이 프로토콜은 종양 세포 확장을위한 기초를 제공하여 종양 세포 기능 및 게놈 상태에 대한 심층적 인 연구를 가능하게합니다. 또한, 면역 반응에 대한 종양의 영향을 평가하기 위한 시험관내 모델 시스템을 제공한다. 이 기술의 주요 이점은 환자 조직으로부터 중피 종양 라인을 확립하기 위한 기반 프로토콜을 제공한다는 것이다.
현재 이 모델 시스템에 대한 표준화된 프로토콜은 없습니다. 이 기술의 가장 어려운 측면은 초기 통과 배양에서 섬유 아세포 오염의 존재입니다. 섬유아세포 기아 시도가 효과가 있는지 여부를 결정하기 위해 섬유아세포 대 종양 세포 형태학에 대한 확실한 이해를 갖는 것이 중요합니다.
효소 칵테일을 소화하는 종양 10 밀리리터를 해리 튜브로 옮기는 것으로 시작하십시오. 종양 조직 조각을 멸균 메스를 사용하여 멸균된 여섯 웰 플레이트 뚜껑으로 옮깁니다. 새로운 멸균 메스와 포셉을 사용하여 모든 지방 괴사 조직과 혈전을 제거하십시오.
전체 종양 조직을 하나의 입방 밀리미터 작은 조각으로 자릅니다. 조직이 마르지 않도록 500 마이크로리터의 멸균 행크의 밸런스드 솔트 용액 또는 HBSS를 종양 조직에 첨가하십시오. 종양 단편을 효소 칵테일을 소화하는 종양 10 밀리리터가 들어있는 해리 튜브로 옮깁니다.
튜브를 단단히 닫으십시오. 뚜껑을 조직 해리기에 옆으로 내려 놓고 해리기에 열을 공급하십시오. 해리기에서 섭씨 37도 인간 종양 해리 키트 설정 1로 미리 프로그래밍된 설정을 선택하고 10분 후 상태를 확인하여 깜박이는 빨간색 표시등에 막힘 오류가 표시되지 않도록 합니다.
한 시간 후, 해리 튜브를 제거하고 층류 후드에 놓습니다. 50 밀리리터 원뿔형 튜브 상에 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 배치하고 10 밀리리터 피펫을 사용하여 소화된 종양을 필터 상에 피펫팅함으로써 소화된 종양을 여과한다. 필터가 막히면 새 필터로 전환합니다.
해리 튜브를 10 밀리리터의 신선한 종양 소화 매체로 헹구고 필터를 통해 씻으십시오. 필터를 제거하고 버립니다. 종양 소화 배지로 총 부피를 40 밀리리터로 가져 오십시오.
실온에서 5분 동안 500 x g에서 원심분리한다. 진공 소스에 부착된 두 밀리리터 흡기 피펫을 사용하여, 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인하고, 10 밀리리터의 멸균 종양 배지를 사용하여 세포를 재현탁시킨다. 이어서, 다시, 튜브를 원심분리하고, 시연된 바와 같이 상청액을 흡인한다.
다음에, 세포를 세 밀리리터의 멸균 종양 배지에 재현탁시키고, 세포 현탁액을 멸균된 여섯 웰 플레이트의 한 웰로 옮긴다. 플레이트를 인큐베이터에 5 % 이산화탄소로 37도 보관하십시오. 24시간 후, 사용된 배지를 웰 하나에서의 소화된 종양으로부터 동일한 여섯 웰 플레이트의 새로운 웰로 옮긴 다음, 세 밀리리터의 멸균 종양 배지를 웰 하나에 첨가한다.
반전 위상 현미경을 사용하여 초기 계대 배양에서 섬유아세포 오염의 비율을 결정한다. 섬유아세포 오염이 초기 계대 배양에서 세포의 20%를 초과하는 경우, 종양 배지를 환원된 혈청 배지로 교체한 후 배양을 계속한다. 섬유아세포 집단이 10% 이하로 감소되지 않으면, PBS로 웰을 부드럽게 헹구어 혈청을 함유하는 배지를 제거한다.
여섯 웰 플레이트에 웰 당 한 밀리리터의 트립신을 넣으십시오. 여섯 웰 플레이트 또는 플라스크를 섭씨 37도의 인큐베이터에 한 분 동안 놓습니다. 인큐베이터에서 플레이트 또는 플라스크를 제거하고 거꾸로 된 현미경을 사용하여 세포의 접착력을 확인하십시오.
세포가 부분적으로 들어 올리거나 떠있을 때, 부드럽게 부유 한 세포와 트립신 만 제거하십시오. 세포를 동일하거나 더 큰 부피의 완전한 종양 배지를 함유하는 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 넣는다. 서너 개의 분획이 제거될 때까지 트립신화를 반복한다.
모든 독립적인 분획을 실온에서 5분 동안 500 x g에서 원심분리한다. 진공 소스에 부착 된 두 밀리리터 흡기 피펫을 사용하여 펠렛을 방해하지 않고 상청액을 흡인하십시오. 다섯 밀리리터의 멸균 환원 혈청 배지를 사용하여 세포를 재현탁시킨다.
세포를 각 분획에 대해 T-25 플라스크에 플레이트하고 플라스크를 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓습니다. 초기 통과 세포의 냉동 보존을 위해, 분취된 동결 배지의 한 튜브를 해동시킨다. 먼저 플레이트를 PBS로 세척하고 이전에 입증된 바와 같이 트립신을 첨가함으로써 트립신화에 의해 세포를 수집한다.
플라스크를 섭씨 37도의 인큐베이터에 3 분 동안 두십시오. 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 거꾸로 된 현미경을 사용하여 세포의 접착력을 확인하십시오. 세포가 들어 올리거나 떠 다니는 경우, 부드럽게 부유 한 세포와 트립신을 제거하십시오.
세포를 동일하거나 더 큰 부피의 완전한 종양 배지를 함유하는 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 넣는다. 부드럽게 피펫팅하여 튜브의 내용물을 혼합하십시오. 계수를 위해 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 제거한다.
그 후 남은 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 500 x g에서 원심분리한다. 세포가 회전할 때, 트리판 블루 또는 아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물과 같은 실험실 특정 계수 프로토콜을 사용하여 계수하십시오. 원심분리에 이어 세포를 동결 배지에서 최소 5 x 10 밀리리터의 동결 배지 당 여섯 번째 세포로 재현탁시키고, 이 세포 현탁액 중 1밀리리터를 미리 표지된 1.5 밀리리터의 동결로 옮긴다.
냉동 장치를 제어 된 속도 동결 챔버에 놓고 즉시 영하 80도까지 옮깁니다. 이 그림은 섬유아세포 오염이 없는 배양물에 비해 80%50%와 30%의 섬유아세포 오염이 증가하는 것을 보여준다. 이 도면은 음성 대조군으로서 4개의 원발성 중피종 종양 라인, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H 및 흑색종 종양 라인, MEL526의 대표적인 유세포 표면 염색을 보여준다.
이들 세포주는 메소텔린 및 N-카데린 둘 다를 발현할 수 있다. 표면 단백질 마커 발현에 대한 효소 분리의 영향을 시험하는 것의 중요성은 트립신과 프로테아제 콜라게나제 혼합물 모두 N-cadherin의 표면 발현의 손실을 초래한 반면, CD90은 영향을 받지 않았기 때문에 또한 나타난다. 중요한 단계에는 소화 전에 혈액과 지방을 제거하고, 섬유 아세포 오염을 확인하고, 섬유 아세포의 과성장을 제한하는 방법을 결정하는 것을 포함하여 종양의 적절한 처리가 중요합니다.
이 절차를 따르는 중요한 방법에는 환자 유래 종양 세포를 인식하는 자가 T 세포의 능력을 시험하기 위한 세포독성 림프구 분석이 포함된다. 이 기술은 치료적으로 중요할 수 있는 새로운 항종양 특이적 T-세포 수용체를 동정할 것이다. 또한, 종양과 짝을 이룬 종양 침윤 림프구 및 면역 기능 장애 사이의 상호 작용을 연구 할 수있게 해줍니다.
