이 작업은 NSF 1257923 NIH 1U01NS10837에 의해 지원되었습니다. 저자는 실험실에서 장 왕의 도움을 인정하고 자합니다.

참고: 아래에 설명된 워크플로는 그림 2로요약되어 있습니다.
1. 진동 최소화
<ol><li>가능하면 장비가 1층에 있는지 확인하고 스프링 기반 절연 테이블을 사용하여 에어 테이블보다 더 넓은 범위의 진동 주파수를 약화시십시오.</li>
	<li>스프링 기반 테이블을 사용하는 경우 부동이 있는지 확인하십시오(테이블을 추가하거나 꺼낼 때마다 조정해야 합니다).</li>
	<li>필요한 경우 이미징 실에서 진동 기반 소음을 가능한 한 줄입니다. 관류 시스템의 유체 난류에서 발생하는 진동을 최소화하십시오. 참고: 신경 제제는 획득 하는 동안 이동 해서는 안 됩니다. 어떤 종류의 움직임은 다이오드를 가로 질러 대비 가장자리의 변화를 생성, 관절 신호로 이어지는. 시술이 취득 하는 동안 자극을 포함 하는 경우, 그것은 준비 움직임을 유도 하지 않아야.</li>
</ol>2. 핀홀 테스트를 실행하여 PDA 데이터와 신경절 사진의 적절한 정렬을 가능하게 합니다.
<ol><li>3 개의 작은 구멍이 현미경 슬라이드에 찌르는 알루미늄 호일 조각을 놓습니다. 파초점 포토포트에 장착된 디지털 카메라로 세 개의 구멍의 이미지를 촬영합니다.</li>
	<li>PDA와 함께 제공되는 이미징 소프트웨어를 사용하여 짧은 파일(예: 5s)을 획득합니다. 인수를 통해 테이블을 탭하여 핀홀 의 가장자리 주위에 매우 볼 수 있는 진동 아티팩트를 유도하여 핀홀의 이미지가 광학 데이터와 정확하게 정렬될 수 있도록 합니다.</li>
	<li>메뉴 항목 "디스플레이 | 에서 발견되는 이미징 소프트웨어에서 중첩 기능을사용합니다. 페이지 중첩 | 외부 이미지 | 트레이스를 겹쳐 이미지를 겹쳐서다이오드 데이터를 핀홀 의 사진에 오버레이한 다음 핀홀이 다이오드 데이터의 핀홀 아티팩트 바로 위에 앉을 때까지 사진의 x, y 및 배율 설정을 반복적으로 조정합니다.<ol>
<li>이 숫자를 저장하여 향후 실험에서 카메라로 촬영한 준비 이미지를 다이오드 데이터와 정렬합니다. 참고: PDA의 핀홀 정렬은 PDA가 현미경에 장착된 후에 한 번만 수행되어야 하며, 회전하거나 제거할 때까지 다시 수행해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3종의 해양 위장종에 대한 해부
<ol><li>트리토니아와 압리시아와같이 큰 크기로 자라는 종의 경우, 더 얇고 불투명한 간질이 적은 작은 개인으로 시작하여 최적의 신호 대 소음을 위한 충분한 빛을 확보합니다.</li>
	<li>해부 및 이미징 실험을 위한 식염수로 사용할 수 있는 인공 해수를 준비하십시오. 참고: 프로토콜의 모든 후속 단계에서 "식염수"는 인공 바닷물을 나타냅니다.</li>
	<li>트리토니아 디오메데아 의 해부
	<ol>
<li>동물을 냉장고에 약 20분 간 놓아 마취합니다.</li>
		<li>큰 동물의 경우, 한 손에 동물을 잡고 머리를 덮는 "목"을 노출시키는 것으로 뇌를 노출합니다. 작은 동물의 경우, 뇌를 노출하기 전에 왁스 줄 지어 해부 접시에 등쪽 측면을 고정합니다.</li>
		<li>해부 가위를 사용하여, 동물의 등쪽 쪽에 3-4cm 중간 선 절개를, buccal 질량 위의 (신체 벽을 통해 느낄 수 있습니다). 참고: 융합된 양자 간 세레브로플루알 과 페달 신경리아로 구성된 CNS의 필요한 부분은 주황색이며 주변 조직과 는 구별됩니다. 그것은 즉시 코뿔소에 후방과 buccal 질량 꼭대기에 놓여있다.</li>
		<li>포셉과 미세 절 가위를 사용하여 동물의 몸을 내면으로 하는 신경을 분리하여 CNS를 절제하여 중앙 신경을 연결하는 모든 신경을 그대로 유지합니다. 페달 신경 3 (PdN3)의 긴 길이를 두고, 또는 어느 신경이 자극 될 것인가.</li>
		<li>미누티엔 핀을 사용하여 CNS를 식염수로 채워진 엘라스토머 라이닝 접시의 바닥에 부착하여 추가 해부를 합니다. 연동 펌프를 사용하여 피드백 제어, 인라인 펠티에 냉각 시스템으로 전달된 식염수로 접시를 인퍼프하여 11°C에서 준비 온도를 유지합니다.</li>
		<li>집게와 미세 절 가위를 사용하여 CNS 주변에서 결합 조직의 느슨하게 준수 층을 조심스럽게 제거하십시오. 미세한 칼집을 간리아에 밀접하게 고수하십시오.</li>
		<li>간략하게(~10s)는 식염수의 0.5% 글루타랄데히드용용으로 간통을 담급니다. 식염수가 만연한 엘라스토머 라이닝 접시에 검정을 다시 배치하여 식염수가 VSD 염색을 시작하기 전에 글루타랄데히드를 씻어내도록 합니다. 참고: 결합 조직과 본질적인 근육의 이 가벼운 수정은 화상 진찰 도중 운동을 방지하는 것을 도울 것입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아플라시아 칼리포니카 의 해부
	<ol>
<li>약 40g의 동물을 심층 표면(foot)을 통해 체내에 350mM MgCl2의 ~20mL를 주입하여 마취한다.</li>
		<li>핀을 사용하여 동물 성 복부 면을 왁스 라이닝 해부 접시에 올려 놓습니다.</li>
		<li>해부 가위를 사용하여 발의 가장 앞쪽 정도를 따라 2-3cm 의 중간 선 절개를 합니다. 절개 양쪽에 있는 발의 플랩을 고정하여 CNS 및 buccal 질량의 일부를 드러냅니다. 참고: 융합된 대뇌 신경담으로 구성된 CNS의 필요한 부분은 밀접하게 제거된 양측 흉막과 페달 신경리아로 구성되며, 노란색-주황색이며 주변 조직과 는 다른 모양입니다. 그것은 구근 근육 buccal 질량에 등및 후방 앉아있다.</li>
		<li>집게와 해부 가위를 사용하여 조심스럽게 부칼 질량을 해부하여 대뇌 신경리아를 드러냅니다.</li>
		<li>포셉과 미세 절 가위를 사용하여 동물의 몸을 내면으로 하는 신경을 분리하여 CNS를 절제하여 중앙 신경을 연결하는 모든 신경을 그대로 유지합니다. 페달 신경 9 (PdN9)의 긴 길이를 두고, 또는 어느 신경이 자극 될 것인가.</li>
		<li>미누티엔 핀을 사용하여 CNS를 식염수로 채워진 엘라스토머 라이닝 접시에 배치합니다. 펠티에 냉각 장치를 통과하는 식염수로 접시를 인퍼프함으로써 15-16 °C에서 준비 온도를 유지합니다.</li>
		<li>집게와 미세 절 가위를 사용하여 CNS에서 과도한 결합 조직을 제거하고 심상에 있는 칼집의 피상적 부분을 해부한다. 이 과정에서 칼집에 구멍을 뚫지 않도록 주의해야 하며, 이는 내부에서 뉴런이 쏟아져 나오는 결과를 초래할 수 있습니다.</li>
		<li>간략하게(~20s)는 식염수에 있는 0.5% 글루타랄데히드의 용액에 간담을 담급니다. 식염수가 만연한 엘라스토머 라이닝 접시에 검정을 다시 배치하여 식염수가 VSD 염색을 시작하기 전에 글루타랄데히드를 씻어내도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>베르디아 스테파니의 해부
	<ol>
<li>동물을 냉장고에 약 20분 간 놓아 마취합니다.</li>
		<li>실온 식염수로 채워진 탄성모 라이닝 접시를 사용하여 머리와 꼬리에 미누티엔 핀을 놓습니다.</li>
		<li>미세 절 가위를 사용하여 CNS에 5-7mm 등절 피상화를 만듭니다. 참고: CNS 옆에 있는 동물 에 있는 눈, 어두운 반점은, 편리하게 양측으로 융합된 cerebropleural 및 페달 신경리아로 구성된 필요한 부분 CNS의 위치를 표시하고 buccal 질량 위에 앉아 있습니다.</li>
		<li>포셉과 미세 절 가위를 사용하여 동물의 몸을 내면으로 하는 신경을 분리하여 CNS를 절제하십시오. 흡입 전극을 위해 충분히 오랫동안 자극되는 신경을 둡니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 전압에 민감한 염료로 준비에 얼룩
<ol><li>RH155(NK3041라고도 함) 또는 RH482(NK3630 또는 JPW1132라고도 함)의 스톡 솔루션을 준비합니다.<ol>
<li>RH155: 1mL1mL에 5.4 mg의 고체 염료를 녹여 각각 34개의 미세센심분리기 튜브에 29 μL을 배관합니다. 각 튜브의 내용이 공기에 노출되어 어둠 속에서 밤새 건조시키십시오. 캡 및 RH155의 결과 고체 알리쿼트, 각각 0.15 mg을 포함하는 - 20°C 냉동고에 놓습니다.</li>
		<li>RH482: DMSO의 100 μL에 고체 염료 2 mg을 용해하고, 용액을 각각 0.1 mg의 RH482를 함유하고 - 20°C 냉동고에 보관하여 5 μL의 20개의 알리쿼트로 나눕니다. 참고: 트리토니아 및 압리시아의경우, 목욕 관류 또는 압력 응용 을 사용하여 VSD RH155를 준비 시 뉴런의 막에 로드할 수 있습니다. 압력 응용 프로그램은 VSD에 이미지되는 신경절만 노출하는 장점이 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>목욕 관류의 경우, 고체 RH155및 소용돌이의 위의 알리쿼트 2개 각각에 식염수를 추가하여 0.03 mg/mL RH155를 함유한 10mL의 결합 된 용액을 생성합니다.<ol>
<li>어둠 속에서 퍼퓨즈는 트리토니아의 경우 11°C에서 1~1.5h, 아플리시아의경우 16°C로 1-1.5h에 대해 (광표백을 피하기 위해) 펠티에 냉각 시스템을 통해 관류 용액을 전달하여 온도를 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>압력 적용의 경우 RH155의 알리쿼트에 500 μL 식염수를 추가하고 소용돌이를 추가하여 0.3 mg/mL의 염료 농도를 생성합니다.<ol>
<li>핸드헬드 마이크로 디스펜더를 사용하여 용액의 약 200 μL을 폴리에틸렌 튜브에 넣고 튜브 직경과 염색할 신경절 직경 사이에 좋은 일치가 되도록 합니다.</li>
		<li>마이크로 조작기를 사용하여 튜브 끝을 대상 신경절 위에 조심스럽게 놓고 신경절에 아늑한 씰이 형성될 때까지 낮춥습니다. 위에서 설명한 냉각 시스템의 유형을 사용하여 갱리아를 원하는 온도로 유지합니다.</li>
		<li>실내 조명을 어둡게 하여 광표백을 피하고 5분마다 마이크로디스펜더 어플리케이터 노브를 돌리면 더 많은 염료를 신경절에 강제로 밀어 주세요.</li>
		<li>30분에서 확인하여 좋은 염색이 일어나고 있는지 확인한 다음 약 1h의 총 염색 시간을 계속하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>베르디아에서염색하려면 RH482의 냉동 알리쿼트에 식염수 1mL을 추가하고 소용돌이를 녹입니다.<ol>
<li>이 용액의 200 μL을 식염수와 소용돌이 800 μL을 포함하는 마이크로 센세이프분리기 튜브로 전송하여 0.1 % DMSO의 식염수0.02 mg / ml RH482의 최종 염색 용액을 생성합니다.</li>
		<li>전체 CNS를 마이크로센트심리셔지 튜브에 넣고, 광표백을 피하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고, 5-6분마다 약 1시간 동안 손으로 흔들어 줍니다. 냉장고에 첫 번째 용액의 나머지 800 μL을 저장하고 후속 준비를 얼룩에 최대 3 일 동안 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 준비를 평평하게 하고 신경 자극을 위해 설정
참고: 이 섹션의 단계는 최소한의 조명 또는 광표백을 최소화하기 위해 녹색 표시등으로 수행해야 합니다.
<ol><li>염색 후, 이미징 챔버 내에서 식염수에 CNS를 몰입하고 해부 현미경 아래에 배치합니다.</li>
	<li>실리콘 조각(트리토니아 또는 압리시아용)또는 석유 젤리 덩어리(베르지아의 경우)를 심선/신경리아의 왼쪽과 오른쪽에 배치합니다. </li>
	<li>유리 또는 플라스틱 커버 슬립의 적절한 크기의 조각을 평평하게하기 위해 준비에 아래로 누릅니다. 단단히 누르지만 뉴런을 손상시키는 것은 그렇게 어렵지 않습니다. 참고: 이러한 방식으로 준비의 볼록 표면을 평평하게 하면 더 많은 수의 뉴런파초점이 되어 기록된 뉴런의 수가 증가하고, 이미징 중 준비를 고정하는 데 도움이 될 것입니다.</li>
	<li>가상 모터 프로그램을 유도하기 위해 신경을 자극하는 경우, 앞끝이 신경 직경만큼 넓어흡입전극을 준비한다. PE-100 폴리에틸렌 튜브 세그먼트를 화염 위에 조심스럽게 녹여 튜브 세그먼트의 양쪽 끝을 부드럽게 당긴 다음 원하는 지점에서 결과 테이퍼를 절단하여 이 작업을 수행하십시오.<ol>
<li>폴리에틸렌 흡입 전극의 테이퍼 끝을 통해 소량의 식염수를 그리고 자극되는 신경의 끝을 통해 소량의 식염수를 그리며, 전극의 백 엔드에 두꺼운 벽의 유연한 폴리머 튜브를 부착하고 입 흡입을 사용하여 음압을 가집니다.</li>
		<li>전극의 식염수는 전기 전도를 방해 할 수있는 기포가 부족한지 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 이미징을 위한 준비 및 최적화
<ol><li>챔버를 이미징 장비로 이동합니다. 레코딩 챔버를 통해 식염수 관류를 시작하고 준비 근처에 온도 프로브를 배치합니다. 이미지되는 종에 대해 원하는 온도 에 대한 온도 조절기를 설정합니다 (트리토니아,11 °C, 알리시아,15-16 °C, 또는 베르지아,26-27 °C).</li>
	<li>흡입 전극에 염소이드 실버 와이어 1개를 놓고 전극의 식염수에 닿는지 확인하고 다른 Ag-AgCl 와이어(반환 경로)를 흡입 전극 근처의 목욕 식염수에 넣습니다.</li>
	<li>물 침지 렌즈를 식염수로 낮춥춥습니다. 베이스 다이어프램을 닫은 다음 하위 스테이지 응축기의 가장자리를 높이거나 낮추고 초점을 조정하여 쾰러 조명을 생성합니다.<ol>
<li>이미지화할 준비 영역에 초점을 맞춥니다. 더 큰 신경에서 유래 하는 광학 신호는 초점에서 약간 벗어난 경우에 등록 될 작은 것 들 보다 더 가능성이 더 높습니다.</li>
		<li>파초점 디지털 카메라로 이미지화할 신경절 사진을 찍습니다.</li>
		<li>제어판 게인 스위치가 1x로 설정되면 "RLI"버튼을 클릭하고 다이오드의 평균 RLI를 확인하여 이미징 소프트웨어의 휴식 광 강도(RLI)를 검사합니다. 자극기에서 LED 램프 전원 공급 장치로 보낸 전압 레벨을 조정하고 원하는 범위(일반적으로 약 3-4 V)에 도달할 때까지 평균 RLI 레벨을 계속 확인합니다. 참고: PDA의 약 3-4 V에 해당하는 높은 RLIs가 바람직하다. 빛이 높을수록 광학 신호의 신호 대 잡음 비율이 높을수록 더 높은 RLIs에서 더 빠른 광표백 속도와 균형을 이루어야 합니다. 이 위험은 하이NA 객관적인 렌즈를 사용하여 최소화됩니다. 사용되는 물 침지 목적 렌즈는 10x/0.6 NA, 20x/0.95 NA, 40x/0.8 NA, 40x/1.15 NA입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레코딩을 위해 제어판 게인 스위치를 100x로 설정합니다.</li>
	<li>신경을 자극하는 경우, 라이트 레벨을 설정하는 데 사용되는 것과 별도의 자극기에서 원하는 전압, 주파수 및 지속 시간을 설정합니다. 제어판과 자극기 사이의 TTL 트리거링이 제대로 구성된지 확인합니다. 참고: 각 종의 시료 신경 자극 매개 변수는 다음과 같습니다: 트리토니아 PdN3, 2 s, 10 Hz 펄스 트레인 5 ms, 10 V 펄스; 아피시아 PdN9, 2.5 s, 20 Hz 펄스 트레인 5 ms, 8 V 펄스; 베르기아 페달 신경, 2 s, 10 Hz 펄스 트레인 5 ms, 5 V 펄스.</li>
	<li>스프링 또는 에어 테이블이 떠 있는지 다시 확인합니다.</li>
</ol>7. 광학 녹음
<ol><li>오버헤드 형광 등등 등 실내 조명을 끄거나 어둡게 합니다.</li>
	<li>원하는 파일 지속 시간, 경로 및 파일 이름을 설정한 다음 이미징 소프트웨어의"데이터 사용"버튼을 클릭하여 컴퓨터의 사용 가능한 RAM 용량까지 파일을 수집합니다. 작은 진동이 광학 기록 데이터에 큰 아티팩트를 도입 할 수 있기 때문에 광학 기록 중에 여전히 남아 있습니다. 참고: 컴퓨터의 사용 가능한 RAM을 초과하는 인수의 경우, 조지타운 대학의 Jianyoung Wu 박사를 통해 맞춤형 C++ 획득 프로그램을 이용할 수 있습니다.</li>
	<li>수집 직후 데이터를 보려면 이미징 소프트웨어의 Superimpose 기능을 사용하여 준비7의 앞에 찍은 신경절 이미지 위에 464 다이오드 모두에 의해 수집된 데이터를 중첩한다. 소프트웨어에 표시된 다이오드를 클릭하여 별도의 추적 화면에 기록된 것을 확장합니다.<ol>
<li>이전에 핀홀 시험에 의해 결정된 바와 같이 x, y 및 배율 계수를 입력하여 준비와 관련하여 다이오드의 정확한 정렬을 달성한다.</li>
		<li>후속 스파이크 정렬14에대한 실행 잠재적 가시성을 극대화하고 뉴런 수율을 개선하기 위해 5Hz 및 100Hz 차단(이미징 소프트웨어에서 사용 가능)이 있는 밴드패스 버터워스 필터를 부과하여 저주파 및 고주파 노이즈를 모두 제거합니다.</li>
		<li>과학 컴퓨팅 플랫폼에서 추가 분석을 위한 텍스트 파일로 필터링된 광학 데이터를 저장하려면 먼저 이미징 소프트웨어의"페이지"화면 바로 아래에 있는"TP 필터"상자를 선택합니다. 그런 다음 ""출력"탭에서"ASCII"로 페이지를 저장하고원하는 파일 이름을 나타나는 대화 상자에 입력합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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대규모 VSD 이미징 접근 방식을 구현하는 데 있어 가장 중요한 세부 사항 중 하나는 다이오드 를 가로질러 대비 가장자리의 움직임을 생성하는 진동을 최소화하여 큰 관절 신호를 생성하는 것입니다. 흡광도 VSD는 작용 잠재력을 가진 빛 강도의 매우 작은 비율의 변화를 일으키기 때문에 진동 아티팩트는 방지되지 않으면 관심있는 신경 신호를 가릴 수 있습니다. 진동 아티팩트를 최소화하기 위해 여러 가지 방법을 사용합니다. 첫째, 이미징 룸은 1층에 위치하고 있으며, 공기 취급 장비 및 기타 여러 소스 구축과 관련된 진동으로 준비를 격리합니다. 둘째, 스프링 기반 격리 테이블이 사용되었으며, 다른 PDA 사용자가 확인한 결과 일반적인 에어테이블(16)보다진동이 더 잘 완화되는 것을 확인했습니다. 셋째, 수면 침수 목표가 사용되어 표면 파문으로 인한 이미지 변동을 제거했습니다. 넷째, 이미지화되는 준비는 실리콘 플러그 나 석유 젤리에 의해 제자리에 유지되는 위에서 아래로 눌러 챔버 커버 슬립 바닥과 커버 슬립 조각 사이에 가볍게 눌러 준비를 안정화했다. 이것은 또한 심리온 또는 신경정수의 볼록한 표면을 평평하게 하고, 객관적인 초점의 평면에 있는 더 많은 뉴런의 결과로, 기록된 신경의 수를 증가시킵니다.
작용 전위로부터 발생하는 VSD 광 흡수도의 매우 작은 변화에 대한 신호 대 잡음 비율을 최대화하려면 PDA에 대한 준비를 통해 거의 포화 광을 달성하는 동시에 염료의 광표백을 최소화하는 것이 필수적입니다. 이를 위해, 우리는 일반적으로 1x 위치에서 PDA 제어패널 게인 스위치로 측정된 바와 같이 3-4 V의 휴식 광 강도에서 작동합니다(PDA의 464 증폭기는 빛의 10V에서 포화). 데이터 수집 중에 이 게인 계수가 100배로 변경됩니다. PDA에 의해 측정된 바와 같이 3-4 V에 도달하기에 충분한 빛을 얻는 것은 여러 가지 방법으로 달성될 수 있다. 먼저, 사용 중 흡수성 염료의 흡수 특성에 적합한 파장을 제공하는 초브라이트 LED 광원을 사용한다. 이에 따라 735-nm LED 콜리메이트 램프가 사용되었으며, 이는 RH155 및 RH482의 최적의 흡수 파장과 겹친다. 둘째, 필요한 경우 LED 광원에서 더 작은 영역으로 빛을 집중시키는 플립탑 하위 스테이지 응축기를 사용합니다. 셋째, 응축기 높이를 조정하여 Köhler 조명을 달성하여 높고 균일한 밝기와 최대화 품질을 보장합니다. 넷째, 광학 경로에 열 필터가 없는지 확인하여 LED 램프의 735-nm 파장을 감쇠시킬 수 있습니다. 다섯째, 광학 경로에서 더 많은 빛이 필요한 경우 디퓨저를 제거합니다. 여섯째, 높은 공간 해상도를 제공하는 고-NA 목표를 사용하고, 낮은 램프 강도에서 PDA에 충분한 수준의 빛이 도달할 수 있도록 한다. 이를 통해 모든 파일에 걸쳐 동일한 광 강도를 사용하여 신호 진폭을 크게 잃거나 다시 염색할 필요가 없는 준비당 10-20분의 여러 수집 파일을 얻을 수 있는 범위내에서 광표백을 최소화할 수 있었습니다. 결정적으로, 실험자가 이러한 긴 파일을 통해 뉴런을 추적하려는 경우 초점 평면이 변경되지 않고 준비가 이동하지 않도록합니다. 마지막으로, PDA에 충분한 빛을 라우팅하는 추가 방법은 더 얇고 불투명한 간질증이 적은 젊은 동물을 사용하는 것입니다.
때때로 우리는 광학 신호의 신호 대 잡음 비율이 저하되고 모터 프로그램 리듬이 최적이 아님을 발견합니다(예: 느리거나 비정상적). 이 지속적으로 발생 하기 시작 하는 경우, 우리는 VSD의 신선한 솔루션을 혼합. VSD의 알리쿼트들은 일반적으로 -20°C 냉동고에서 약 6개월 동안 유효하다. 이와 관련, 베르히아의경우 지금까지 가장 좋은 결과를 흡광도 VSD RH482로 얻을 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. RH482는 RH155보다 더 많은 리포필성이기 때문에 베르히아의비교적 작은 뉴런을 더 잘 얼룩지게 하거나 이 열대 종에 사용되는 더 높은 기록식염수 온도에서 뉴런 멤브레인에 더 효과적으로 남아 있을 수 있습니다.
신경 활동의 PDA 기반 이미징의 한 가지 제한은 100x 사전 증폭 단계 전에 하드웨어에서 전압 신호의 AC 커플링과 관련이 있습니다: 이것은 이 기술에 필요한 높은 휴식 광 수준에 의해 생성된 큰 DC 오프셋을 제거하는 데 필요한 기능을 나타내지만, PDA에 대한 AC 커플링 본질은 멤브레인의 느린 변화의 측정을 배제합니다. 시냅스 입력과 관련된 것과 같은. 기록 속도가 느리거나 정상 상태 인 잠재적 인 변화가 필요한 경우 DC 결합 CMOS 카메라 이미징 시스템을 사용하여 하위 임계 값 활성을 캡처할 수 있습니다. Byrne과 동료들은 최근 RH155와 이러한 설정을 사용하여 Aplysia17,18의부칼 신경절에서 뉴런의 활성을 이미지화했다. 우리는 두 시스템을 모두 사용하고 CMOS 카메라, 때문에 검출기의 훨씬 높은 밀도 (128 x 128), 동일한 이미징 시간7에대한 50 배 더 큰 데이터 파일을 생성발견. PDA의 작은 파일은 더 빠른 처리 및 분석을 용이하게합니다. 또한 확장된 단일 평가판기록(그림 4)과학습 연구를 통해 여러 시험의 데이터가 스파이크 정렬 전에 하나의 큰 파일로 연결되어 학습이19로진행됨에 따라 네트워크 조직을 추적할 수 있습니다.
다른 카메라 기반 조사에서, 형광 VSDs는 거머리의 세그먼트 간질에서 네트워크 기능을 검사하기 위해 크리스탄과 동료에 의해 사용되었습니다. 한 가지 영향력 있는 연구에서 이것은 수영하거나20을기어 다니는 동물의 결정에 관련된 뉴런의 식별으로 이어졌습니다. 또 다른 연구에서는, 크리스탄 외. 거머리의 수영 및 크롤링 동작이 다기능 대 전용 회로21에의해 구동되는 정도를 조사했다. 최근에, Wagenaar와 동료는 거머리 세그먼트 신경절에 있는 거의 모든 뉴런에서 기록할 수 있는 전압 화상 진찰을 위한 양면 현미경을 이용했습니다22. 많은 카메라 기반 이미징 방법과 는 달리 PDA 기반 이미징 방법의 장점은 결과 처리를 위한 신경 경계에 대한 결정을 포함하지 않는 블라인드 소스 분리의 한 형태인 ICA에 의한 신속하고 편견없는 스파이크 정렬입니다.
VSD의 선택에 대하여, 흡광도 염료 RH155 및 RH482의 한 가지 장점은 그들과 관련된 거의 -투 -no 광독성이며,23,24,형광 VSDs에 대한 일반적인 것보다 더 긴 기록 시간을 가능하게. 또한, 우리가 사용하는 빠른 흡광도 VSD는 일반적으로 진폭80mV인 위장 제제에서 과다 촬영 체세포 작용 잠재력을 기록하는 데 적합합니다. 그림 3G에표시된 바와 같이, 우리의 광학 방법은 작업 잠재력 언더슈트를 기록할 수 있습니다 (우리의 기록 중 어느 것도 추적 평균되지 않음) 이것은 우리가 사용하는 VSD가 어느 정도 감쇠되어 소마에 도달 할 때까지 오버슈팅되지 않는 다른 모델 시스템에서 작업 잠재력을 분별 할 수 있음을 시사합니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리의 광학 접근 은 soma에 기록 될 때 매우 감쇠 된 행동 잠재력을 나타내는 것으로 알려져 있는 종에 대 한 이상적이지 않을 수 있습니다.
신경망에 대한 많은 현재 연구는 디자이너 형질 전환 종의 소수에 초점을 맞추고있다. 그러나, 신경 과학 은 다양 한 phylogenetically 구별 된 종의 연구에서 혜택. 다양한 종을연구하면 회로가25, 26으로어떻게 진화하는지에 대한 통찰력을 제공하고 필라1,2,3,4,27에서공통될 수 있는 네트워크 기능의 원리를 조명합니다. 우리는 지금까지 압리시아 칼리포니카8,11,12,13,14,28, 트리토니아 디오메데아8,9,11, 14,19,28, 트리토니아 축제28을포함한 다수의 위장 종에 이미징 방법을 적용했습니다. Pleurobranchaea californica (게시되지 않은 데이터), 그리고 가장 최근의 베르디아 스테파니 (그림 5). 이 접근법의 매력은 형질 전환 동물이 필요없이 많은 종에 쉽게 적용 할 수 있다는 것입니다. 우리는 빠른 흡광성 염료와 PDA를 가진 VSD 화상 진찰의 우리의 사용이 반 온전하, 행동 Navanax29 및 Aplysia30 준비에서 이것을 성취한 선구적인 일의 발자취를 따른다는 것을 인정하고 싶습니다. 우리의 접근 방식의 급속성에 우리의 강조는 부분적으로 많은 조사자가 신경과학31에광범위한 관심의 과학적 질문을 탐구하기 전에 연구의 년이 기본 네트워크 조직을 특성화하는 데 필요한 것이라는 두려움으로 인해 새로운 종에 네트워크 연구를 시작하는 것을 점점 꺼릴 수 있다는 우려에 대한 답변입니다. 따라서, 여기서 우리의 목표는 프로세스를 크게 가속화하는 기술을 보여주는 것입니다 - 네트워크 조직에 대한 중요한 당일 통찰력이 단일 준비에서 얻을 수 있다는 점에 이르기까지.

Drosophila와 C. elegans와 같은 무척추 동물의 형질 전환선의 발달은 행동의 신경 기지가 광학적으로 심문되고 조작될 수 있는 강력한 시스템을 제공하고 있습니다. 그러나, 이러한 특별 한 준비 비 트랜스 원 종의 신경 회로 연구에 대 한 열정을 감소의 단점이 있을 수 있습니다., 특히 신경 과학 연구에 새로운 종의 도입에 관한. 비교 연구는 이러한 원리가1,2,3,4를발견하는 필수 경로를 나타내기 때문에 하나 또는 두 개의 모델 시스템에만 초점을 맞추는 것은 네트워크 기능의 일반적인 원칙을 찾는 데 해롭습니다. 우리의 목표는 신경망 기능의 비교 연구를 촉진하기 위한 노력의 일환으로 위트포드 신경망의 기능 구조에 대한 신속한 통찰력을 얻기 위한 대규모 이미징 접근법을 입증하는 것입니다.
Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea 등과 같은 위장 용 연체 동물은 오랫동안 신경망 기능의 원리를 조사하는 데 사용되어 왔으며, 그 행동은 신경리아 표면에 위치한 크고 종종 개별적으로 식별 가능한 뉴런으로 중재되기 때문에5가지 기록 기술에 쉽게 접근 할 수 있습니다.  1970년대에 플라즈마 멤브레인에 통합할 수 있는 전압 에민감한 염료(VSDs)가 개발되어 곧 여러 뉴런6에의해 생성된 작용 잠재력의 첫 번째 전극 없는 기록을 가능하게 하였다. 여기에서, 우리는 신경 과학, Berghia 스테파니에새로운 것을 포함하여 위장의 몇몇 종의 네트워크 활동을 검토하기 위하여 VSDs의 우리의 사용을 보여줍니다. 이미징 장치는 1,600프레임/초(그림1)에서샘플링하는 시판되는 464요소 포토다이오드 어레이(PDA)로, 빠른 흡광도 VSD로 사용될 경우 기록된 모든 뉴런7의작용 잠재력을 드러낸다. 모든 다이오드에 의해 기록된 신호는 PDA 획득 소프트웨어에서 신경절 의 이미지에 획득 하고 중첩된 직후에 표시되므로 동일한 준비8,9에서날카로운 전극으로 관심 있는 뉴런을 조사할 수 있게 된다.
원시 PDA 데이터에서 많은 다이오드는 더 큰 뉴런을 중복적으로 기록하고 있으며, 많은 다이오드는 또한 여러 뉴런의 혼합 신호를 포함합니다. 전환점은 독립적 인 구성 요소 분석을 사용하여 각 원시 464 채널 PDA 데이터 세트를 새로운 추적 세트로 신속하게 처리하기 위해 자동화 된 스파이크 정렬 방법을 개발하여 모든 기록 된 뉴런이 작업 잠재력10,11을포함하는 별도의 추적에 나타납니다.
이 문서에서는 포토다이오드 어레이와 빠른 흡광도 VSD를 통해 위장 신경계에서 대규모 액션 잠재적 기록을 얻는 데 관련된 필수적인 단계를 설명합니다.  또한, 광학적으로 기록된 뉴런을 군집화및 매핑하고, 발사흔적(12,13)의간단한 검사를 통해 흔히 명백하지 않은 인구 수준의 특징을 특성화하기 위해 사용될 수 있는 분석 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>Achromat 0.9 NA swing condenser</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100 with SC-20</td><td>Controls perfusion saline temperature</td></tr><tr><td>Chamber thermometer</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12 with IT-18 microprobe</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Optronics</td><td>S97808</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting forceps</td><td>Dumont</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>American Diagnostic Corp.</td><td>ADC-3410Q</td><td></td></tr><tr><td>Imaging microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WIF</td><td></td></tr><tr><td>Imaging perfusion chamber</td><td>Siskiyou</td><td>PC-H</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Instant Ocean</td><td>SS6-25</td><td>Makes 25 gallons at a time</td></tr><tr><td>Master-8 pulse stimulator</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Microdispenser</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-752</td><td>Dye applicator for pressure staining</td></tr><tr><td>Microdissection scissors</td><td>Moria</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pins (0.1 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9677548</td><td>For positioning and stabilizing CNS</td></tr><tr><td>Motorized microscope platform</td><td>Thorlabs</td><td>GHB-BX</td><td>Gibraltar platform</td></tr><tr><td>NeuroPlex imaging software</td><td>RedShirtImaging</td><td>NeuroPlex</td><td>Compatible with the WuTech photodiode array</td></tr><tr><td>Objective lenses</td><td>Olympus</td><td>XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340</td><td></td></tr><tr><td>PE-100 polyethylene tubing</td><td>VWR</td><td>63018-726</td><td>Tubing to make suction electrodes</td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Instech</td><td>P720 with DBS062SDBSU tube set</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>Equate</td><td>NDC 49035-038-54</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode array with control panel</td><td>WuTech Instruments</td><td>469-IV photodiode array</td><td>Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information</td></tr><tr><td>RH155</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-499432</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>RH482</td><td>Univ of Conn. Health Center</td><td>JPW-1132</td><td>Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow</td></tr><tr><td>Silicone earplugs</td><td>Mack&#039;s</td><td>Model 7</td><td>To be use for preparation compression</td></tr><tr><td>Staining PE tubing</td><td>VWR</td><td>63018-xxx</td><td>Different sizes depending on fit</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td></td></tr><tr><td>Thorlabs LED and driver</td><td>Thorlabs</td><td>M735L2-C1, DC2100</td><td>LED lamp and driver</td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-xxx</td><td></td></tr><tr><td>Vibration isolation table</td><td>Kinetic Systems</td><td>MK26</td><td>Spring-based</td></tr></tbody></table>

photodiode-based optical imaging for recording network dynamics with single-neuron resolution in non-transgenic invertebrates

신경의 지정 가능한 세트의 활동이 빛으로 기록되고 조작될 수 있는 형질 전환 무척추 동물 제제의 발달은 행동의 신경 기초의 연구를 위한 혁명적인 진보를 나타냅니다. 그러나, 이 발달의 단점은 아주 소수의 "디자이너" 유기체(예를 들어, C. elegans 및 Drosophila)에조사관을 집중하는 경향이 있습니다, 잠재적으로 네트워크 기능의 일반적인 원리를 확인하는 데 필요한 많은 종에 걸쳐 비교 연구의 추구에 부정적인 영향을 미칩니다. 본 기사는 비트랜스제식 위산염 종의 뇌에서 전압에 민감한 염료를 사용한 광학 레코딩을 빠르게(즉, 단일 실험의 시간 과정 내에)에 어떻게 사용될 수 있는지 를 보여 준다. 우리는 우리의 실험실에서 활동 잠재적인 흔적을 얻기 위해 우리의 실험실에서 사용 하는 해부, 염색 및 기록 방법을 자세히 설명 하 고 수십 ~150 신경 과학에 새로운 하나를 포함 하 여 여러 위장 종의 CNS에서 행동 관련 모터 프로그램 동안 뉴런에 150 뉴런- nudibranch Berghia 스테파니. 이미징은 흡광전압 에민감한 염료와 1,600프레임/초로 샘플링하는 464요소 포토다이오드 어레이로 수행되며, 기록된 뉴런에서 생성된 모든 작용 잠재력을 캡처할 수 있을 만큼 빠릅니다. 여러 분 기록은 거의 또는 전혀 신호 표백 또는 광독성과 준비 당 얻을 수 있습니다. 설명된 방법을 통해 수집된 원시 광학 데이터는 다양한 예시 방법을 통해 이후에 분석될 수 있다. 당사의 광학 기록 접근 방식은 다양한 비트랜스제닉 종에서 네트워크 활동을 조사하는 데 쉽게 사용할 수 있으므로 뇌가 어떻게 행동을 생성하는지에 대한 비교 연구에 적합합니다.

트리토니아 시스타 포식자와의 피부 접촉은 트리토니아 디오메데아의 탈출 수영을 트리거, 안전에 멀리 추진 전신 굴곡의 리듬 시리즈로 구성(그림 3A). 고립 된 뇌 준비에서 페달 신경 3 (PdN3)에 대한 간단한 자극은 페달 신경리아의 광학 녹음에서 쉽게 인식 할 수있는이 행동에 대한 리듬 수영 모터 프로그램 (SMP)을 유도합니다. 도 3B는 PDA가 배치된 왼쪽 트리토니아 페달 신경절의 등쪽 표면에 뉴런의 발사 활성을 기록하도록 설계된 VSD 이미징 실험의 레이아웃을 묘사하며, 이는 PdN3이 SMP를 유도하는 모순(오른쪽)에 대한 자극으로 배치되었다. PdN3의 자극 전, 도중 및 후 20다이오드 기록 활동에서 원시 및 필터링 된 데이터 (밴드 패스 버터 워스 필터, 5 및 100 Hz 컷오프)는 각각 그림 3C, D에 표시됩니다. 신경 자극은 2 분 파일로 20 s를 전달했습니다. 획득 직후, 기록 어레이의 모든 464다이오다이오드로 측정된 신호는 이미징소프트웨어(도 3E)에서제제의 이미지를 통해 지형적으로 표시될 수 있다. 이 시점에서, 많은 흔적은 동일한 뉴런에서 중복 으로 기록 된 스파이크를 포함, 일부 흔적은 하나 이상의 뉴런에서 스파이크를 포함. ICA를 사용한 필터링된 다이오드 추적을 스파이크 정렬하면 53개의 고유한 뉴런 흔적이 생성되었으며, 그 중 30개는 도 3F에표시됩니다. 개별 스파이크의 역학은 그림 3F (빨간 상자)에서 네 개의 흔적의 발췌를 확장 도 3G에서평가 할 수있다; ICA 스파이크 정렬 알고리즘의 정확도는 이전에 동시 날카로운 전극 레코딩을 사용하여 검증되었으며, 이는 정렬된 트레이스의 모든 스파이크가 개별뉴런(11,14)으로부터세포내 기록된 스파이크에 해당한다는 것을 보여주었다.
아피시아 Aplysia californica에 강하게 역경 꼬리 자극은 고정 관념 두 부분 리듬 탈출 응답을 유도15. 응답의 첫 번째 단계는 동물을 빠르게 앞으로 이동하는 머리 런지와 꼬리 당김의 여러 주기의 갤럽입니다. 이것은 일반적으로 몇 분 동안 느린 속도로 앞으로 동물을 구동 머리 - 꼬리 근육 수축의 반복 파도를 포함하는 크롤링의 기간(그림 4A)에선행된다. 이러한 탈출 모터 프로그램을 광학 레코딩에서 포착하기 위해 PDA는 고립된 뇌 제제에서 오른쪽 페달 신경절의 등쪽 표면에 초점을 맞추고, 흡입 전극을 콘트라탈(왼쪽) 페달 신경 9(PdN9)에 배치하였다. 그림 4B). 연속 20분 광학기록(도 4C)으로1분 동안 PdN9은 갤럽 크롤링 모터 프로그램 서열을 유도하도록 자극되었다. 모든 81개의 기록된 뉴런으로부터의 신호의 확률가있는 가우시안 공간 분포는 신경절(도4D)에매핑되었다. 전체 기록에 적용된 치수 감소는 탈출 프로그램의 갤럽(cyan) 및 크롤링(dark blue) 단계가 별개의 영역을 점유하고 각각 다른 궤적을 형성하고, 나선형 및 루프와 같은, 주 성분공간(도 4E)에서형성되었다는 것을 밝혔다.
그림 4에 묘사된 Aplysia 레코딩을 기반으로 하는 세 개의 동영상은 이러한 데이터 세트에서 수행할 수 있는 추가 유형의 분석을 보여 줍니다. 비디오 1은 기록된 모든 뉴런의 발사를 기록합니다. 이스케이프 모터 프로그램의 초기 자극 후 기간은 다양한 기능성클러스터(Video 2)의번갈아 가며 신경절 내 활동이 표시된 갤럽을 특징으로 하였다. 갤럽은 이후 크롤링으로 전환하여 뉴런 클러스터를 가로지르는 활동이 광범위하게 위장되었지만 신경절에서 시계 반대 방향으로 회전 궤적을 가정하였다(비디오3). 후자의 두 비디오는 또한 합의 클러스터링을 통합하여 이스케이프 응답의 갤럽 및 크롤링 단계에 대한 다양한 기능적 앙상블의 발사 및 위치를 별도로 보여줍니다. 갤럽과 크롤링 단계 모두에서 동일한 클러스터에 할당된 많은 뉴런이 이전 연구결과(12)와일치하여 신경절에서 서로 물리적으로 근접해 보였다.
베르기아 주 aeolid nudibranch Berghia 스테파니아 (그림 5A)는신경 과학을위한 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 전형적인 Berghia 실험에 대한 이미징 설정은 도 5B에도시된다. 광역 신경 활성을 유도하기 위해, 흡입 전극은 가장 눈에 띄는 좌측 페달 신경에 배치되었고, 신경 자극은 2분 기록으로 30s를 전달하였다. ICA 처리 된 흔적은 55 뉴런(도 5C)에서자발적 및 자극 유발 활성을 모두 밝혀냈다. 합의 클러스터링을 통한 커뮤니티 감지는 네트워크 그래프와 그림 5E에서그림 5D에 묘사된 10개의 고유한 기능성 앙상블을 식별하여 클러스터링 할당에 따라 그림 5C에 표시된 추적을 재구성합니다. 모든 기록된 뉴런으로부터의 신호의 가우시안 분포는 55개의 기록된 뉴런의 위치를 나타내기 위해 도 5F의 준비 이미지에 겹쳐져 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig1.jpg"> 그림 1: 광학 이미징 장비 및 포토다이오드 어레이(PDA)의 뷰. (A)PDA, 디지털 카메라, 현미경 및 스테이지를 특징으로하는 광학 이미징 장비. (B)광섬유가 이미징 조리개를 464 포토다이오드에 연결하는 PDA의 내부 설계. 앰프 행은 포토다이오드 위에 있습니다. (C)영상 조리개 부위의 육각형 면이, 그 위에, 영상화되는 부위가 집중된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61623/61623fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig2.jpg"> 그림 2: 광학 레코딩 획득의 필수 워크플로우를 보여주는 순서도입니다. 이미징의 세부 사항을 통해 해부 및 염색에서 VSD 이미징 프로토콜의 필수 단계는 이 순서도에 묘사됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61623/61623fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig3.jpg"> 그림 3: 트리토니아 디오메데아의결과, 원시, 필터ed 및 스파이크 정렬 데이터를 보여줍니다. (A) 트리토니아는 육식 바다 스타 피크노포디아 헬리안로이드에서 탈출, 이는 신체의 교대 및 복부 굴곡으로 구성되어 있습니다. (B)이미징 설정의 회로도. ce=뇌엽의 뇌성 간경; Pl = 뇌엽 의 흉막 음류 신경절; PD = 페달 신경절. (C)20광다이오드로부터의 원시 데이터, 좌측 페달 신경절내의 활성을 표시하여 콘트라탈 PdN3(화살표로 표시된 자극). (D) C(5 및 100Hz 밴드패스 버터워스 필터)와 동일한 다이오드에서 데이터를 필터링합니다. (E)464개의 다이오드 모두에 의해 수집된 압축 된 흔적이 준비 의 이미지를 통해 지형적으로 겹쳐진 이미징 소프트웨어 출력. 추적이 C와 D로 표시되는 20개의 다이오드의 위치는 빨간색으로 강조 표시됩니다. (F)ICA를 통한 스파이크 정렬에 의해 생성된 30개의 선택된 단일 뉴런 트레이스. (G) F의빨간색 상자에 대응하는 4개의 단일 뉴런 트레이스의 확장된 뷰는 더 높은 시간적 해상도로 작용 잠재력을 표시합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61623/61623fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig4.jpg"> 그림 4: 에알리시아 칼리포니카의결과, 장시간 레코딩, 신호 매핑 및 치수 감소를보여줍니다. (A) Aplysia의 순차탈출 모터 프로그램, 갤럽 및 크롤링의 두 단계. (B)이미징 설정의 회로도. Ce = 대뇌 신경절; Pl = 흉막 신경절; PD = 페달 신경절. (C)오른쪽 페달 신경절에서 81개의 뉴런을 20분 동안 기록하여 위반 PdN9(화살표로 표시)에 자극에 반응한다. 흔적 아래의 녹색, 시안 및 진한 파란색 막대는 각각 이스케이프 모터 프로그램의 사전 자극 기간, 갤럽 및 크롤링 단계를 나타냅니다. (D)ICA에 의해 확인된 모든 81개의 신경 신호 소스의 위치의 매핑된 확률가우시안 분포를 가진 제제의 이미지. 녹색 윤곽선은 신경절에 대하여 PDA의 육각형 면의 위치를 나타냅니다. 각 가우시안의 숫자는 C의추적 번호와 일치합니다. (E)20분 파일 동안 처음 3개의 주성분을 서로 플롯하는 주성분 분석을 이용한 치수 감소. 사전 자극 기준선, 갤럽 및 크롤링 시대는 각각 녹색, 시안 및 진한 파란색으로 표시됩니다. 이 레코딩에 해당하는 신경 발사 애니메이션의 경우 비디오 1-3을 참조하십시오. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61623/61623fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig5.jpg"> 그림 5: 신경과학을 위한 새로운 종인 베르히아 스테파니아의결과, 네트워크 그래프, 기능 클러스터링및 양자 신호 매핑을보여줍니다. (A) 베르기아 표본. (B)이미징 설정의 회로도. Ce = 뇌엽의 뇌엽 은 뇌성 신경절; Pl = 뇌엽 의 흉막 음류 신경절; PD = 페달 신경절; Rh = 코뿔소 신경절. (C)세레브로플뢰랄 간리아에서 55개의 양자 뉴런의 자발적 및 자극-자극 활성을 나타내는 흔적(자극의 전달은 화살표로 표시됩니다). (D)컨센서스 클러스터링을 통해 식별된 고유한 색상을 할당한 10개의 기능적 앙상블을 표시하는 네트워크 그래프. 이 플롯의 노드는 네트워크 공간의 거리가 앙상블 내부와 앙상블 간의 발생 상관 관계의 정도를 나타내는 뉴런을 나타냅니다. (E) C의 흔적이 재배열되고 컬러 로코딩(D의 색 구성표에 따라) 기능적인 앙상블로 배열됩니다. (F)기록된 모든 뉴런으로부터 신호의 매핑된 위치, C및 E의 미량 숫자를 보여주는 준비 의 이미지. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61623/61623fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1 : 전체, 20 분 Aplysia 탈출 운동 프로그램의 애니메이션. 오른쪽 페달 신경절(왼쪽 패널)에서 81개의 개별 뉴런을 과도하게 오버레이하는 백색 모양의 불투명도는 해당 뉴런 트레이스(오른쪽 패널)에 의해 구동되었으며, 평균 스파이크 속도(레코딩에서 실시간 0.61s당 비닝)의 기능으로 선형적으로 변화하였다. 각 뉴런에 대해, 전체 불투명도는 기록 기간 동안 최대 발사 속도로 정규화되었다. 비디오에서 경과된 시간의 1초는 실시간 12.2를 나타냅니다. 스케일 바는 각각 이스케이프 운동 프로그램의 사전 자극 기준선, 갤럽 및 크롤링 단계를 나타내는 추적 아래에 녹색, 시안 및 진한 파란색 선이 있는 실시간에 해당합니다. 갤럽 단계 주변의 노란색 상자와 크롤링 단계의 일부가 동영상 2 및 3에서애니메이션을 생성하는 데 사용되는 녹음 발췌를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61623/Video1(Full)_reduced.mp4" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭)</a>
비디오 2: Aplysia 탈출 운동 프로그램의 갤럽 단계 애니메이션. 합의 클러스터링은 기능성 앙상블을 도출하기 위해 모터 프로그램의 단지 갤럽 단계에서 기록된 모든 81개의 뉴런에서 수행되었으며, 참조에서 기재및 사용 가능한 접근법 및 소프트웨어를 이용하여12. 탈출 프로그램의이 단계 동안 크게 강장제 또는 불규칙한 발사 패턴을 나타내는 신경 앙상블은이 비디오에서 생략되었다. 검은 색과 올리브 녹색 앙상블에 속하는 뉴런의 행동 잠재력은 비디오의 오디오 트랙에서 들을 수 있으며, 해당 뉴런과 흔적이 강조되어 있습니다. 평균 스파이크 비율은 비디오 1에서와 같이 정규화되었으며 동등한 시간 비닝으로; 비디오에서 경과 시간 1s는 실시간 6.1에 해당합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61623/Video2(Gallop).mp4" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭)</a>
비디오 3: 압리시아 탈출 운동 프로그램의 크롤링 단계의 애니메이션. 합의 클러스터링은 기능성 앙상블을 도출하기 위해 모터 프로그램의 크롤링 단계에서 81개의 기록된 뉴런 모두에 수행되었다. 모터 프로그램의이 단계에서 주로 강장제 또는 불규칙한 발사 패턴을 나타내는 앙상블은이 비디오에서 생략되었다. 평균 스파이크 비율은 비디오 1과 2에서와 같이 정규화되었으며 동등한 시간 비닝으로; 비디오에서 경과 시간 1s는 약 12.2s의 실시간에 해당합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61623/Video3(Crawl)_reduced.mp4" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭)</a>

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Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

이 프로토콜은 흡광도 전압에 민감한 염료 및 포토다이오드 어레이를 사용하여 비 형이상무척추동물 종의 단일 세포 분해와 신경 인구 활성을 이미징하는 방법을 제시한다. 이 접근 방식을 통해 하루 동안 이미징 및 분석을 추구할 수 있는 빠른 워크플로우가 가능합니다.

비 트랜스제닉 무척추 동물의 단일 신경 해상도를 가진 네트워크 역학을 기록하기위한 포토다이오드 기반 광학 이미징

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

photodiode-based-optical-imaging-for-recording-network-dynamics-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

2.8K 조회수.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. 이 프로토콜은 흡광도 전압에 민감한 염료 및 포토다이오드 어레이를 사용하여 비 형이상무척추동물 종의 단일 세포 분해와 신경 인구 활성을 이미징하는 방법을 제시한다. 이 접근 방식을 통해 하루 동안 이미징 및 분석을 추구할 수 있는 빠른 워크플로우가 가능합니다.

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Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

연구

신경과학

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

생물학

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

단일 셀 및 단일 스파이크 해상도 suprathreshold 신경 활동의 광 기록

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons (10 to 25 &mu;m in diameter) are arranged in plexuses that are confined to distinct planes of the gut wall 1; the myenteric plexus can be found between the longitudinal and circular muscle layers, and the submucous plexus between the circular muscle layer and the mucosa. Since the effector systems for these plexuses (transporting epithelium, endocrine cells, immune elements, blood vessels and smooth muscle) are also contained within the gut wall, semi-intact preparations can be dissected that preserve individual components of different reflex pathways. The behavior of the effector systems is controlled by the submucous and myenteric plexuses acting in concert. Therefore, detailed knowledge of synaptic interactions within and between ganglia, and of communication between the plexuses, is essential for understanding normal gastrointestinal function. The ENS, as an intact nervous system, is a unique experimental model in which one can correlate molecular and cellular events with the electrical behavior of the neuronal network and its physiological outputs. Because of the quasi-two-dimensional organization of its plexuses, the ENS is particularly well suited for the study of neural networks using multiple site optical recording techniques that employ voltage-sensitive dyes 2,7,8,9. We will illustrate here the use of a relatively new naphthylstyryl-pyridinium dye (di-4-ANEPPDHQ) 3 that offers multiple advantages over its predecessors, including very low phototoxicity, slow rate of internalization, and remarkable chemical stability. When used in conjunction with a camera that permits sub-millisecond time resolution, this dye allows us to monitor the electrical activity of all the neurons in the field of view with a maximal spatial resolution of ~ 2.5 &mu;m at 100X magnification. At lower magnification (10X or 20X), the sacrifice of single-cell resolution is compensated by a gain in perspective, revealing the intricacies of the inter-ganglionic circuitry.

This protocol illustrates how voltage-sensitive dyes enable optical recording of electrical activity from intact neural networks such as the plexuses of the guinea-pig enteric nervous system, with an adjustable resolution that ranges from single-cells to multi-ganglionic circuitry.

전압에 민감한 염료를 사용하여 기니 돼지 장용 네트워크에서 전기 활동의 광학 녹음

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

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It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.