바다 말미암 독소 상호 작용은 독소의 큰 다양성과 풍부함을 얻고 특정 독소의 빠른 동정을 얻기 위해 최소한의 유기체와 효율적인 프로토콜을 사용해야합니다. 우리는 다량의 단백질로 조 추출물을 제조하고 재현 가능하고 구체적이며 빠르며 저렴한 분석을 설명하여 바다 말미잘독에서 용혈 및 포스포릭 염기를 확인하는 두 가지 효율적인 기술을 결합했습니다. 상기 방법은 하나 또는 두 가지 유형의 시세포분해신을 동정하기로 결정되는 거의 모든 예에서 사용될 수 있다.
이 방법의 효율성은 조 추출물을 준비하는 동안 각 단계에서 시간을 관리함으로써 달성됩니다. 용혈의 핵심은 기계적 용해를 피하기 위해 적혈구를주의 깊게 취급하고 인두 분해 분석에서 플레이트 준비 온도를 관리하는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 Santos Ramirez-Carreto 박사, 생물 학자 Sandra Salazar Garcia, 생물 학자 Giovanni Macias Martinez가 될 것입니다.
먼저 수집된 바다 말미잘인 A.doi를 증류수로 손으로 세척하여 신체에 부착되는 큰 기질 입자를 제거한다. 즉시 72 시간 동안 울트라 냉동고에서 영하 80도에서 유기체를 동결시킵니다. 그런 다음 유기체를 48 시간 동안 동결 건조 조건으로 동결 건조를위한 특수 안경에 넣으십시오.
조직 수분 공급을 위해, 동결건조된 유기체의 건조 중량 20그램을 50밀리몰 인산나트륨 완충액 60밀리리터와 하나의 억제제 칵테일 정제로 재구성한다. 마그네틱 교반기에서, 샘플을 약 800RPM과 네 °C에서 12시간 동안 연속적으로 교반한다. 세포 용해 및 선충류 배출을 유도하기 위해 샘플을 영하 20도에서 12 시간 동안 동결시킨 후, 용기를 90 %까지 해동 될 때까지 실온에서 물에 넣고이 과정을 세 번 반복하십시오.
추출물을 명확히 하기 위해, 샘플을 섭씨 4도에서 40분 동안 25, 400배 G에서 원심분리한다. 상층액을 회수하고 다시 원심분리한다. 이 단계를 서너 번 반복하고 마침내 상청액을 회수하십시오.
회수된 상청액 또는 조추출물은 독 성분 및 지질, 탄수화물 및 핵산과 같은 다른 세포 분자를 함유한다. 상용 브래드포드 비색 분석 키트를 사용하여 조 추출물의 단백질 농도를 결정한다. 샘플을 진탕 없이 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다.
이어서, 595 나노미터에서 흡광도를 측정하였다. 샘플 BSA 흡광도의 평균을 플롯하고 그래프의 방정식을 결정하며, 여기서 y는 흡광도, m은 선의 기울기, x는 단백질 농도, b는 원점에 대한 누진이다. 조 추출물을 분석하기 위해, 단백질을 변성시키기 위해 단백질 로딩 버퍼의 다섯 마이크로리터에 조 추출물의 30 마이크로그램을 첨가한다.
최종 부피는 50 마이크로리터 미만이어야 한다. 한 시간 30분 동안 25밀리암페어에서 일정하게 전기영동을 실행합니다. 겔 단백질의 확산을 피하기 위해, 단백질에 고정 용액을 첨가하고, 80RPM에서 진탕하면서 실온에서 40분 동안 인큐베이션한다.
이어서, 용액을 데칸트하고 단백질 가교 용액을 첨가한다. 실온에서 30분 동안 진탕하면서 80 RPM에서 인큐베이션한다. 용액을 제거하고 5 분 동안 100 밀리리터의 증류수로 겔을 세척하십시오.
그런 다음 물을 제거하고 이 절차를 네 번 반복하십시오. 실온에서 실험실 회전 발진기에서 60RPM으로 교반하는 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 여과 용액 50 밀리리터로 단백질 염색을 15분 동안 수행하십시오. 양의 경정맥에서 한 밀리리터의 혈액을 추출하고 주사기에서 바늘을 제거하십시오.
즉시 50 밀리리터의 Alsever 용액이있는 튜브에 혈액을 배출하고 섭씨 4도에서 5 분 동안 804 배 G에서 원심 분리하십시오. 상청액을 버리고 튜브의 내벽을 따라 밀어 30 밀리리터의 Alsever 용액을 첨가하십시오. 파스퇴르 플라스틱 피펫을 사용하여 펠렛을 천천히 재현탁시키고 용액을 섭씨 4도에서 5분 동안 804배 G에서 다시 원심분리한다.
상청액이 명확해질 때까지이 과정을 반복하십시오. Alsever 용액의 최종 부피를 유지하여 밀리리터 당 약 2 백만 세포의 농도를 달성하십시오. 그런 다음 Neubauer 챔버 또는 혈구 측정기를 사용하여 세포를 계수하십시오.
용액 혼합물을 흔들지 않고 섭씨 37도에서 한 시간 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트를 섭씨 4도에서 5분 동안 804배 G에서 원심분리한다. 평평한 바닥을 가진 다른 96-웰 플레이트에서 상청액을 회수하십시오. 조 추출물에 세포 분해신이 포함되어 있으면 적혈구가 용해되어 헤모글로빈을 방출합니다.
415 나노 미터에서 흡광도를 읽고 적혈구의 50 %에서 용혈을 일으키는 추출물의 양을 계산하십시오. 바다 말미잘의 조 추출물의 양을 늘리고 적절한 소프트웨어를 사용하여 시그모이드 조정으로 플롯을 설계하십시오. 닭고기 달걀 1개를 증류수에 1%SDS로 씻고 멸균 상태에서 달걀 흰자위와 달걀 노른자를 분리합니다.
용액 A, B, C 및 D를 준비합니다.용액 B에 500 마이크로리터의 용액 A와 C를 추가하고 100 마이크로리터의 용액 D.Mix를 넣고 25 밀리리터를 각 페트리 접시에 붓습니다. 용액이 멸균 조건에서 응고 될 때까지 기다렸다가 얇은 튜브로 직경이 약 두 ~ 세 밀리미터 인 우물을 만드십시오. 한 웰에 음성 대조군으로서 총 20 마이크로리터의 인산염 완충액을 첨가하고, 다른 웰에 양성 대조군으로서 결정된 포스포리파아제의 20 마이크로리터를 첨가한다.
상이한 양의 조추출물 단백질 5, 15, 25, 35, 및 45 마이크로그램을 나머지 웰에 놓고, 각각 20 마이크로리터의 최종 부피로 놓는다. 섭씨 37도에서 20 시간 동안 배양하십시오. 바다 말미잘의 조 추출물을 얻기 위해 사용 된 프로토콜의 대표적인 결과는 동결과 해동의 교반과 사이클이라는 두 가지 기술을 결합하여 선충류의 효율적인 배출을 일으킨다는 것을 보여주었습니다.
자극 전후의 선충세포가 여기에 표시됩니다. 선충 낭종 세뇨관은이 이미지에 노출되어 독소 방출을 나타냅니다. 바다 말미암 조추출물의 전기영동 프로파일이 여기에 도시되어 있다.
바다 말미암 조 추출물은 SDS-PAGE 15% 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였고, 10 킬로달톤에서 250 킬로달톤의 분자량까지 단백질을 나타내었다. 여기서, 레인 1은 단백질 사다리이고 레인 2는 바다 말미잘독이다. 시토리신은 15킬로달톤 및 20킬로달톤의 분자량 영역에서 검출되었다.
여기에 표시된 것은 양으로부터의 적혈구에서의 용혈 분석이다. 동결 및 해동 주기 전과 동안 추출물의 용혈 활성은 마지막 두 사이클에서 총 조 추출물 단백질의 50 마이크로그램으로 100% 용혈까지 증가하였다. 50 % 양 적혈구를 용해시키는 데 필요한 양은 밀리리터 당 11.1 0.3 마이크로 그램입니다.
포스포리파아제 활성은 조추출물 샘플이 적용된 한천 플레이트의 영역에서 투명한 후광의 형성에 의해 검출되었다. 결과는 총 단백질의 15 마이크로그램으로부터 포스포리파아제 활성의 존재를 보여준다. 할로의 직경이 용량 의존적 방식으로 증가하였다; The diameter of the halo increased in a dose-dependent manner; 즉, 조 추출물의 양이 증가하면, 할로의 직경이 증가하였다.
절차를 시도하는 동안 선충류 배출을 유도하고, 총 단백질을 정량하고, SDS-PAGE 전기영동으로 조 추출물을 분석하고, 용혈의 50 %를 생산하는 조 추출물 단백질의 양을 계산하고, 포스포리파아제 분석에서 다른 양의 단백질을 사용하십시오. 우리는 프로테오믹 기술로 조 추출물을 분석하여 생명 공학 및 생물 의학에서 큰 관련성을 가진 폴리펩티드를 확인하고 고유 한 분자를 프로파일 링하고 특성화 한 다음 실험실에서 생산하여 적용 할 수 있습니다. 우리는 인간 완결한 폐 암종 상피 세포에서 항종양 활성을 갖는 수행 단백질의 서열의 일부를 수득하였다.
마찬가지로, 우리는 생명 공학 관심의 포스포리파아제의 서열을 확인합니다.
