췌장암의 마우스 모델에서 종양 침윤 림프구의 유세포 분석 기반 분리 및 치료 평가

우리는 췌장암 모델에서 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하고 채택하여 전달하는 방법을 개발하는 데 중점을 두고 있습니다. 우리는 TIL의 하위 집합이 in vivo에서 췌장 종양을 효과적으로 표적으로 삼고 죽일 수 있는지, 그리고 향후 임상 시험을 위해 T 세포를 최적화할 수 있는 방법에 대한 답을 얻으려고 노력하고 있습니다. TIL 분리 및 발현 기술 강화, TIL을 부드럽게 수정하여 표적 개선, TIL 요법을 체크포인트 억제제 또는 표적 요법과 같은 다른 면역 요법과 결합하여 항종양 효능 향상을 위한 최신 채택 세포 요법의 개발.

당사는 췌장암 마우스 모델에서 종양 반응성 TIL을 분리하고 확장하기 위한 강력한 방법을 확립했습니다. 우리는 양적으로 이식된 종양 반응성 T 세포의 향상된 항종양 효능을 입증했습니다. 당사의 프로토콜은 다른 덜 특이적인 방법과 비교하여 종양 특이적 TIL의 분리 및 선택을 가능하게 함으로써 채택 세포 치료에 대한 보다 표적화된 접근 방식을 제공합니다.

또한 비침습적 종양 모니터링을 위해 생물 발광 이미징에 사용됩니다. 우리의 연구 결과는 TIL 치료 효능을 평가하고 췌장암에 대한 T 세포 하위 집합의 치료 매개변수를 최적화하기 위한 표준화된 전임상 모델을 제공함으로써 이 분야를 발전시킬 것입니다. 마우스에서 정소성 췌장 종양을 유도하기 위한 KPC-루시페라제 세포 현탁액을 준비하려면 KPC-루시페라제 세포주를 섭씨 37도에서 1분 동안 트립신화합니다.

트립신화 후 PBS를 첨가하고 세포를 이식한 다음 세포 현탁액을 원심분리합니다. 세포를 세고 30%basement 막 모체를 포함하는 PBS에 있는 밀리리터 당 6개의 세포의 힘에 1 곱하기 10의 농도에 그(것)들을 다시 현탁시키십시오. 마취된 마우스를 작동 플랫폼에 놓습니다.

좌복부를 0.5∼1cm 절개한 후 겸자로 비장을 잡고 췌장을 노출시킨다. KPC-Luciferase 세포와 기저막 매트릭스 혼합물을 준비한 후, 29 게이지 바늘을 사용하여 50, 000 세포를 포함하는 세포 현탁액 50 마이크로 리터를 췌장에 주입합니다. 췌장을 복강으로 되돌립니다.

복막과 피부를 순차적으로 봉합합니다. 마우스가 완전히 깨어날 때까지 따뜻한 패드에서 회복되도록 합니다. 7일 후, 라이브 이미징을 위해 60마이크로리터의 D-Luciferin 칼륨 염 용액을 마우스에 복강내 주사합니다.

마취 후 생물 발광 감지를 위해 생체 내 이미징 시스템에 마우스를 배치합니다. 이미징 후 시스템에서 마우스를 제거하고 마취에서 자연적으로 회복되도록 합니다. 시작하려면 기증자 안락사 마우스를 작동 플랫폼에 놓습니다.

75% 에탄올로 전신을 살균합니다. 멸균 후드에서 가위와 집게를 사용하여 복강을 엽니다. 종양을 제거하고 얼음 위의 PBS에 놓습니다.

버니어 구경으로 종양 크기를 측정합니다. 그런 다음 화면 수식을 사용하여 종양 부피를 계산합니다. RPMI 1640에서 콜라겐분해효소, Dispase II 및 DNAse I을 사용하여 1X 분해 용액을 준비한 후 12웰 플레이트에 웰당 1-2ml의 용액을 추가합니다.

가위를 사용하여 종양을 작은 조각으로 다집니다. 종양 조각을 12웰 플레이트의 각 웰로 옮기고 섭씨 37도에서 소화시키면서 70RPM으로 30분 동안 흔듭니다. 소화를 종결하려면 10%소 태아 혈청 1-2ml를 첨가하고 세포 현탁액을 채취 튜브로 옮깁니다.

12웰 플레이트의 웰을 PBS로 두 번 세척하여 남아 있는 세포를 수집합니다. 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과하고 조직 조각을 다지고 부수어 주사기 플런저의 평평한 끝을 사용하여 단일 세포를 방출합니다. 여과액을 섭씨 4도에서 5분 동안 400G로 원심분리하고 유세포 분석을 위해 펠릿을 5% 소 혈청 알부민에 재현탁합니다.

시작하려면 종양을 가진 쥐에서 분리한 세포를 종양을 보유하지 않은 쥐의 비장 또는 말초 혈액 단핵 세포와 함께 작업 플랫폼에 놓습니다. FC 차단제와 유동 항체로 세포를 1 - 100 희석하여 염색합니다. 어두운 곳에서 얼음 위에서 튜브를 30분 동안 배양합니다.

배양 후, PBS에서 1% 소 혈청 알부민에 재현탁하기 전에 원심분리로 PBS에서 세포를 두 번 세척합니다. 유세포분석기에서 CD45+CD3+세포를 분류하려면 FSC-A 및 SSC-A를 기반으로 살아있는 세포를 게이트하여 게이트 P1을 생성합니다. 그런 다음 FSC-A 및 FSC-H를 기반으로 P1에서 단일 셀을 게이트하여 게이트 P2를 생성합니다. CD45 및 CD3 게이팅을 사용하여 P2에서 CD45+CD3+셀을 정렬합니다. 분류된 세포를 수집 튜브에 모읍니다.

원심분리기는 CD45+CD3+셀을 섭씨 4도에서 5분 동안 400G에서 분류했습니다. 마우스 혈청의 세포를 1 곱하기 10의 농도로 밀리리터당 6 세포의 거듭제곱으로 재현탁시키고 얼음 위에 놓습니다. 종양으로 유발된 수용자 마우스를 수술 플랫폼에 놓습니다.

29게이지 1/2인치 인슐린 주사기를 사용하여 분류된 면역 세포를 복강에 주입합니다. 그런 다음 인터루킨-2를 3일 연속으로 복강내로 투여합니다.