이 절차의 목표는 크리스탈 바이올렛 염색 및 항균 감수성 테스트를 통해 표준 페그 뚜껑 생물막 장치를 폴리프로필렌 딥 웰 생물막 장치와 비교하는 것입니다. 표준 페그 뚜껑 생물막 장치에는 96개의 못이 있으며 표준 96웰 마이크로타이터 플레이트 위에 장착되므로 높은 처리량의 생물막 실험이 가능합니다. 페그 뚜껑은 생물막 성장을 위한 표면을 제공하고, 못 상에서 성장한 생물막은 하류 실험에서 추가로 분석될 수 있다.
그러나 플레이트는 최대 200 마이크로 리터의 부피를 사용하므로 더 많은 양의 생물막을 요구하는 실험을 사용하여 생물막 형성 및 바이오 매스를 연구하는 것이 더 어려워집니다. 여기에서, 우리는 정적 생물막을 성장시키기 위한 깊은 우물 생물막 장치를 설명한다. 딥 웰 생물막 장치는 페그 뚜껑으로서 세미 스커트된 96-웰 PCR 플레이트가 장착된 96-웰 딥 웰 마이크로타이터 플레이트를 이용한다.
이 방법은 750 마이크로리터의 최대 플레이트 부피를 허용하고, 생물막 성장을 위해 더 많은 페그 표면적을 제공하며, 표준 생물막 장치에 비해 비용이 낮다. 우리는 생물막 바이오매스를 결정하기 위해 생물막의 크리스탈 바이올렛 염색을 위한 프로토콜뿐만 아니라 MBEC라고도 알려진 최소 생물막 박멸 농도의 결정을 설명하고 비교할 것이다. 도시된 것은 설명될 실험의 개략적인 개요이다.
원하는 박테리아 균주를 냉동 보존 스톡으로부터 영양 한천 플레이트 상에 직접 줄무늬. 아가 플레이트를 최적의 균주 조건으로 하룻밤 동안 배양한다. 다음날, 단일 콜로니를 다섯 밀리리터의 성장 배지에 접종하고 하룻밤 사이에 배양기에서 배양물을 성장시킨다.
생물막 플레이트는 도시된 바와 같이 채워질 것이다. 외부 우물을 750 마이크로 리터의 멸균수와 750 마이크로 리터의 멸균 성장 배지로 부정적인 통제 우물로 채 웁니다. 나머지 웰을 675 마이크로리터의 멸균 성장 배지로 채운다.
야간 배양을 600나노미터의 1.0에서 광학 밀도로 표준화합니다. 마이너스 세 희석에 도달할 때까지 10배 희석 시리즈를 생성한다. 배지 웰에 10 내지 10의 마이너스 3 희석 배양물을 접종하여 최종 박테리아 희석액을 마이너스 네 개로 하고, 최종 총 웰 내 부피는 750 마이크로리터로 한다.
조심스럽게 페그 뚜껑을 생물막 플레이트에 삽입하십시오. 플레이트를 24시간 동안 160RPM의 최대 진탕으로 최적의 변형 조건에서 인큐베이션한다. 생물막 성장 플레이트로부터 페그 뚜껑을 조심스럽게 제거하고, 웰 당 800 마이크로리터의 멸균 PBS로 채워진 새로운 깊은 웰 플레이트에서 생물막을 헹구었다.
페그 뚜껑을 0.1 부피 %의 웰 당 800 마이크로리터의 크리스탈 바이올렛을 함유하는 새로운 깊은 웰 플레이트로 옮기고 5분 동안 염색할 수 있게 한다. PBS로 채워진 신선한 깊은 웰 플레이트에서 뚜껑을 다시 헹구어 과도한 얼룩을 제거하였다. 뚜껑을 생물 안전 캐비닛에서 10 분 동안 건조시킨 후 웰 당 30 % 금욕 산 800 마이크로 리터로 채워진 깊은 우물 플레이트에서 못을 5 분 동안 얼룩지게하십시오.
못 뚜껑을 제거하고 완전히 섞어서 얼룩을 고르게 분산시킵니다. 딥 웰 생물막 장치에서 200 마이크로리터를 표준 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮기고 550 나노미터에서 광학 밀도를 판독한다. 상기 항균성 챌린지 플레이트는 도시된 바와 같이 제조될 것이다.
외부 우물을 750 마이크로 리터의 멸균수와 750 마이크로 리터의 성장 매체로 양성 및 음성 제어 우물로 채 웁니다. 나머지 웰을 원하는 항균 희석 계열의 750 마이크로리터로 채운다. 조심스럽게 장치에서 페그 뚜껑을 제거하고 PBS 웰 당 800 마이크로리터로 멸균 된 깊은 웰 플레이트에서 헹구십시오.
페그 뚜껑을 항균 챌린지 플레이트로 옮기고 원하는 노출 시간 동안 인큐베이션한다. 항균 노출 플레이트로부터 페그 뚜껑을 무균적으로 제거하고 멸균된 PBS 충진 플레이트 깊숙한 웰에서 헹구십시오. PBS로부터 페그 뚜껑을 제거하고 웰 당 750 마이크로리터의 회수 배지를 함유하는 새로운 깊은 웰 플레이트로 옮긴다.
플레이트를 초음파 처리 수조에서 30 분 동안 초음파 처리하십시오. 페그 뚜껑을 제거하고 오염을 피하기 위해 고정되지 않은 표준 고정되지 않은 평평한 상단 마이크로 타이터 플레이트 뚜껑으로 교체하십시오. 최적의 균주 조건에서 하룻밤 동안 배양한다.
다음 날, 깊은 우물 플레이트에서 표준 마이크로타이터 플레이트로 200 마이크로리터를 옮기고 600 나노미터에서 광학 밀도를 판독한다. 크리스탈 바이올렛 염색은 박테리아 생물막의 바이오매스를 근사화하는 효과적이고 널리 사용되는 방법이다. 표준 및 딥 웰 장치의 크리스탈 바이올렛 염색은 두 박테리아 종 모두 표준 생물막 장치에 비해 2.1배 더 많은 바이오매스를 형성하는 에스케리치아 콜리를 갖는 표준 장치와 비교하여 딥웰 장치에서 바이오매스를 유의하게 더 많이 성장시키고 슈도모나스 aeruginosa는 4.1배 더 많은 바이오매스를 형성한다는 것을 보여주었다.
이러한 결과는 깊은 우물 생물막 장치의 증가 된 표면적이 증가 된 바이오 매스 축적을 허용 할 것이라는 우리의 가설과 일치했습니다. 깊은 우물 장치 상에서 성장하는 두 균주 모두에 대한 기술적 복제 CV-염색된 값의 더 큰 변동성에도 불구하고, 쌍 방향 양방향 ANOVA 또는 P 값이 0.05보다 큰 학생용 T-검정을 사용하여 두 종의 생물학적 반복실험에 대해 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다. 이 발견은 깊은 우물 장치에 의한 생물막 형성이 표준 장치와 유사한 재현 가능한 생물막을 형성한다는 것을 보여준다.
표준 및 딥 웰 장치 사이의 부피 및 페그 표면적에 대한 생물막 바이오매스를 표준화한 후의 우리의 결과는 시험된 두 박테리아 종 사이의 약간이지만 유의한 물질 선호도를 나타냈다. 폴리프로필렌 딥 웰 장치에서 슈도모나스 aeruginosa는 바이오매스 형성의 1.4배 상대적 증가를 입증하였고, 에스케리치아 콜리는 폴리스티렌 표준 장치에서 관찰된 역효과와 함께 바이오매스 형성의 1.52배 상대적 감소를 입증하였다. 생물막 장치 페그 물질에 대한 박테리아 종 선호도의 이러한 차이는 결과가 생물막 장치 간에 교차 비교될 수 없다는 것을 나타낸다.
24시간 생물막의 항균성 챌린지는 박테리아 생물막 형성의 효과적인 억제제로 알려져 있는 4차 암모늄 화합물 벤잘코늄 클로라이드를 사용하여 시험하였으나 생물막 박멸에 대해서는 덜 효과적인 항균성이다. 우리의 결과는 깊은 우물 생물막 장치로부터 얻은 BZK BMEC 값이 표준 생물막 장치에서의 성장과 비교했을 때 에스케리치아 콜라이의 경우 평균 여섯 배, 녹농균의 경우 여덟 배 증가한다는 것을 보여주었다. BZK MBEC 결과는 생물막 박멸에 덜 효과적인 항균제이기 때문에 예상대로 더 가변적이었고, 더 높은 농도에서 생존한 몇 개의 이상치 생물막 못으로 인해 두 장치에서 에스케리치아 콜리 MBEC 값에 대한 범위를 초래했다.
우리는 또한 박테리아 생물막 박멸에 매우 효과적인 항균으로 알려진 소독제 표백제를 비교했습니다. 표백제는 두 종의 딥 웰 장치와 비교하여 표준 장치에서 테스트 할 때 약간 더 높은 MBEC 값을 보여 주었고, 에스케리치아 콜라이의 네 배 증가와 녹농균의 두 배 증가로 이어졌습니다. 그러나, 이러한 차이는 장치 간의 재현 가능한 오차의 범위 내에 있었고, BZK보다 훨씬 적은 가변성을 입증하여, 표백제를 생물막 박멸에 더 효과적인 항균제로서 확인했다.
각 생물막 장치의 주요 한계는 못의 상이한 플라스틱 조성 및 이들 표면에 대한 상이한 박테리아 종의 부착성 및 바이오매스 형성에서의 결과적인 가변성일 것이다. 추가적으로, 상이한 항균제와 플라스틱 페그 물질 사이의 화학적 상호작용 및 상용성은 기술된 프로토콜을 수행하기 전에 고려되어야 한다. 결론적으로,이 프로토콜과 깊은 우물 및 표준 생물막 장치에 대한 우리의 바이오 매스 비교로부터의 결과는 둘 다 표준 장치보다 페그 표면적 당 훨씬 더 많은 바이오 매스를 제공하는 깊은 우물 장치로 견고한 에스케리치아 콜리 및 슈도모나스 aeruginosa 생물막을 재배 할 수 있음을 보여줍니다.
딥 웰 바이오필름 장치는 다운스트림 분석을 위해 더 많은 양의 생물막이 필요한 정적, 고처리량 생물막 재배 및 스크리닝 연구를 위한 실행 가능하고 저렴한 대안을 제공합니다. 각 장치 간의 플라스틱 재료 조성의 차이로 인해 CV 염색 생물막 바이오매스와 MBEC 값은 장치 간에 직접 비교할 수 없습니다. 그러나 동일한 장치에서 실험이 일관되게 수행되면 분리 물과 항균제 사이에서 얻은 결과가 비교 가능합니다.
깊은 우물 생물막 장치는 저비용 재료를 사용하여 높은 처리량의 분석에서 생물막을 연구하려는 실험실에 권장됩니다.
