수성 및 폐수 역학은 지역 사회의 발병 과정을 모니터링하고 예측하는 대안적인 방법으로 부상했습니다. 탈지유 응집 방법은 미생물을 농축하는 대안적인 접근법을 나타냅니다. 탈지유 응집 방법은 한외 여과 또는 접선 유동 여과 접근법과 비교하여 큰 차이 없이 미생물 분획을 농축하기 위한 다재다능하고 저렴하며 쉬운 수동 방법을 나타냅니다.
이 접근법은 균유전체학 또는 표적 PCR 연구에 사용됩니다. 미생물 분획이 농축되면 상업용 추출 키트 또는 사내 프로토콜을 사용하여 핵산 추출을 수행할 수 있습니다. 탈지유 응집 방법은 대량의 물 또는 폐수 샘플에 대해 상대적으로 쉽습니다.
Milli-Q 물을 사용한 배경 제어가 이 방법의 일부로 포함되어야 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 Miguel Uyaguari 연구실의 대학원생 인 Kadir Yanac, Jhannelle Francis 및 Jocelyn Zambrano-Alvarado가 될 것입니다. 시작하려면 2리터의 24시간 유량 비례 복합 미처리 폐수 샘플을 수집하십시오.
샘플을 아이스박스에 담아 차광병에 담아 실험실로 운반하고 24시간 이내에 처리합니다. 폐수 처리장 기술 직원으로부터 폐수 특성 데이터를 얻으십시오. 각 한외 여과 방법에 대해 한 날짜에 수집된 6개의 신선한 폐수 샘플과 다른 날짜에 6개의 신선한 폐수 샘플 각각을 140밀리리터로 10배에서 네 번째 사본에 5배 스파이크합니다.
자기 교반에서 섭씨 4도에서 30분 동안 교반하여 샘플의 장갑 RNA를 균질화합니다. 탈지유 응집 또는 SMF의 경우 1ml의 합성 해수에 0.5g의 탈지유를 녹여 50% 탈지유 용액을 준비합니다. 하나의 일반 염산을 사용하여 SMF의 pH를 3.5로 조정합니다.
500 밀리리터의 원료 폐수 샘플에 5 밀리리터의 탈지유 용액을 첨가하십시오. 샘플을 8 시간 동안 저어주고 형성된 플록이 실온에서 8 시간 동안 더 침전되도록합니다. 침전 된 무리를 방해하지 않고 혈청 학적 피펫을 사용하여 상청액을 제거하십시오.
무리를 포함하는 50 밀리리터의 최종 부피를 원심 분리 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30 분 동안 8, 000 G에서 원심 분리기. 상청액을 제거하고 멸균 된 주걱을 사용하여 펠릿을 조심스럽게 긁어냅니다. 나머지 펠릿을 250 마이크로 리터의 0.2 몰 인산 나트륨 완충액에 재현 탁하십시오.
긁어내고 다시 부유시킨 펠릿을 동일한 1.5밀리리터 미니 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 제조업체의 지침에 따라 페놀 대 클로로포름, 이소아밀 알코올 및 베타 메르캅토에탄올의 비율이 25:24:2:1인 RNA 추출 키트를 사용하여 폐수 샘플의 바이러스 농축액에서 바이러스 RNA 추출 및 회수 효율 분석을 수행합니다. 마지막으로, 50 마이크로리터의 용출 완충액에서 RNA를 용리한다.
RT-qPCR 분석의 경우, 합성 단일 가닥 DNA 또는 gBlock 구조의 10배 희석을 사용하여 장갑 RNA를 정량화합니다. 각 RT-qPCR 실행에 대한 보정 곡선을 얻습니다. 음성 대조군을 포함하고 샘플을 세 번 실행합니다.
10리터의 환경 지표수 샘플을 수집합니다. 배경 제어를 위해 10리터의 탈이온수를 포함합니다. 0.45, 0.2 및 0.1 미크론 크기의 멤브레인 디스크 필터를 사용하여 캡슐 및 진공 여과를 수행하여 균유전체학 염기서열 분석 중 노이즈를 최소화합니다.
여과 후, 하나의 정상 염산을 사용하여 물 샘플의 pH를 3.5로 조정하십시오. 1% 사전 응집 탈지유 용액을 준비하고 pH를 3.5로 조정합니다. 산성화 된 탈지유 용액 100 밀리리터를 산성화 된 환경 용수 샘플 10 리터에 첨가하십시오.
마그네틱 셰이커에서 실온에서 8시간 동안 샘플을 저어주고 추가 8시간 동안 중력에 의해 무리가 침전되도록 합니다. 침전 후, 무리를 방해하지 않고 진공 펌프를 사용하여 상청액을 조심스럽게 제거하십시오. 50 밀리리터 원심 분리기 튜브와 원심 분리기의 무게에 따라 나머지 무리를 분취하고 균형을 맞 춥니 다.
상청액을 제거하고 펠릿을 200 마이크로리터의 0.2몰 인산나트륨 완충액에 용해시킨다. 추출 과정에서 공동 침전된 유리 DNA 및 RNA를 제거하기 위한 제조업체의 지침에 따라 용해된 펠릿을 DNase I 및 RNase A로 처리합니다. 배양 후 DNA 또는 RNA 추출 키트를 사용하여 용해된 펠릿에서 DNase I 및 RNase A.Extract 핵산을 비활성화합니다.
형광측정기를 사용하여 환경 지표수 샘플에서 추출된 DNA 또는 RNA의 총량을 정량화합니다. qPCR 분석을 수행하여 관심 장내 바이러스를 표적으로 삼고 Illumina 염기서열 분석을 수행하여 바이러스 군집 구조를 식별합니다. 보호되고 영향을 받은 수로에서 2리터의 물 샘플을 수집합니다.
샘플에 상당한 파편이 포함되어 있으면 무명천을 사용하여 제거하십시오. 20 밀리리터의 1 % 탈지유 용액을 이전에 pH 조정 된 2 리터 담수 샘플에 첨가하십시오. 샘플을 실온에서 8시간 동안 저어주고 무리가 추가로 8시간 동안 중력에 의해 침전되도록 합니다.
침전 후 연동 펌프를 사용하여 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 침전 된 무리를 50 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30 분 동안 8, 000 G에서 원심 분리한다. 상청액을 버리고 펠릿을 200 마이크로 리터의 0.2 몰 인산 나트륨 완충액에 재현 탁시킨다.
제조업체의 지침에 따라 선택한 핵산 분리 키트를 사용하여 DNA 추출을 위해 약 0.5g의 무리를 선택합니다. 형광 측정기를 사용하여 DNA 농도와 순도를 측정합니다. 3, 000 G에서 초여과로 처리된 6개의 샘플 모두 양성이었다.
대조적으로, 샘플이 7, 500 G.All 샘플에 초울트라 여과로 처리되었을 때 단 하나의 샘플만이 양성이었고 더 나은 회수의 결과를 낳았습니다. 3, 000 G 및 SMF의 평균 회수율은 7, 500 G.Water 품질 매개 변수에서 3 계절에 걸쳐 위니펙 내에서 수집 된 환경 물 샘플에서 추출한 영향을받는 샘플 및 핵산에서 매우 일관되게 여과보다 일관되게 높았습니다. 2022년 4월부터 10월까지 아시니보인 강에서 채취한 샘플은 산림 1에서 가장 높은 DNA 농도를 산출했으며 가장 낮은 농도는 농업 현장 3에서 회수되었습니다.
적절한 농도의 탈지유를 사용하고 사용하기 전에 샘플을 산성화하는 것이 매우 중요합니다. 이 기술은 물 및 폐수와 같은 환경 시료에 존재하는 다양한 미생물 병원체에 대한 신속한 스크리닝을 제공할 수 있습니다. 토양이나 퇴적물과 같은 고체 매트릭스를 사용하여 추가 수정을 구현할 수 있습니다.
