요로 감염의 세로 후속 및 생물 발광 이미징을 사용하여 마우스에서의 치료

식민지 형성 단위의 열거성은 UTI 분야에서 연구의 재현성을 제한했다. 생물 발광 화상 진찰은 방광 생리학, UTI 병인 및 감수성에 대한 생체 내 UTI 연구에서 진행될 것입니다. 생물 발광 화상 진찰은 감염의 진화에 대한 실시간 통찰력으로 세로 후속을 가능하게합니다.

또한 필요한 동물의 수를 크게 줄입니다. 생물 발광 화상 진찰은 인간에서 빈번한 재발성 또는 만성 감염에 대한 연구를 용이하게합니다. 추가적으로, 연구원은 생체 발광 화상 진찰을 사용하여 혈액에 상승하는 감염 또는 보급을 확인할 수 있습니다.

카나마이신 황산염으로 보충된 LB 플레이트에 접종 루프를 가진 박테리아의 글리세롤 육수를 줄이고, 섭씨 37도에서 하룻밤을 배양하여 단일 콜로니를 얻습니다. 멸균 14 밀리리터 폴리스티렌 라운드 하단 튜브를 채우고, 이중 위치 스냅 캡과 5 밀리리터의 LB 국물을 가나마이신 황산염으로 보충합니다. 접종 루프가 있는 단일 세균 성 식민지를 선택하고 이를 LB 국물에 추가합니다.

10초 동안 소용돌이가 제대로 섞이도록 합니다. 하룻밤 사이에 37도의 오픈 포지션에서 스냅 캡을 정적으로 배양합니다. 인큐베이션 후, 세균 배양의 적절한 균질화를 보장하기 위해 튜브를 10 초 동안 소용돌이.

항생제없이 신선한 LB 배지의 25 밀리리터에 세균 현탁액의 25 마이크로 리터를 추가하여 Erlenmeyer에서 하위 문화를 확인합니다. 하룻밤 사이에 에를렌마이어와 문화를 정적으로 닫습니다. 설치 당일, 에를렌마이어의 문화를 50밀리리터 컬처 튜브와 원심분리기에 붓습니다.

상류제를 데칭하고 멸균 PBS의 10 밀리리터에서 세균 펠릿을 재중단하십시오. 튜브를 10초 동안 다시 소용돌이시다. 접종의 실험 농도를 선택하고 표준 곡선을 사용하여 600 나노미터에서 해당 OD를 결정합니다.

재중단된 세균 배양의 1밀리리터를 멸균 PBS의 9밀리리터에 첨가하고 원하는 OD 600 나노미터에 도달할 때까지 조절한다. 멸균 24 게이지 협경수 끝을 100 마이크로리터 주사기에 장착합니다. 준비된 세균용 용액으로 주사기를 채웁니다.

한 동물을 수핀 위치에 있는 작업 표면에 놓고 설치 시 코 콘을 사용하여 안정적인 이소플루란 마취를 유지합니다. 눈 연고를 바하십시오. 완만한 압축을 적용하고 suprapubic 지구에 원형 운동을 함으로써 잔류 소변을 추방한 다음 70%에탄올로 하복부를 청소합니다.

카테터 팁을 일반 식염수로 윤활합니다. 검지 손가락을 복부에 비 지배적 인 손에 넣고 부드럽게 위로 밀어 넣습니다. 요도의 카테터라이제이스화를 90도 각도로 수직으로 시작합니다.

저항이 발생하면 더 삽입하기 전에 수평으로 기울입니다. 세균 성 접종의 50 마이크로 리터의 느린 설치를 수행합니다. 설치 후 주사기와 카테터를 몇 초 더 제자리에 보관한 다음 천천히 후퇴하여 누출을 방지합니다.

실험 그룹당 카테터 1개를 사용하십시오. 동물을 코 콘의 척추 위치에 배치하여 이미징을 준비하고 실험 그룹당 하나의 카테터를 사용하여 이미징을 준비합니다. 필요한 경우 텍스트 원고에 언급 된 바와 같이 항생제 또는 실험 약물을 투여하십시오.

BLI 획득 소프트웨어를 열고 이미징 장치의 초기화를 클릭하여 카메라 및 스테이지 컨트롤러 시스템을 테스트하고 충전 결합 장치 카메라를 섭씨 90도까지 냉각합니다. 획득, 자동 저장 To.select 발광 및 사진을 클릭합니다. 여기 필터를 차단 및 방출 필터로 설정하여 기본 발광 설정을 확인하여 열기로 설정합니다.

첫 번째 이미지를 촬영할 때 노출 시간을 자동으로 설정합니다. 생체 내 측정 및 밝은 신호의 경우 노출 시간을 약 30초로 설정합니다. 포화 이미지로 인해 경고가 나타나면 노출 시간을 줄입니다.

중간 비닝, F/스톱 하나를 선택하고 올바른 FOV를 선택합니다. 마우스를 이미징할 때 피사체 높이를 1센티미터로 설정합니다. 최대 5마일의 이미지를 동시에 사용하고 반사를 방지하기 위해 라이트 배플을 사용하여 동물을 분리합니다.

문을 닫고 획득을 클릭하여 이미징 시퀀스를 시작한 다음 실험에 대한 자세한 정보를 입력합니다. 이미징 챔버에서 마우스를 제거하고 케이지로 돌려보냅니다. 마취 후 완전한 회복을 확인한 다음 케이지를 다음 이미징 주기까지 통풍랙으로 되돌리세요.

이미징 소프트웨어를 시작하고 찾아보기를 클릭하여 실험 파일을 로드합니다. 도구 팔레트를 사용하여 이미지의 색상 배율을 조정합니다. ROI 도구를 사용하여 이미지에 관심 영역을 그려 전체 영역을 커버할 수 있을 만큼 충분히 크지 않도록 하고 모든 이미지에 동일한 치수를 사용합니다.

그런 다음 ROI 측정을 클릭하여 빛의 강도를 정량화합니다. 설치 후 즉시 수득된 마우스의 후속 이미지는 20, 000 콜로니 성형 유닛 이상으로 견고하게 검출가능하고, 생체내 의 접종과 생체 발광의 식민지 형성 단위 사이의 선형 상관관계가 확립되었다는 것을 보여주었다. 요로 감염의 자연적인 진화는 어떤 처리를 수신하지 않은 대조군에서 공부되었습니다.

감염 운동학에 대한 항생제 치료의 효과는 항생제 치료 동물의 그룹에서 자세히 시각화되었다. 세균 부하의 즉각적인 감소, 총 광자 플럭스에 의해 측정, Enrofloxacin의 첫 번째 복용량 후 보였다. 치료된 동물 중 어느 것도 세균 부하가 후속으로 증가하지 않았습니다.

각 동물의 전체 세균 부하는 통나무의 곡선 아래 영역을 사용하여 총 광자 플럭스를 변형시켜 10일 동안 Enrofloxacin으로 치료된 동물과 치료되지 않은 동물 사이에 상당한 차이를 나타낸다. 이러한 결과는 BLI가 UTI 감염 운동학의 차이를 평가하는 데 사용될 수 있다는 개념증명을 제공합니다. 생물 발광 화상 진찰은 세균 또는 생화확적인 분석을 위한 오줌 견본의 정규 집합과 같은 그밖 방법과 결합될 수 있는 비침습적인 기술입니다 또는 실험을 위해.

여기에서 우리는 생물 발광 화상 진찰이 요로 감염의 질병 과정에 새로운 치료 전략을 평가하는 강력한 공구이다는 것을 보여주었습니다.