이 프로토콜은 유도 된 다능성 줄기 세포를 사용하여 인간의 폐 질환과 접시의 발달을 모델링하기 위해 폐 세포로 분화합니다. 이 프로토콜은 1 차적인 인간 폐 조직을 얻고 배양하기 어렵기 때문에 중요합니다. 만능 줄기 세포에서 폐 세포를 분화의 주요 장점은 인간의 폐 발달 과 질병을 연구하기 위해 특정 폐 세포의 지속적인 공급을 갖는 것입니다.
이 세포는 오랜 기간 동안 세포 배양에서 유지될 수 있고, 미래의 응용을 위해 냉동 보존될 수 있고, 유전자 돌연변이를 연구하기 위하여 유전으로 조작될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후보 인 레이첼 맥비카 (Rachel McVicar)가 될 것입니다. 실험을 시작하기 전에, 천천히 감소 성장 인자, 또는 GFR, 얼음에 지하 막 매트릭스 매체를 해동하고, 차가운 DMEM F12의 동일한 볼륨으로 희석.
사용 전에 냉장고에 P1000 팁을 놓습니다. 다음으로, 50%GFR 지하 멤브레인 매트릭스 배지의 500 마이크로리터로 12웰 플레이트의 각 웰을 코팅하고, 우물에서 임의의 초과 배지 혼합물 및 거품을 제거한다. 젖은 얼음 위에 우물 접시를 놓거나 냉장고를 섭씨 4도에 놓고 20 분 동안 설정한 다음 접시를 섭씨 37도 인큐베이터로 하룻밤 동안 옮습니다.
높은 PSE가 70%의 연결성에 도달하면 인간 유도만능 줄기 세포에 10개의 마이크로몰러 ROCK 억제제 Y27632를 추가하고 해리 전에 한 시간을 기다립니다. 미디어를 흡인하고 PVS로 세포를 한 번 씻으세요. IPSC를 잘 당 500 마이크로리터의 세포 분리 매체를 추가하고 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.
인큐베이션 후, 줄기 세포 통과 배지의 500 마이크로 리터를 잘 한다. P1000 팁을 사용하여 부드럽게 파이펫 셀을 사용하여 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 그런 다음 해리된 세포를 15 밀리리터 튜브및 원심분리기로 300회 G.Following 원심분리에서 5분간 전송하고, 배지를 흡습하고, 10마이크로몰러 ROCK 억제제로 보충된 mTeSR Plus 미디어의 1밀리리터로 세포 펠릿을 재연한다.
세포를 계산한 후, 12웰 GFR 중간 코팅 플레이트의 각 웰에 다섯 번째 IPSC에 2회 10을 추가하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한다. 다음 날, 최종 엔데름 또는 DE 유도 매체를 추가하기 전에 mTeSR 플러스를 흡인. 2일과 3일에 DE 유도 매체를 변경합니다.
4일째에는 DE 유도 매체를 세럼이 없는 기저매체로 대체하여 AFE 유도를 시작합니다. 6일 종료 후 AFE 효율을 분석하기 전에 3일간 매일 AFE 매체를 변경합니다. 7일째, GFR 지하 막 매트릭스 배지를 얼음위에 해동하여 나중에 사용한다.
동시에, AFE 매체를 흡입하고 PVS로 우물을 세척하여 폐 전구 세포 분화를 진행한다. 잘 세포 분리 용액 1 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 세포 분리 용액을 포함하는 Wells에 담금질 매체 1 밀리리터를 추가합니다.
셀을 위아래로 부드럽게 배관하여 응집체로 유지합니다. 모든 세포가 제거되었는지 확인하지만 원심 분리를 위해 15 밀리리터 원전 튜브로 5 분 동안 300 회 G로 옮기십시오. 상체를 제거하고 LPC 유도 매체에서 세포 펠릿을 다시 분리합니다.
세포를 계산하고, 차가운 GFR 지하 막 매트릭스 배지의 100 마이크로 리터에 다섯 번째 세포에 2.5 배 10을 추가하고 잘 혼합한다. 12웰 플레이트의 우물에 물방울을 넣고 섭씨 37도에서 30~60분 동안 배양합니다. 다음으로, LPC 미디어 1밀리리터를 음부당 추가하여 중간 낙하가 완전히 잠기고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양할 수 있도록 합니다.
8일째에는 LPC 배지를 변경하여 ROCK 억제제 Y27632를 제거합니다. 매일 미디어를 계속 변경하고 16일 말에 LPC 효율성을 분석하십시오. 17일, 우물을 씻고 밀리리터 디스파스당 2마이크로그램의 500마이크로리터를 추가합니다.
P1000 파이펫으로 디스파제 혼합물을 피펫하고 15분 동안 배양한 다음 혼합물을 피펫하고 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션에 따라, 담금질 매체의 1밀리리터를 우물을 포함하는 디스파에 넣고 세포를 원뿔관으로 옮기는다. 원심분리기를 냉각된 PVS의 1밀리리터로 환원분리한 다음 원심분리를 반복합니다.
그런 다음 세포 분리 배지의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 섭씨 37도에서 12분 동안 배양한 다음 담금질 매체와 원심분리기의 동일한 양을 다시 추가합니다. 담금질 매체의 1 밀리리터와 10 마이크로 몰라 ROCK 억제제 Y27632에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
셀 카운트를 수행하여 10번을 얻는 데 필요한 부피를 잘 당 4세포로 계산한다. 그런 다음 Aliquot는 LPC 세포 응집체의 부피를 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로, 300배G.Remove 에서 5분 동안 세포 펠릿을 교반하지 않고 과잉 슈퍼네티얼을 제거하고 10 마이크로리터의 잔류 매체를 남겼다. 감기 GFR 지하 막 매트릭스 배지의 200 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포 배양 막 삽입으로 세포를 전송한다.
섭씨 37도에서 30~60분간 배양하세요. 인큐베이션 후, 삽입물의 바소포탈 챔버에 3D 오르간성 유도 배지 1밀리리터를 넣고 6일 동안 매일 신선한 배지로 교체한다. 23일, 매체를 3D 분기 매체로 전환한 다음 6일 동안 격일로 배지를 변경합니다.
29일, 3D 성숙 매체로 변경하고, 앞으로 6일 동안 격일로 배지를 계속 교체한다. DE 유도의 4일째에, 연결된 세포는 소형 조약돌 형태를 표시합니다. 핵으로 오버레이된 결정적인 엔도름 마커 CXCR4 및 SOX17이 발현되어 내피 분화를 확인하였다.
전방 전경 유도는 7일째에 보다 단단히 압축된 세포를 보여주는 형태학으로 확인되었으며, 마커 FOXA2 및 SOX2는 핵으로 오버레이되었다. 3D 폐 전구세포의 생성은 리포터 세포주에서 NKX2-1 GFP의 3D 스페로이드 및 내인성 발현으로 확인되었다. 전체 폐 오르가노이드로 3 주 분화 한 후, 폐 마커는 면역 세포 화학에 의해 분석되었다.
핵에 의해 오버레이된 형태발생 SOX2 및 SOX9를 분기마커는 오르가노이드에서 관찰하였다. 기저 세포의 두 마커인 동축 폐 마커 P63 및 KRT5는 클럽 세포에 대한 마커인 SCGB3A2와 함께 성공적으로 검출되었다. 탈경 폐 마커는 알포올라 타입 II 세포를 위한 프로 SPC 및 SPB 마커를 유도하였다.
그리고 폐포 타입 I 세포의 HOPX 마커. 또한, NKX2-1 및 ZO1은 핵과 겹쳐진 발현되었다. 메센키메 폐세포 마커 PGFR 알파는 SOX9과 공동 발현된 섬유아세포에 대한 마커로, 불실의 메센키메를 나타냈다.
비멘틴도 발현되었고 폐 전체에 분산되었다. 이 절차에 따라 폐 오르가노이드는 유도된 다능성 줄기 세포유래 내피 및 면역 세포와 투자될 수 있다. 폐 발달 및 질병은 상피 세포 집단과 중간엽 세포 집단 사이 신호에 의해 또한 내피 세포 및 대식세포에서 생깁니다.
3D 폐 조직 모델 시스템은 인체 질환 및 치료법을 연구하는 데 임상적으로 관련이 있습니다.
