당사의 프로토콜은 금 표준 ELISA 기술에 필적하는 분석물 농도의 정량적 면역 검출을 위한 아크릴 미세유체 장치를 제조하는 고분해능 마이크로밀링 방법을 설명합니다. 하이라이트는 클린 룸없이 간단하고 저렴한 열가소성 미세 유체 장치를 제작하여 정량적 방식으로 분석 시간을 단축하고 우수한 검출 한계를 허용하는 것입니다. 표면 연삭으로 시작하십시오.
800마이크로미터 엔드밀 비트로 1.3mm 두께의 PMMA의 9 x 25mm 직사각형을 자릅니다. 이 직사각형 중 하나를 양면 접착 테이프로 압전 플랫폼에 조심스럽게 부착하십시오. Z-센서를 연결하여 PMMA 사각형의 표면에 놓습니다.
감지 핀을 선택하고 센서 표면 위로 이동합니다. 센서에 접촉하지 않고 수동으로 핀을 내립니다. Z-영점 감지 모드를 활성화합니다.
200 마이크로 미터 엔드 밀 비트를 14, 500 rpm으로 회전시킵니다. z축의 원점 좌표까지 천천히 내립니다. 그런 다음 원점에서 30마이크로미터 아래의 z축을 재설정합니다.
이 좌표를 새 Z 원점으로 설정합니다. 마이크로 밀링 머신 소프트웨어에서 절단 버튼을 클릭하여 절단 패널을 활성화합니다. 추가 버튼을 클릭하고 아크릴 표면 연삭을 위해 이전에 생성 된 코드로 TXT 파일을 선택하십시오.
출력 버튼을 클릭하여 프로세스를 시작하십시오. 5 마이크로 미터 제한의 밀링을 위해, 먼저 엔드 밀 비트의 회전 속도를 11, 000 rpm으로 설정한다. 그런 다음 압전 플랫폼의 인터페이스로 플랫폼을 6.5마이크로미터 올립니다.
엔드밀 비트를 y축을 따라 500마이크로미터 이동합니다. 압전 플랫폼을 제어 인터페이스를 사용하여 z축의 초기 값으로 되돌립니다. 그런 다음 설계 소프트웨어에서 이전에 작성된 설계 파일을 열어 마이크로 채널의 밀링을 수행합니다.
인쇄 버튼을 클릭하고 속성 메뉴에 액세스한 다음 가공할 디자인이 포함된 레이어에 해당하는 색상 창을 클릭합니다. 도구 패널에서 제작 매개변수를 설정합니다. 홀 밀링의 경우 800마이크로미터 엔드 밀 비트로 전환하십시오.
해당 색상 창을 클릭하고 해당 제작 매개변수를 선택하여 직경 1.2mm 구멍의 디자인 레이어를 활성화합니다. 새 플랫폼에서 아크릴을 거꾸로 정렬하기 위해 직사각형의 반대쪽 모서리에 두 개의 추가 구멍을 가공합니다. 아크릴을 뒤집고 가공 된 기둥이있는 어댑터 위에 양면 접착 테이프로 테이프로 붙입니다.
설계 소프트웨어에서 반대면의 구멍 설계가 포함 된 파일을 엽니 다. 시약 입구 및 출구 구멍의 나머지 절반을 직경 1.5mm, 깊이 0.7mm로 밀링합니다. 아크릴 직사각형 시트를 이소프로필 알코올로 모두 청소하고 증류수로 헹굽니다.
아크릴을 초음파 욕조에 10 분 동안 담그십시오. 아크릴 시트를 모두 말리고 양면 테이프로 유리 페트리 접시 뚜껑 안쪽에 테이프로 붙입니다. 그런 다음 유리 페트리 접시의 바닥을 더 큰 유리 페트리 접시 안에 넣습니다.
페트리 접시의 바닥에 클로로포름 1 밀리리터를 붓고 아크릴 시트로 뚜껑을 빠르게 놓습니다. 즉시 더 큰 페트리 접시의 바닥에 증류수를 페트리 접시 뚜껑 높이까지 추가합니다. 아크릴을 클로로포름 가스에 1 분 동안 노출시킵니다.
그런 다음 페트리 접시를 기울여 물개를 깨고 즉시 페트리 접시를 발견하십시오. 접착을 위해 두 아크릴을 클로로포름이 노출 된면과 마주보고 정렬하고 샌드위치를 형성하십시오. 아크릴을 프레스에 2 분 간격으로 놓고 아크릴의 정렬을 변경하십시오.
그런 다음 순간 건조 액체 접착제로 장치의 각 구멍에 2-3 센티미터의 호스를 부착하십시오. 주사기를 사용하여 채널을 증류수로 채 웁니다. 장치를 초음파 욕조에 10 분 동안 담그십시오.
그런 다음 장치 채널 내부의 물을 비우고 주사기를 사용하여 5%BSA 용액을 도입합니다. 5%BSA에 있는 7.5 마이크로미터에 직경의 철 미립자의 현탁액을 준비하십시오. 칩과 마이크로입자 현탁액을 블로킹 용액과 함께 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다.
그런 다음 측면 채널 출구 호스를 통해 주사기 바늘로 미립자를 칩에 삽입합니다. 칩을 수직으로 놓은 다음, 칩을 90도의 2단계로 회전시켜 미세입자가 5 마이크로미터 제한에서 표적 및 압축되도록 한다. 아크릴 장치의 모든 호스를 열로 밀봉하십시오.
몇 밀리미터 만 남을 때까지 입구 호스를 자릅니다. 분배 바늘에 세척 버퍼를 채우고 절단 된 호스에 삽입하십시오. 용액이 떨어지도록 한 다음 바늘을 장치에 연결하십시오.
측면 채널에서 배출 호스를 자른 다음 주사기 펌프에 연결하십시오. 그런 다음 주 채널 출구 호스에 대해 동일한 절차를 반복하십시오. 그런 다음 칩을 자석에 부착하십시오.
면역검출을 위해, 세척 완충액을 시간당 50 마이크로리터로 10분 동안 흐르게 한다. 마이크로피펫으로 분배 바늘에서 남은 세척 완충액을 제거하고 50마이크로리터의 나노입자 현탁액을 추가합니다. 나노입자 현탁액을 시간당 100 마이크로리터의 유속으로 7분 동안 유동시킨다.
그런 다음 유속을 시간당 50 마이크로 리터로 변경하고 15 분 동안 흐름을 계속하십시오. 분배 바늘을 교체하고 동일한 속도로 10분 동안 세척 버퍼를 흐릅니다. 마이크로피펫으로 분배 바늘로부터 남은 세척 완충액을 제거하고 100 마이크로리터의 플루오로제닉 기질을 첨가한다.
기질 입력, 형광 측정 및 세척 단계에 대한 유량 및 시간 파라미터를 조정합니다. 플루오로 생성 기질의 입력 흐름을 시간당 50 마이크로 리터에서 6 분 동안 활성화시킵니다. 기판 흐름이 멈추기 15초 전에 현미경의 형광을 켭니다.
기판이 1, 000 밀리 초의 노출 시간으로 멈추기 10 초 전에 현미경 카메라의 소프트웨어로 이미지 캡처를 시작하십시오. 기판 세척이 중지 된 직후 원하는 유량 매개 변수의 시작 버튼을 클릭하십시오. 초당 1프레임으로 6분 동안 이미징을 수행합니다.
선택한 측정 흐름이 중지된 직후 세척 흐름의 시작 버튼을 클릭합니다. 라이소자임 접합 나노입자 및 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 접합 2차 항체를 면역분석에 사용하였다. 상이한 농도의 1차 항체에 대한 형광 강도의 증가가 트랩 전후의 영역을 비교하여 관찰되었고, 이는 기질 형광의 변화가 1차 항체의 농도에 정비례한다는 것을 보여준다.
1차 항체의 주어진 농도에 대해, 형광 강도는 플루오로제닉 기질의 상이한 유속에서의 시간의 함수로서 플롯팅되었다. HRP 효소에 의한 기질의 전환 능력은 유속에 반비례하였고, 시간당 1 마이크로리터의 유속에 대해 최대 강도가 얻어졌다. 다양한 1차 항체 농도에 대한 상이한 유속에 대해, 면역반응 후 및 전의 형광 차이의 곡선은 밀리리터당 1, 000 나노그램의 농도에 대해, 모든 평가된 유속에 대해 형광이 포화된다는 것을 보여주었다.
검량선은 각 유속에 대한 1차 항체의 농도에 대하여 얻어진 형광 강도의 차이의 최대값을 사용하여 제조하였다. 시간당 1 마이크로 리터의 높은 가변성과 높은 형광 수준은 속도가 반응 기질의 흐름을 선호하지 않고 트랩 직후에 축적되는 경향이 있음을 시사했습니다. 클로로포름에 대한 노출은 온도에 매우 민감하기 때문에 마이크로 채널의 밀봉 단계에 특별한주의를 기울여야합니다.
재현 가능한 결과를 얻으려면 온도가 항상 동일해야 합니다. 당사의 시스템은 미세입자의 소형화 및 크기, 나노입자 크기, 항원, 검출 항체 및 기질이 나노입자 기반 미세유체 면역분석에서 검출 한계를 결정하는 요인인 위치를 이해하는 데 도움이 됩니다.
