우리의 방법은 인간 혈관 평활근 세포를 사용하여 환자 샘플의 석회화 성향을 측정 할 수 있습니다. 이것은 혈관 석회화 장애에 대한 연구를 추진하여 새로운 치료법 개발을 지원하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술은 형광 기반 검출을 사용하여 감도를 높이고 시간이 지남에 따라 샘플을 측정할 수 있으므로 반복의 필요성을 줄이고 견고성을 높일 수 있습니다.
시작하려면 코팅되지 않은 세포 배양 플라스크에서 인간 혈관 평활근 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양합니다. 70 내지 90%컨플루언시에 도달하는 즉시 세포를 분할한다. 분할하려면 HVSMC를 PBS로 두 번 세척하십시오.
트립신을 넣고 섭씨 37도에서 2-5 분 동안 배양하십시오. 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신 반응을 억제한다. 세포를 350 RCF에서 4분 동안 원심분리하고 유지 배지에 펠릿을 재현탁시킨다.
입증된 바와 같이 분할을 위해 세포를 준비한 후, 세포를 계수하고 48-웰 플레이트에 시드하여 석회화 실험을 시작하였다. 섭씨 37도에서 5%이산화탄소로 밤새 배양한 후, 세포를 PBS로 두 번 부드럽게 세척하고, 두 번째 세척 후 나머지 모든 PBS를 조심스럽게 흡인합니다. 석회화 배지를 부드럽게 첨가하고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 더 배양하십시오.
석회화가 발생할 때까지 광학 현미경으로 매일 확인하십시오. 이미징을 통해 석회화를 감지하려면 소프트웨어를 열고 프로토콜 및 새로 만들기를 선택합니다. 절차를 선택하고 온도 설정을 클릭합니다.
팝업 창에서 온도를 섭씨 37도로 설정하고 그라데이션을 섭씨 1도로 설정하고 확인을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 원하는 플레이트 유형을 선택합니다. 이미지를 클릭하여 이미징 단계를 추가합니다. 반전된 이미저를 선택하고 확인을 클릭합니다. 세 개의 이미징 채널을 추가하고 DAPI, RFP 및 명시야로 설정합니다.
체크 몽타주 상자를 선택하고 이미지의 원하는 수와 위치를 설정합니다. 각 웰의 더 나은 적용 범위를 나타내도록 겹침을 변경합니다. 이미징할 웰을 선택합니다.
관심있는 우물을 선택할 수있는 새 창이 열립니다. 초점 옵션을 클릭하여 초점 모드를 설정합니다. 새 창이 열립니다.
각 채널을 개별적으로 설정합니다. 일반적으로 웰은 DAPI 채널에 자동으로 초점을 맞춥니다. 다른 모든 채널을 첫 번째 채널에서 고정 초점 높이로 설정하고 확인을 클릭하여 설정합니다. 창을 닫습니다.
데이터 축소를 클릭하여 데이터 축소 사전 설정 단계를 시작하고 이미지 전처리를 선택합니다. 확인을 선택하여 기본 설정을 적용합니다. 세포 분석을 선택하여 세포 수를 계산하는 단계를 설정합니다. 채널 드롭다운 메뉴에서 TsF DAPI 이미지를 선택합니다.
이미징을 수행한 후 추가 세부 정보를 설정합니다. 팝업 창 레이블 단계에서 통계를 선택하고 입력 채널로 TsF RFP를 선택하여 RFP 신호 분석을 준비합니다. 체크 상위 값 및 하위 값 상자.
하단 목록에서 전체 면적 상자를 선택합니다. 색상 효과 열에서 없음을 선택합니다. 팝업 창에서 사용자 지정을 클릭하고 배경 상자를 선택합니다.
확인을 누릅니다. 공정한 판독을 위해 왼쪽의 Ratio를 눌러 셀당 RFP 신호를 정규화합니다. 팝업 창에서 RFP 정량화 총 면적을 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 데이터 입력 1의 경우 셀 수를 데이터 입력 2로 선택합니다.
마지막으로 새 데이터 세트 이름을 선택하고 확인을 두 번 누릅니다. 앞에서 설명한 대로 Color Effect를 선택하고 왼쪽 위 모서리 OK.In 클릭한 다음 파일을 선택하고 파일을 프로토콜 파일 형식으로 저장합니다. 석회화의 첫 번째 인스턴스가 발생한 후 모든 시점에 대한 관찰을 기록합니다.
시작 소프트웨어에서 지금 읽기를 누르고 기존 프로토콜을 클릭합니다. 이전 단계에서 만든 프로토콜을 선택합니다. 프로그램에서 실험을 저장하라는 메시지를 표시합니다.
이 단계에서 수행하거나 나중에 왼쪽 상단의 저장 버튼을 클릭하여 수동으로 수행할 수 있습니다. 팝업 창에 시스템이 가열 될 때까지 기다리라는 메시지가 표시됩니다. 이산화탄소 가스 컨트롤러를 켜고 5%시스템이 설정 온도에 도달하면 플레이트를 삽입하고 읽으라는 메시지가 나타납니다.
취소를 누릅니다. 파손 및 유출을 방지하기 위해 인큐베이터에서 이미 저로 플레이트를 안전한 상자에 담아 운반하며 사고 발생시 살아있는 세포를 운반하기위한 현지 생물 안전 규정을 준수합니다. 플레이트를 플레이트 리더에 놓습니다.
절차를 클릭합니다. 팝업 창에서 사전 설정 이미징 단계를 선택합니다. 먼저 DAPI 채널의 초점과 노출을 조정합니다.
모든 채널에서 자동 노출 상자를 선택 취소한 다음 DAPI 채널 옆에 있는 현미경 아이콘을 클릭합니다. 새 창이 열립니다. 초점을 지시할 우물을 선택합니다.
신호가 이미 보이는 경우 먼저 자동 초점을 클릭한 다음 자동 노출을 클릭합니다. 그렇지 않은 경우 먼저 노출을 높이고 자동 초점 및 자동 노출을 반복합니다. 노출은 노출 드롭다운 메뉴를 선택하여 수동으로 조정할 수 있습니다.
여러 웰의 설정을 확인한 다음 설정을 저장하십시오. 모든 채널에 대해 동일한 방식으로 노출을 조정합니다. RFP 채널의 경우 석회화가 중간에서 높은 웰로 시작해야 합니다.
절차 창을 닫고 상단 작업 표시줄에서 녹색 Read Now 단추를 선택합니다. 소프트웨어에 표시된 대로 실험을 저장합니다. 각 시점에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
시스템이 플레이트를 읽는 동안 모든 이미지가 백그라운드에서 자동으로 처리됩니다. 표시할 TsF DAPI 이미지를 선택하여 셀 수 설정을 조정합니다. 두 번 클릭하여 원하는 웰을 선택합니다.
새 창이 나타납니다. 이미지 중 하나를 선택합니다. 팝업 창에서 분석 탭을 선택합니다.
세포 분석 세포 수를 선택하고 확인을 클릭합니다. RFP 및 명시야 채널을 선택 취소합니다. 개체 강조 상자를 선택합니다. 옵션을 클릭하여 메뉴를 엽니다.
크기 및 강도 임계값을 조정하여 모든 핵을 포함하되 파편을 제외한 다음 확인을 클릭합니다. 왼쪽 하단의 변경 사항 적용을 클릭하여 모든 이미지에 설정을 적용합니다. 마찬가지로, 석회화가 중간에서 높은 양이 있는 웰엔드 이미지를 선택합니다. 신호 대 잡음비를 가장 잘 조정하려면 작업 메뉴에서 분석 탭을 클릭합니다.
이미지 통계를 선택합니다. DAPI 및 명시야 채널을 선택 취소합니다. 옵션을 클릭하여 메뉴를 엽니다.
임계값 이상값 상자를 선택합니다. 신호에 대한 비주관적 임계값을 배경 위로 설정하려면 작업 표시줄에서 라인 도구를 선택합니다. 창이 나타납니다.
배경 영역을 포함하면서 신호 패치를 통해 선을 그립니다. 임계값 상한 및 하한 값을 조정합니다. 배경 위의 신호만 계산하고 파편이나 아티팩트가 있는 경우 제외합니다.
확인을 클릭하고 변경 사항을 적용하여 설정을 다른 모든 웰로 전송합니다. 임계값이 다른 웰에서 정확하게 선택되었는지 확인합니다. 셀 수 및 RFP 임계값이 설정되면 데이터를 내보냅니다.
드롭다운 메뉴 옆에 있는 Excel 버튼을 클릭하여 데이터를 스프레드시트로 직접 내보냅니다. 낮은 것부터 높은 것까지 다양한 석회화 단계가 감지되고 분석되었습니다. 석회화는 광학 현미경을 사용하여 검은색 반점으로 발견되었으며, 이는 1차 평가 및 이미징 시작 시기 결정에 유용했습니다.
향상된 신호 대 잡음비를 위해 처리된 RFP 이미지를 분석하여 석회화를 정량화했습니다. 데이터는 동시에 두 개 이상의 조건을 비교하여 얻어졌다. 데이터는 세포 당 석회화 면적으로서 세포 카운트로 정규화되었다.
데이터는 또한 다양한 시점에서 동일한 조건을 보여주는 시계열로 묘사되었습니다. 데이터 축소 및 분석 후 결과는 이미지 변환 및 임계 값 전에 볼 수있는 것을 반영하는 것이 중요합니다.
