당사는 세포 집단 다양성 및 세포 간 상호 작용을 연구하기 위해 고처리량 친화성 IC 방법을 개발합니다. 이러한 맥락에서 겔 미세방울을 사용하면 갇힌 세포에서 고도로 마비된 방식으로 용해 염색 DNA 조작 및 현미경 검사와 같은 유용한 프로토콜 단계를 수행할 수 있습니다. 액적 친화성 워크플로우는 매우 높은 처리량과 다목적성으로 알려져 있지만, 고급 기기와 전문 지식의 필요성으로 인해 채택이 제한되는 경우가 많습니다.
당사의 프로토콜은 형광 염색을 통한 고처리량 단일 세포 분석과 접근 가능한 오픈 소스 현미경 워크플로우를 사용하여 기존 기술을 개선합니다. 마이크로플루이덴틱스를 통해 세포를 겔 마이크로방울로 캡슐화하여 미니세포와 미세콜로니를 동시에 분석합니다. 벌크 및 플레이트 배양은 특이성과 분리능이 부족하지만 이 방법은 다양한 현상에 대한 정확하고 대표적인 통계를 겔화합니다.
당사의 프로토콜은 액적 미세유체역학, 형광 현미경 검사 및 오픈 소스 하드웨어를 라벨 기반 방법으로 결합합니다. 이 접근 방식은 단일 세포 분석을 보다 유연하고 저렴하게 만들어 과학계가 미생물 군집에 관한 복잡한 과학적 질문을 해결할 수 있도록 합니다. 시작하려면 Luria Bertani 또는 LB 육수에서 섭씨 2%에서 90도의 농도로 초저겔화 온도 아가로스를 가열합니다.
온도 조절이 가능한 셰이커에서 혼합물을 10분 동안 흔든 다음 써모 셰이커의 온도를 섭씨 39도로 낮추어 아가로스 용액을 냉각시킵니다. Escherichia coli 서스펜션 튜브를 써모 쉐이커에 4분 동안 넣어 섭씨 39도까지 예열합니다. 박테리아 현탁액과 아가로스 용액을 1:1 비율로 혼합하여 1%의 아가로스 농도를 달성하고 세포 현탁액을 3.1 곱하기 10의 밀리리터당 6개 세포의 거듭제곱을 달성합니다.
LB와 아가로스 현탁액을 1:1 비율로 사용하여 오염 모니터링을 위한 negative control 용액을 준비합니다. 가스 압력 드라이버와 유량 센서를 포함한 전체 오픈 소스 유량 플랫폼을 확보하십시오. 설정에 유리 슬라이드와 피펫 팁 히터를 포함하여 아가로스 세포 샘플이 칩에 들어갈 때 샘플을 제어할 수 있습니다.
다음으로, 스트로브 강화 현미경 스테이지에 미세유체 칩을 배치하여 액적 생성 접합부가 보이도록 합니다. 제어 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 피펫 팁 히터와 유리 슬라이드 히터를 섭씨 40도로 설정합니다. 튜브가 있는 주사기와 PDMS 플러그를 사용하여 1% 아가로스 셀 현탁액 혼합물을 200마이크로리터 피펫 팁에 로드합니다.
팁을 팁 히터에 삽입하고 미세유체 칩의 수성 상 입구에 놓습니다. 팁의 PDMS 씰을 흐름 제어 시스템 튜빙에 연결된 씰로 교체합니다. 그런 다음 오일 튜브를 두 번째 입구에 삽입하고 출구 튜브 끝을 폐기물 튜브에 삽입합니다.
그런 다음 사용자 인터페이스에서 무부하 및 오일 상태에 대해 압력을 80mbar로 설정하고 셀 현탁액 및 오일의 주입을 시작합니다. 오일 상태를 320mbar로 조정하고 무심 상태를 180mbar로 조정합니다. 액적 생성의 안정화를 위해 1분 정도 기다립니다.
액적 생성이 안정화되면 배출 튜브를 폐기물 튜브에서 수집 튜브로 옮깁니다. 샘플 저장소가 비워질 때까지 얼음 위에 물방울을 계속 수집합니다. 수집 후 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 동안 놓아 아가로스 젤이 방울 안으로 들어가도록 합니다.
박테리아와 음성 대조군 방울을 포함하는 겔 미세방울을 섭씨 37도에서 4시간 동안 또는 밤새 배양하여 군집 성장을 돕습니다. 배양 후 21게이지 바늘이 있는 3ml 주사기를 사용하여 젤 마이크로드롭릿 에멀젼 바닥에서 가능한 한 많은 오일을 조심스럽게 제거합니다. 50마이크로리터의 겔 미세입자를 새 마이크로튜브로 옮기고 추가 액적 분석을 위해 섭씨 4도에서 보관하고 나머지 에멀젼과 동일한 부피로 PFO와 불소화 오일의 일대일 혼합물을 추가합니다.
다음으로, 에멀젼 위에 약 200 마이크로 리터의 0.9 % 염화나트륨 완충액을 첨가합니다. 혼합물을 소용돌이치고 고정 속도 원심 분리기에서 잠시 회전시킵니다. 액체 계면 바닥에서 오일 상을 조심스럽게 제거하고 상단에서 100마이크로리터의 염화나트륨 용액을 버립니다.
2마이크로리터의 겔 마이크로액적을 이미징 챔버 슬라이드로 옮기고 5마이크로리터의 불소화 오일을 첨가하여 최적의 이미징을 위한 단층 액적을 형성합니다. 현미경에서 명시야 이미징을 위해 위에서 백색 LED 매트릭스 조명을 활성화합니다. 준비된 슬라이드를 장착합니다.
샘플에 초점을 맞춰 물방울의 단층을 찾고 명시야 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 녹색 파장 필터에 맞게 필터 휠을 조정합니다. 여기를 위해 470나노미터 LED로 전환하고 샘플을 이동하지 않고 집락의 형광 이미지를 캡처합니다.
2마이크로리터의 프로피듐 요오드화물 염색 마이크로겔을 이미징 챔버 칩으로 옮기고 5마이크로리터의 0.9%염화나트륨 용액을 첨가하여 마이크로겔의 단층을 형성합니다. 이미징 중 증발을 방지하기 위해 칩의 입구와 출구를 밀봉합니다. 프로피듐 요오드화물 이미징을 위해 적색 파장 간격 필터를 조정하고 명시야 및 형광 이미지를 캡처합니다.
겔 미세방울의 세포 캡슐화는 명시야 현미경으로 확인되었으며, 이는 뚜렷하게 캡슐화된 세포를 가진 균일한 방울을 보여줍니다. 플라스미드로 인코딩된 형광을 잃은 콜로니는 형광 비율 분석을 사용하여 식별되었습니다. 분석된 2개의 콜로니 중 785개의 콜로니에서 100개의 콜로가 형광을 잃었으며, 이는 3.6%의 플라스미드 손실률을 나타냅니다.
