이 프로토콜은 세포막에 특이적인 새로운 pH 민감성 형광 지질 프로브의 특성화 및 응용을 설명하며, 이를 통해 연구자들은 살아있는 세포에서 엑소 및 세포내이입(endocytosis)을 모니터링할 수 있습니다. pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 기반으로 하는 막 단백질에 대한 대부분의 이전 기자는 간접적입니다. 지질 모방제로서 ND6는 세포막에 통합되어 지질막 이동을 충실하게 보고합니다.
ND6 프로브는 생물학적 멤브레인 환경에 내장된 경우에만 형광이 됩니다. 이 프로브의 형광 강도는 피페라진 헤드 그룹의 양성자화 및 탈양성자화와 상관관계가 있습니다. 따라서 낮은 pH에서 훨씬 더 강하게 형광을 발합니다.
엑소사이토시스(Exocytosis)와 엔도사이토시스(endocytosis)는 많은 신호 분자의 분비와 흡수의 기초가 되는 유비쿼터스 과정입니다. 따라서 ND6는 세포 생물학 및 생물 의학의 몇 가지 근본적인 질문을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 학생인 Haley, Oliver, Jonathan입니다.
살아있는 세포 형광 이미징을 위한 온도 제어 및 용액 입력 출력을 허용하는 이미징 챔버를 준비하는 것으로 시작합니다. 프로그래밍 가능한 장치를 설정하여 관류 용액을 전환하고 이미징 중에 정의된 시점에 전기 자극을 전달합니다. 적절한 양의 ND6을 계량하십시오.
디메틸 설폭사이드에 녹이고 실온에서 용해되도록 합니다. 그런 다음 용액을 간단히 초음파 처리합니다. 0.22마이크로미터 필터를 사용하여 원액을 여과하여 큰 염료 응집체를 제거합니다.
기존 또는 마이크로 부피 분광 광도계를 사용하여 405 나노 미터에서 염료 농도를 측정합니다. 적용하기 전에 원액을 목욕 용액을 사용하여 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 희석하십시오. 원액을 어두운 곳에서 실온에 보관하십시오.
ND6 원액을 마이크로리터당 1마이크로그램의 최종 농도로 배양 배지에 첨가하고 배양하여 엔도솜과 같은 세포내이입된 막 구획을 유비쿼터스 라벨링합니다. 시냅스 소포 표지의 범위를 줄이려면 자발적인 신경 활동을 약리학적으로 억제합니다. 원고에 기술된 바와 같이 시냅스 소포를 선택적으로 라벨링한 후, 세포가 포함된 커버 슬립을 이미징 챔버에 장착합니다.
온도 센서, 관류 입력 및 진공 팁을 이미징 챔버에 연결합니다. 관류 속도를 초당 약 0.2밀리리터로 조정하고 배양액에서 과도한 ND6을 제거하기 위해 NBQX 및 DAP5가 포함된 예열된 일반 타이어 용액의 관류를 시작합니다. 초점을 조정하고 연결된 신경돌기를 포함하는 건강하고 잘 퍼진 뉴런이 포함된 적절한 시야를 찾습니다.
해결되지 않은 디콜로이드가 포함된 영역을 피합니다. 노출 시간이 다른 ND6 로드 세포를 이미징하여 최상의 이미징 설정을 식별해 보십시오. 자극 및 관류 프로토콜, 프레임 간격 및 총 지속 시간을 텍스트 원고의 정보를 사용하여 설정합니다.
동기화된 자극 및 관류와 함께 이미지 획득을 시작합니다. 이미징 중 자극 및 용액 교환을 모니터링합니다. 이미징이 끝난 후 관류를 중지합니다.
커버 슬립을 제거하고 다음 시험을 위해 이미징 챔버를 청소합니다. 모든 이미지 파일을 백업하고 전자 사본을 만듭니다. 데이터 추출을 위한 분석 프로그램을 선택하고 엽니다.
이미지 스택을 열거나 분석 프로그램으로 가져옵니다. 바이너리 마스크를 생성한 후 적절한 면적 크기와 원형도를 가진 입자 분석 함수를 사용하여 세포막, 엔도솜, 리소좀 또는 시냅스 부톤에 해당하는 관심 영역(ROI)을 구합니다. 시야 내의 cell-free 영역에서 4개의 배경 ROI를 선택합니다.
그런 다음 선택한 모든 ROI를 저장합니다. ND6 타임랩스 이미지 스택 내의 모든 프레임을 정렬합니다. 첫 번째 이미지를 참조로 설정하고 나머지는 엄격한 정합을 사용하여 정렬하면 XY 드리프트로 인한 아티팩트가 완화됩니다.
그런 다음 정렬된 이미지 스택을 저장합니다. 저장된 ROI를 정렬된 ND6 이미지 스택에 적용합니다. 이미지 스택의 모든 프레임에서 모든 ROI에 대한 ND6 형광의 평균 픽셀 강도를 측정합니다.
그런 다음 통계 분석을 위해 결과를 내보냅니다. 배경 ROI의 평균 강도를 계산하여 선택한 모든 ROI에서 차감할 기준 잡음을 구합니다. 정규화의 경우 100%로 정의되는 최대 형광 강도를 얻기 위해 pH 5.5 tyrode 용액을 적용하는 동안 선택한 모든 ROI에 대해 가장 높은 3개의 평균 강도를 평균화합니다.
50밀리몰 염화암모늄을 적용하는 동안 선택한 모든 ROI에 대해 가장 낮은 3개의 평균 강도를 평균하여 정규화의 경우 0%로 정의된 최소 형광 강도를 설정합니다. 자체 0% 및 100% 농도를 기준으로 모든 ROI에 대한 상대적 형광 변화를 계산합니다. 개별 ROI 데이터에서 평균 형광 변화, 반응 역학 변화 및 기타 값 또는 플롯을 도출할 수 있습니다.
신경 세포에 ND6를 로드한 후 신경 돌기를 따라 밝은 녹색 형광 반점이 보였습니다. ND6와 FM464 형광 강도 사이의 강한 상관관계는 ND6에 의한 시냅스 소포 염색을 시사했습니다. 전기 자극과 높은 칼륨 자극 모두에 대한 반응으로 ND6 형광의 감소가 관찰되었으며, 이는 ND6가 시냅스 소포막에 존재하고 시냅스 소포 내강이 방출 중에 중화됨을 시사합니다.
철저한 전기 자극 하에서 M 베타 CD 치료는 ND 영상으로 측정한 시냅스 소포 방출 및 회수를 현저히 감소시켰으며, 이는 막 콜레스테롤이 시냅스 소포 엑소사이토시스(synaptic vesicle exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis)을 촉진한다는 것을 시사했습니다. Baf A1은 회수된 시냅스 소포의 재산성을 급성으로 차단하여 자극 후 ND6 형광 회복을 방지했습니다. 형광 현미경 검사에 대한 기본적인 이해는 필수입니다.
살아있는 세포 이미징을 지원하기 위한 생리학적 조건에 대한 신중한 계획은 매우 중요합니다. ND 원액의 농도를 정확하게 측정하는 것이 중요합니다. 가능하면 매번 사용하기 전에 원액 농도를 다시 측정하십시오.
사진 표백 및 프로브 분해를 방지하기 위해 직사광선을 피하십시오.
