효소 결합 면역 흡착 분석을 사용한 Anopheles 모기의 Plasmodium sporozoites 검출

ELISA 기술은 높은 감도와 특이성으로 모기 매개체에서 말라리아 기생충을 검출하는 데 매우 유용하며 동시에 많은 샘플을 처리할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구원은 샘플 처리 준비가 될 때까지 모기 샘플을 보관할 수 있으며 종 특이적 단클론 항체를 사용하여 Plasmodium 종을 구별할 수 있습니다. 모기의 머리와 흉부를 복부에서 분리하여 샘플을 준비하고 사전 라벨이 부착된 1.5밀리리터 원심분리기 분쇄 튜브에 넣습니다.

각 튜브에 50마이크로리터의 분쇄 버퍼를 추가하고 유봉으로 샘플을 균질화합니다. 250 마이크로 리터의 분쇄 버퍼로 유봉을 헹구고 용액을 튜브에 추가하여 최종 부피를 300 마이크로 리터까지 만듭니다. circumsporozoite 단백질을 위한 ELISA 플레이트를 준비하고 sporozoite ELISA 워크시트를 작성합니다.

PBS에서 항체 용액을 준비하고 플레이트당 5밀리리터의 용액을 추가합니다. 50 마이크로리터의 항체 용액을 ELISA 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 접시에 뚜껑을 덮고 실온에서 30분 또는 하룻밤 동안 배양합니다.

우물에 용액을 흡입하고 종이 타월에 접시를 다섯 번 두드려 액체를 제거합니다. 웰 플레이트에 200마이크로리터의 차단 완충액을 넣고 뚜껑으로 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 배양하고 우물 내용물을 흡인합니다.

다시 종이 타월에 접시를 두드려 액체를 제거합니다. 50 마이크로리터의 포지티브 컨트롤을 H 1 및 H 2 웰에 추가합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 차단 완충액을 G에 행 C의 열 1 및 2의 웰에 추가합니다.50 마이크로 리터의 양성 대조군을 G 1 및 G 2 웰에 추가합니다.

G 1 및 G 2에서 시작하여 F 1 및 F 2까지 C 1 및 C 2까지 양성 대조군을 순차적으로 희석합니다. 50 마이크로 리터의 네거티브 컨트롤을 웰 A 1, A 2, B 1 및 B 2에 추가합니다. 50 마이크로 리터의 균질화 용액을 추출하고 미지의 우물에 첨가하십시오.

접시를 덮고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 기판 A와 B를 1:1의 비율로 혼합하여 기판 용액을 제조합니다. 각 플레이트에 5mL의 working conjugate 항체 용액을 추가하여 필요한 부피를 결정합니다.

1.5 밀리리터 튜브에 있는 100 마이크로리터의 기질 용액에 5 마이크로리터의 과산화효소 표지 항체 용액을 첨가하여 과산화효소 활성을 평가합니다. 우물 내용물을 흡인하고 종이 타월에 접시를 거꾸로 올려 액체를 제거합니다. 200마이크로리터의 PBS Tween으로 우물을 두 번 세척합니다.

우물 내용물을 흡입하고 접시를 다섯 번 두드립니다. 50 마이크로리터의 과산화효소 표지 항체 용액을 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 배양합니다.

우물 내용물을 흡인하고 종이 타월에 접시를 다섯 번 두드립니다. 200마이크로리터의 PBS Tween으로 우물을 세 번 세척하고 내용물을 흡인한 다음 플레이트를 다섯 번 두드립니다. 각 웰에 100마이크로리터의 기판 용액을 추가합니다.

접시를 덮고 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 배양 후, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405 - 414 나노미터에서 흡광도를 판독합니다. 컷오프보다 높은 값으로 흡광도가 있는 시료를 양수로 라벨링하고 표준물질을 사용하여 시료의 CSP 농도를 결정합니다.

용액 농도에 대한 흡광도 값을 플로팅하여 표준 곡선을 생성합니다. 선형 회귀 방법을 사용하여 최적 피팅을 결정합니다. CSP 농도를 결정하기 위해 양성 샘플에 대한 각 흡광도 값의 방정식을 풉니다.

ABTS로 ELISA를 30분 동안 수행한 후, 우물에 희미한 녹색이 나타나 sporozoite 감염을 감지할 수 있었습니다. 양성 대조군은 우물에서 어떠한 색상 변화도 보이지 않았습니다. 네거티브 웰과 포지티브 웰에 대한 흡광도 값이 결정되었습니다.

양성 우물은 차단 임계값보다 높은 흡광도 값을 나타냈고, 음극 대조군은 상당히 낮은 값을 보여주었습니다. 또한, 알려지지 않은 다른 80개의 우물의 흡광도 값도 얻어졌습니다. 실선은 음성 대조군 우물의 평균 흡광도를 나타내고 점선은 양성 임계값을 나타냅니다.

표준 곡선을 이용하여, 웰 A 7에서의 CSP 농도는 마이크로리터당 0.35 피코그램으로 결정되었으며, 이 ELISA 처리 단계는 비특이적 벡터를 방지하기 위해 신속하게 수행되어야 한다. 또한 모든 샘플과 용액은 미생물 성장을 방지하기 위해 냉장고에 보관해야 합니다. 연구자들은 PCR과 같은 다른 방법으로 양성 검출을 확인하는 것이 좋습니다.

이렇게 하면 특히 유일한 판독값이 임계값보다 높을 때 신뢰도가 크게 향상됩니다. 이 기술을 통해 연구자들은 모기의 감염 가능성에 대한 대규모 조사를 수행할 수 있었으며, 이는 주요 매개체를 식별하는 데 중요합니다.