Name: pupal and adult injections for rnai and crispr gene editing in nasonia vitripennis
Uploaded: 2020-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis at JoVE.com

이 작품은 J.L.R.에 대한 1645331 O.S.A. 및 NSF/BIO 보조금으로 향하는 UCSD 스타트업 펀드에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

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JLR과 DCR은 ReMOT 제어 기술에 대한 잠정특허 보호를 신청했습니다. O.S.A.는 Agragene, Inc.의 창립자이며 지분 지분을 가지고 있으며 회사의 과학 자문위원회에서 근무하고 있습니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

최근 나소니아 비트리피스니체의 다양한 생물학적 질문2,3,7,17의모델 유기체로서 의외의 사용이 증가함에 따라, N. vitripennis 유전자의 기능 분석을 위한 단순화되고 효율적인 프로토콜을 가능하게 하기 위해 주입 방법을 개발하고 최적화할 필요가 있다. 유전자 편집 시약의 배아 미세 주입을 포함하는 현재 방법은 특수 장비 및 고도로 훈련된 인력을 필요로 하는13에도전적입니다. 따라서 유전자 편집 기술을 비전문 실험실에 더 쉽게 접근하려면 CRISPR 시약의 대체 전달 접근법을 개발하는 것이 중요합니다. 따라서, 여기서 입증된 상세한 시각적 기술은 곤충 혈청계 및 난소로 편집 시약(CRISPR/Cas9 또는 dsRNA)의 전달을 허용하는 두 가지 대체 주입 절차를 기술한다.
곤충 혈구에 dsRNA를 주입하는 것은 절지동물18,19,20,21,22의다양한 종에서 dsRNA를 전달하기 위한 일반적인 접근법이다. 이전에 보고된 바와 같이, 백색 푸파에 사용될 때 N. vitripennis에서도 효율적입니다3,7. 세균성 곤충 돌연변이 발생을 위한 CRISPR/Cas9 방법은 배아 미세 주입에 거의 전적으로 의존합니다. 님프 또는 성인에 CRISPR 시약을 전달하는 몇몇 성공적인 실험은12,23,24,25,26,27보고되었습니다. 전반적으로, 여기에 설명된 방법은 기존방법(13)과관련하여 많은 중요한 이점을 제공한다. 첫째, 그들은 N. vitripennis 말벌의 여러 발달 단계의 주입을 가능하게 : 흰색, 검은 강아지, 성인. 추가적으로, 혈류량으로 주입은 배아 미세 주입을 우회하여 CRISPR을 통해 RNAi 또는 생식선 유전자 편집을 통해 노크할 수 있습니다.
이 프로토콜의 첫 번째 단계는 관심의 기능적 테스트 (예를 들어, 게놈 편집, RNAi)에 기초하여 올바른 발달 단계에 대한 나소니아 말벌을 결정하고 선별하는 것입니다. 흰색과 어두운 강아지와 성인에서 남녀를 식별하는 데 익숙해지는 것이 중요합니다. N. vitripennis 여성은 블로우 플라이의 pupal 케이스에 최대 50 개의 알을 낳고, S. 불라타,말벌 강아지는 흰색 단계에서 시작하여 많은 수의 쉽게 수집하고 선별 할 수있습니다. 또한, 5°C에서 주 동안 개발 속도를 늦추기 위해 다양한 단계에서 pupae를 저장할 수 있는 가능성은 시간과 조직9측면에서 시스템을 매우 유연하게 만든다.
주입 후 강아지와 성인의 생존은 사용자가 최적화해야하는 측면이다. 예를 들어,이 프로토콜에서, 강아지에 CRISPR / Cas9 시약의 첫 번째 주입극적으로 생존에 영향을 (15%) 주입 된 성인의 생존에 비해 (90 %). 그러나, 두 번째 세션에서, 강아지 생존은 60 %까지 증가했다. 여러 번의 주사 세션 후 유사한 생존을 유지할 수 있었습니다 (80%-100%) 강아지 또는 성인을 주입 한 후. 실제로, 주사 후 생존은 말벌을 정렬하는 것과 관련된 파라미터가 바늘에 적합한 조리개를 선택하고, 바늘로 말벌을 관통하거나 찌르는 것을 피하는 것이 최적화된 경우 향상될 수 있다.
여기에 제시된 프로토콜에 근거하여 주사를 위한 pupae및 여성을 정렬하고 준비하는 것은, 사망을 감소시킬 수 있습니다. 더욱이, 슬라이드에 접착하여 움직이지 않는 강아지를 정렬하는 방법을 제시하면 주입 중에 움직이지 못하게 하기 때문에 사출 공정을 용이하게 할 수 있다. 따라서, pupae는 배아 미세 주입에 관여하는 단계의 시간이 많이 걸리는 특성을 극복하여 매우 빠르게 주입 될 수 있습니다. 또한, 구강 흡인기로 주사를 할 수 있기 때문에 유전자 편집 이벤트를 수행하기 위해 특수 장비가 필요하지 않습니다. 그러나, 이 기술은 말벌을 접착제에 적시에 배치할 것을 요구합니다. 그렇지 않으면 제대로 부착되지 않으며 바늘 삽입 중에 슬라이드에서 미끄러집니다. 정렬의 여러 시험 후 이 수정될 수 있습니다.
성인은 복부와 다리를 움직일 수 있기 때문에이 방법을 사용하여 정렬 할 수 없습니다. 따라서, 그들은 마취 될 필요가있다. 이 프로토콜에서 선호하는 방법은 말벌이 쓰러질 때까지 얼음에 말벌을 포함하는 튜브를 넣고 얼음에 미리 차가운 슬라이드로 그룹으로 옮기는 것입니다. 이 방법을 사용하면 10-15 말벌의 그룹으로 주입을 위한 말벌의 정렬 및 준비를 가능하게 하며, 각 새로운 주사 그룹에 대한 얼음을 함유하는 새로운 페트리 접시를 사용할 수 있습니다. 주입 중에 얼음이 녹는 것을 방지하면 슬라이드를 안정적으로 유지하고 바늘을 부러 뜨리거나 실수로 말벌을 죽일 위험을 줄이는 데 도움이됩니다. 이 단계는 액세스 가능한 경우 냉각 테이블을 사용하여 개선할 수 있습니다.
또는, CO2 패드는 말벌을 마취하는 데 사용할 수 있습니다. 이를 위해서는, 주사 중CO2에 노출되는 시간을 최적화하고 다른종(18)에대해 이전에 보고된 바와 같이 생존과 불임에 대한CO2 노출의 효과를 결정해야 할 것이다. 성인을 주입 할 때 한 가지 추가 장애물은 주입을위해 마취 된 말살을 유지하는 데 사용되는 방법에 의존합니다. 피어싱하거나 찌르는 위험없이 말뚝을 잡을 수있는 무딘 뾰족한 물체가 가장 적합합니다. 일반적으로 해부 바늘이나 무딘 집게가 잘 작동합니다.
말벌의 정렬 및 적절한 보유가 마스터된 후, 사출 공정이 매우 빠르게 진행될 수 있다. Pupae 및 성인 주사는 사용자의 취향에 따라 다른 농도에서 준비를 용이하게, 나노 리터의 수백의 범위에서 용액 볼륨으로 주입 될 수있다. 그러나, 손상 하 고 말하의 위험 없이 액체의 정확한 금액을 주입 하는 적절 한 바늘을 사용 하는 것이 중요 하다. 일반적으로, 아주 작은 조리개를 가진 아주 긴 바늘은 강아지의 복부에 더 적은 물리적 손상을 일으키는 원인이 되기 때문에 낫습니다. 더욱이, 액체의 흐름은 느리고, 압력의 큰 변화를 피하고 가장 중요한 것은 바늘에 의해 생성된 구멍을 통해 용액의 누설을 방지한다는 것입니다.
작은 조리개단점은 말벌의 단단한 외골격을 만질 때 바늘이 쉽게 부러질 수 있고 또한 복부 안쪽에서 물질로 막힐 수 있다는 것입니다. 따라서 작은 조리개 바늘은 펨토젯이나 나노젝트(nanoject)를 사용하여 매우 잘 작동하며, 그 사용은 이를 깨는 것을 피하기 위해 세심한 주의가 필요합니다. 이 바늘은 작은 조리개를 통해 입으로 액체를 주입하는 것이 매우 어렵기 때문에 입 흡인기에게 적합하지 않습니다. 이 방법의 경우 이상적인 바늘은 큰 조리개 바늘로 발생할 수있는 손상을 방지하면서 용액이 원활하게 흐를 수있는 최소한의 조리개를 필요로합니다. 다시 말하지만, 이 측면은 사용자가 최적화해야 합니다. 어쨌든 바늘을 자주 바꾸는 것은 생존과 효율성을 감소시키는 팁을 막히고 손상시키는 것을 피하는 데 도움이 됩니다.
N. vitripennis에서 복부에 있는 어떤 장소는 혈몰리엄으로 시약을 전달하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그러나, 추가 주의 해야 하 스 하 스 백의 ovipositor에 손상을 방지 하기 위해 이 먹이 및 계란 누워에 사용 됩니다. 강아지와 성인 모두에 대 한, 고정 기술은 ovipositor에서 멀리 주입을 허용 하기 위해이 프로토콜에서 제안 되었습니다., 주로 복부의 전방 부분을 향해 복부 지역에서. 또한, 성인에서, 이것은 또한 측면 또는 등쪽 지역에 주입 하 여 달성 될 수 있다. 본 명세서에 기재된 pupae에 대한 정렬 방법은 측면 주사를 용이하게 할 수 있지만 등쪽은 용이하지 않을 수 있다. 어쨌든, 다른 신체 부위를 관통하거나 복부를 손상시키는 것을 방지하기 위한 노력이 우선순위입니다.
바늘이 삽입되면 액체의 흐름이 느리고 일정해야합니다. 펨토젯은 각 바늘에 압력을 조정해야 할 수도 있지만 이를 쉽게 허용합니다. 입 흡인기를 사용하는 경우, 주사의 모공을 통해 누출될 수 있기 때문에 너무 빨리 많은 양의 액체를 주입하는 것을 피해야 한다. 사실, 액체로 부종을 관찰 하는 것 외에도, 누설은 주사를 중지 하는 표시. 주사가 끝나면 성인 말벌이 복구된 다음 호스트가 있는 튜브로 옮겨질 때까지 슬라이드에 남아 있어야 합니다.
여기에 제시 된 시스템은 쉽게 계란 미세 주입에 대한 특히 어려운 다른 곤충 종에 적응 할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 기생 말벌은 다른 곤충 애벌레에 알을 낳는다. 따라서 계란은 그 종에 도달하고 주입하는 것은 불가능합니다. 아시아 감귤류 psyllid Diaphorina citri와 같은 다른 해충 종의 계란은 또한 그들이 누워있는 식물에 부착되어 있기 때문에 주입에 도달하기가 매우 어렵습니다. 최근 보고서에 따르면 BAPC는 아시아 감귤류 psyllid, D. citri27에서CRISPR 유전자 편집에 사용될 수 있음을 시사한다. 유사하게, P2C 매개 전달 단백질, mCherry, 이종(28)의난소에서 수행되었으며, 여기에 설명된 이러한 주입 기술은 광범위한 곤충 해충 종에서 RNAi 및 CRISPR의 구현을 용이하게 하고 그들과 관련된 작물 손상을 방지하는 데 도움이 되는 방제 전략을 설계하는 데 도움이 될 수 있음을 시사한다.
다른 종의 구현은 관심있는 종의 수명 주기에 따라 최적화가 필요합니다. 예를 들어, 관심의 기능적 시험에 기초하여 주사의 올바른 단계를 설정하는 것이 중요하다. 따라서, CRISPR/Cas9를 난소로 전달하는 것은, vitellogenesis가난소(24,25,26,27,28)에의한 유전자 편집 시약의 섭취를 허용하는 것이 활성화되어 있는지 아는 것이 중요하다. 대조적으로, 효율적인 녹다운을 위해, 유전자가 발현되고 기능적일 때아는 것이 중요합니다. 그 주입 기술의 미래 구현은 곤충 혈류와 난소로 플라스미드 DNA와 같은 핵산의 다른 모형의 납품을 관련시킬 수 있었습니다. 이것은 플라스미드 DNA에 존재하는 유전자의 일시적인 발현을 승진시키는 가능하게 합니다. 또한 CRISPR/Cas 시약을 템플릿 DNA와 결합하면 상동성 지향 수리(HDR)를 통해 전염을 중재하거나 트랜스포슨 매개 전염을 유도하여 배아 미세 주입을 우회할 수 있습니다. 결론적으로, 이 향상된 기술은 RNAi를 통한 녹다운, 돌연변이 유도, 삭제 및 아마도 트랜스제닉 N. vitripennis를생성하기 위해 트랜스진 삽입과 같은 많은 종류의 기능 적 분석을 생성하는 데 사용할 수 있으며, 이는 이 유기체에서 기능 연구를 크게 가속화해야 합니다.

CRISPR/Cas9 유전자 편집은 기능성 유전 연구를 위한 강력한 기술이며, 특히 보석 말살, 나소니아 vitripennis와같은 많은 상승 모델 유기체에서. 사육의 용이성과 완전한 게놈의 가용성은 보석 말벌이 다른 생물학적 과정의 분자 메커니즘을 해명하기위한 중요한 실험 시스템입니다. 예를 들어, N. vitripennis는 최근에 haplodiploid 성 결정 시스템1,2,B 염색체3,4,5,6의생물학의 후성 유전학 적 기초를 해명하는 데 사용되었으며, circadian 및 계절 적조절7,8에대한 유전적기초가있다. N. vitripennis와 함께 작동 하도록 설정 하는 기능 중 일부는 짧은 세대 시간 포함 (~25°C에서 주), 높은 재생 속도, pupal 단계에서 쉽게 섹스 분리, 그리고 4°C에서 균주를 저장 하는 능력. 라이프 사이클은 여성 말벌이 블로우플라이, 사코카하 불라타의새끼를 기생시키는 것으로 시작됩니다. 그들의 ovipositor를 통해, 암컷은 블로우 플라이의 pupal 케이스에 50 개의 계란까지 누워. 계란은 S. bullata pupa에 먹이애로 발전하고, 앞으로 며칠 동안 계속 발전하고, 그 후에 강아지, 성숙한 백과기 및 호스트 puparium9에서출현에 선행됩니다.
RNA 간섭(RNAi)10 및 CRISPR/Cas911,12와같은 N. vitripennis에서기능성 유전 연구를 수행하는 분자 도구는 사용할 수 있지만, 주로 배아 미세주입을수행하는 데 어려움이 있기 때문에 제한된다. N. vitripennis 계란 개발을 위한 pupal 호스트를 필요로 하기 때문에, 계란 조작은 매우 도전. 전 -blastoderm 단계 배아는 호스트 블로우플라이 푸파에서 수집되어야하며, 신속하게 마이크로 주입하고 즉시 개발13을위해 호스트로 다시 옮겨져야 한다. 이러한 단계는 미세 주입 된 배아 또는 pupal 호스트(13)를손상시키지 않도록 정밀하고 전문적인 훈련이 필요합니다. 더욱이, 계란은 매우 작고 깨지기 쉬운, 특히 미세 주입 후, 주입 바늘의 지속적인 막힘을 일으키는 매우 점성 세포질(13). 이러한 기능은 배아 미세 주입을 매우 어렵게 만들며, 대부분의 N. vitripennis 실험실에서 결석한 고도로 훈련된 작업자와 특수 장비를 필요로 합니다.
CRISPR 시약의 전달을 위한 대체 주입 방법의 최적화는 모델 유기체로서 N. vitripennis의 통합에 기여할 것입니다. 강아지와 성인의 조작은 배아를 조작하는 것보다 덜 도전적이며 기본 주사 설정으로 달성 될 수 있습니다. 여기서, 두 가지 프로토콜은 푸파와 성인의 주사를 위해 기술된다: 주사를 위한 특수 한 장비를 관련시키는 하나, 및 유리 모세관 바늘을 장착한 아스피레이터 튜브 어셈블리의 사용을 관련시키는 다른. 흡구관의 사용은 배아 미세 주입을 위한 특수한 장비에 접근할 수 없는 실험실에 특히 적합합니다. 백색 또는 검은 새끼와 성인 말벌을 포함하여 N. vitripennis의다른 발달 단계의 효율적인 주사가 입증됩니다. 흰색 푸팔 단계에서 말벌은 RNAi 중재 녹다운 실험에 특히 적합합니다. 나소니아에서 RNAi는 처음 린치와 Desplan에 의해 설명 되었지만 200610,RNAi 주사가 수행 되는 방법에 대 한 사용할 수 있는 시각적 절차. RNAi는 최근에 B 염색체 PSR (아버지 성비율)3의 haploidizer 유전자를 발견하고 N. vitripennis 생물학적 리듬7에서시계 유전자, 기간의참여를 연구하기 위해 사용되었다.
검은 강아지와 성인 말벌은 ReMOT 제어를 사용하여 CRISPR / Cas9 생식선 유전자 편집을 유도하는 데 사용할 수 있습니다 (화물의 수용체 매개 난소 트랜스듀션) 및 BAPC (분지 수륙 양용 펩티드 캡슐) 프로토콜. 이들 2개의 난소 전달 방법은 최근에 표적 유전자, 신나바르7,12에서생식선 돌연변이를 생성하기 위한 나소니아에서 효과적이기 위하여 기술되었다. 여기서, 간단한 프로토콜은 특수 장비를 필요로하고 배아 미세 주입을 우회하지 않고, 나소니아에서 기능적 유전학 연구를 생성하고 다른 기생 말벌에서 가능성이 있는 pupal 및 성인 주사 모두에 대한 단계별 방법론의 시각적 절차를 포함하는 주사를 위해 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile</td><td>Sigma</td><td>960-97693-083</td><td></td></tr><tr><td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Can also use Borosilicate or Quartz</td></tr><tr><td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>BAPC</td><td>phoreus biotech</td><td>BAPtofect-25 0.5 mg Kit</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Protein with NLS</td><td>PNABio</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting needle</td><td>VWR</td><td>10806-330</td><td></td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Express programmable microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtotips Microloader tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Fine-tip paintbrush</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Flesh fly pupae,&amp;nbsp;&lt;em&gt;Sarcophaga bullata&lt;/em&gt;</td><td>Ward&#039;s Science</td><td>470180-392</td><td></td></tr><tr><td>Food colorant dye</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Test Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>Glue</td><td>Elmer&#039;s</td><td></td><td>washable, no toxic school glue</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 or P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr></tbody></table>

pupal and adult injections for rnai and crispr gene editing in nasonia vitripennis

보석 말벌, 나소니아 vitripennis,haplo-diploid 성 결정의 후성 유전학을 연구 하는 효율적인 모델 시스템 되고있다, B 염색체 생물학, 호스트 공생 상호 작용, speciation, 그리고 독 합성. CRISPR/Cas9를 포함하여 몇몇 분자 공구의 가용성에도 불구하고, 기능적인 유전 연구는 아직도 이 유기체에서 제한됩니다. N. vitripennis에 CRISPR/Cas9 기술을 적용하는 주요 제한은 배아 미세 주입의 도전에서 비롯됩니다. 배아의 주사는 작은 배아 크기와 배아 발달을 위한 호스트 강아지의 요구 사항 때문에 이 유기체 및 일반적으로 많은 기생말에서 특히 어렵습니다. 이러한 과제를 해결하기 위해 Cas9 리보뉴클레오단백질 복합체는 배아 미세 주입이 아닌 성인 주사에 의한 여성 난소로의 복합 전달을 최적화하여 체세포 및 헤플라일성 세균 편집을 모두 생성했습니다. 주사 절차는 ReMOT 제어 (화물의 수용체 매개 난소 트랜스듀션) 또는 BAPC (분기 수륙 양용 펩티드 캡슐)를 사용하여 pupae및 여성 말벌에 최적화되었다. 이 방법은 사이트 특정 및 유전 성 생식선 돌연변이를 가능하게 하는 배아 주입에 효과적인 대안으로 표시됩니다.

이 논문은 펨토젯 또는 흡기 튜브를 사용하여 pupal 및 성인 미세 주입을위한 두 가지 쉬운 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 RNAi 일관성에 중요한 액체를 보다 정밀하게 주입할 수 있지만 두 번째 방법은 나소니아 푸파또는 성인에게 더 많은 양의 액체를 주입할 수 있게 합니다.
표 1에 제시된 대표적인 결과는 좋은 생존율을 보여줍니다 (20%에서 89%). 그리고 힘든 계란 주사를 요구하지 않고 여기에 설명 된 주입 방법을 사용하여 원하는 표현형 (RNAi 또는 CRISPR을 통해 유전자 편집을 통해 노크 중 하나)를 얻기의 효율.
<table fo:font-size="7px" fo:keep-together.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">무대</td>
			<td rowspan="2">시약</td>
			<td rowspan="2">농도 ng/μL (단백질/gRNA 또는 dsRNA)</td>
			<td rowspan="2">N 주입</td>
			<td rowspan="2">N 생존 (%)</td>
			<td colspan="2">자손을 낳는 주입 된 개인</td>
			<td colspan="3">표현형을 가진 자손을 생산하는 주입된 개별</td>
			<td colspan="2">
노크다운/녹아웃 표현형을 보여주는 자손 </td>
		</tr>
<tr>
<td> N
</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>주입된 총 중 %</td>
			<td>자손을 생산하는 개인의 %</td>
			<td>N</td>
			<td>돌연변이/주입된 강아지 또는 성인</td>
		</tr>
<tr>
<td>화이트 푸파</td>
			<td>dsRNA*</td>
			<td>3000-4000</td>
			<td>80</td>
			<td>69 (86%)</td>
			<td>69</td>
			<td>100%</td>
			<td>45</td>
			<td>56%</td>
			<td>65%</td>
			<td>1263</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">블랙 푸파</td>
			<td>Cas9</td>
			<td>2903/2741</td>
			<td>39</td>
			<td>34 (87%)</td>
			<td>19</td>
			<td>49%</td>
			<td>2</td>
			<td>5%</td>
			<td>11%</td>
			<td>2</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>P2C-CAS9-EGFP**</td>
			<td>454/227</td>
			<td>40</td>
			<td>6 (15%)</td>
			<td>2</td>
			<td>5%</td>
			<td>1</td>
			<td>3%</td>
			<td>50%</td>
			<td>3</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>P2C-Cas9</td>
			<td>725/750</td>
			<td>28</td>
			<td>28 (100%)</td>
			<td>16</td>
			<td>57%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAPC</td>
			<td>500/200</td>
			<td>20</td>
			<td>11 (55%)</td>
			<td>9</td>
			<td>45%</td>
			<td>3</td>
			<td>15%</td>
			<td>33%</td>
			<td>5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAPC</td>
			<td>400/600</td>
			<td>20</td>
			<td>17 (85%)</td>
			<td>10</td>
			<td>50%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAPC</td>
			<td>360/360</td>
			<td>20</td>
			<td>16 (80%)</td>
			<td>16</td>
			<td>80%</td>
			<td>2</td>
			<td>10%</td>
			<td>13%</td>
			<td>3</td>
			<td>0.15</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">24 h-48-h-늙은 성인</td>
			<td>Cas9</td>
			<td>2769/3290</td>
			<td>11</td>
			<td>10 (90%)</td>
			<td>1</td>
			<td>9%</td>
			<td>0</td>
			<td>0%</td>
			<td>0%</td>
			<td>0</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
<tr>
<td>P2C-CAS9-EGFP</td>
			<td>454/227</td>
			<td>34</td>
			<td>30 (89%)</td>
			<td>12</td>
			<td>35%</td>
			<td>3</td>
			<td>9%</td>
			<td>25%</td>
			<td>3</td>
			<td>0.06</td>
		</tr>
<tr>
<td>P2C-Cas9</td>
			<td>2903/3076</td>
			<td>36</td>
			<td>36 (100%)</td>
			<td>17</td>
			<td>47%</td>
			<td>4</td>
			<td>11%</td>
			<td>24%</td>
			<td>4</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="12">*RNAi 실험은 그 때 비 주입 야생형 암컷에 짝짓기 된 남성에 수행되었다. 따라서 숫자는 자손을 생산하는 십자가의 수와 표현형을 생산한 십자가의 수를 재구성합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="12">** 저자에 의해 강아지에 매우 첫 번째 주입. 약어: dsRNA = 이중 좌초 RNA; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; BAPC = 분지 양용 펩티드 캡슐.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 퓨팔 및 성인 주사를 통해 RNAi 및 CRISPR/Cas9의 생존 및 효율 속도. RNAi 실험의 효율은 관심 유전자의 녹다운효율을 나타내며, 성비 왜곡3과같은 측정 가능한 효과를 부여한다. CRISPR/Cas9의 경우 효율성은 돌연변이 자손을 생산하는 주입된 여성의 수를 나타냅니다. 약어: dsRNA = 이중 좌초 RNA; gRNA = 가이드 RNA; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; BAPC = 분지 양용 펩티드 캡슐.

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Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

여기서, 우리는 NASOnia vitripennis에 있는 효율적인 pupal 및 성인 주사를 위한 방법을 태아 micro주입에 접근하는 대안으로, RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 유전자 녹아웃을 통해 RNA 침묵을 사용하여 관심있는 유전자의 기능적 분석을 가능하게 하는 방법을 기술합니다.

나소니아 vitripennis에서 RNAi와 CRISPR 유전자 편집을위한 푸팔과 성인 주사

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

pupal-adult-injections-for-rnai-crispr-gene-editing-nasonia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

5.2K 조회수.  University of California, San Diego. 여기서, 우리는 NASOnia vitripennis에 있는 효율적인 pupal 및 성인 주사를 위한 방법을 태아 micro주입에 접근하는 대안으로, RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 유전자 녹아웃을 통해 RNA 침묵을 사용하여 관심있는 유전자의 기능적 분석을 가능하게 하는 방법을 기술합니다. 

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

연구

유전학

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

샌드 플라이 (플레보토무스 파파타시) CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to their successful evolutionary radiation on the earth. The application of genetic tools such as genome editing is the key to understanding genetic changes that are responsible for evolutionary transitions in an Evo-Devo approach. In this article, we describe our current protocol for generating and maintaining mutant strains of T. domestica. We report a dry injection method, as an alternative to the reported wet injection method, that allows us to obtain stably high survival rates in injected embryos. We also report an optimized environment setting to mate adults and obtain subsequent generations with high efficiency. Our method underlines the importance of taking each species&#8217; unique biology into account for the successful application of genome editing methods to non-traditional model organisms. We predict that these genome editing protocols will help in implementing T. domestica as a laboratory model and to further accelerate the development and application of useful genetic tools in this species.

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We provide a detailed protocol for rearing, microinjection of eggs and for efficient mating of the firebrat Thermobia domestica to generate and maintain mutant strains after genome editing.

파이어 브라트 Thermobia 국내에서 게놈 편집을위한 계란 미세 주입 및 효율적인 짝짓기

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

발생학

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi는 Necromenic 선충류의 Microinjection에 의해 유전자 최저 및 Transgenesis을 중재 Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

생물학

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 옥수수 Planthopper, Peregrinus maidis, 배아의 미세주입

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

생체공학

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

나소니아 vitripennis에서 RNAi와 CRISPR 유전자 편집을위한 푸팔과 성인 주사

요약

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세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,