimentos³², dose dependente diminui RSNA³³ e inibe o barorreflexo arterial³⁴. Por outro lado, outros relatórios sugerem que uretano aumenta o tônus simpático³⁵. Concedido, que tais estudos tipicamente comparam a atividade do nervo experimental como uma mudança de uma linha de base gravada, no entanto o estado alterado do sistema nervoso autônomo nas condições acima descritas inegavelmente se opõe a deteção de discretas alterações no nervo atividade.

O desafio deste método reside principalmente na habilidade cirúrgica necessária para preparação de sucesso do mouse para gravação de nervo consciente. No entanto, o investimento em aperfeiçoar essas habilidades mais do que é compensado pela qualidade e confiabilidade dos dados RSNA diretos produzido. Esta abordagem completamente contorna as limitações decorrentes das avaliações indiretas de controle autonômico, tais como os níveis de catecolamina do plasma, que são bastante lábil em camundongos e são limitados pela quantidade de sangue que pode ser humanamente coletados³⁶. Além disso, a estimativa de nível, bem como farmacológicos bloqueio autonômico catecolamina plasma globalmente autonômica Tom¹ em oposição as discretas contribuições das populações nervosas específicas, que geralmente são de interesse mais. Matemática avaliação do tônus autonômico através de análise espectral de potência de vestígios de pressão arterial e frequência cardíaca é útil para avaliar a função autonômica em seres humanos, no entanto, esta técnica pode não ser adaptável para ratos^36,37. Portanto, a amostragem direta da atividade do nervo em um rato consciente, descansando confortavelmente é ideal como intimamente reflete o status autonômico natural, intacto do assunto e facilita a sofisticada avaliação da contribuição dos nervos selecionados para fenômenos fisiológicos de interesse.

Os autores não têm nada para divulgar.

S.M.H. foi apoiado por bolsas de pós-doutorado dos institutos canadenses para pesquisa de saúde (CIHR), coração & Stroke Foundation do Canadá (HSFC) e Alberta inova saúde soluções (AiHS); J.E.H. é suportado por um fundo de nacional de coração, pulmão e sangue Instituto PO1HL-51971.