이러한 프로토콜을 통해 사용자는 2D 또는 3D 배양 조건에서 ECM 및 DCM 이없는 환경에서 많은 수의 구조적 모방 및 내분비 기능성 고환 오르가노이드를 생성할 수 있습니다. 이러한 기술은 매우 재현 가능하며 표준 생물학적 실험실 설정에 쉽게 적용되며 일반적인 도구와 재료만 활용합니다. 고환 오르간노이드는 체외에서 정자 발생 및 생식 내분비학을 시뮬레이션하기위한 새로운 도구이며, 언젠가 체외 게임 발생의 연구를 가능하게 할 수 있습니다.
먼저 안락사 마우스 수핀을 해부 매트에 놓고 70%에탄올로 복부를 살균하는 것으로 시작합니다. 집게로 하복부의 피부를 텐트로 하고 가위로 엽니다. 복부의 왼쪽 아래 및 오른쪽 잉구인 영역에서 고환을 찾아 꽃병 연기 및 모든 고정 결합 조직에 그들의 연결을 잘라.
그런 다음 동물에서 전체 고환을 들어 올립니다. 미리 평형된 BM의 페트리 접시에 놓습니다. 해부 현미경의 밑에, 작은 마이크로 해부 가위로 각 고환의 한쪽 끝에 튜니카 알부진에 있는 작은 절개를 하거나 2개의 미세 한 집게로 부드럽게 찢어서. 절개 반대쪽 끝에서 고환을 들고 있는 동안, 부드럽게 미세한 집게로 짜내고 튜니카의 구멍을 향해 스위핑 모션을 밀어 내고, 이는 고환 조직을 하나의 응집력 있는 조각으로 방출합니다.
조직을 작은 조각으로 자른다. 조각을 예동 전열 용해 용액 1 밀리리터에 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 P1000 파이펫으로 고환 조각을 50회 부드럽게 세리라세이션합니다.
튜블러가 서로 분리되어 있는지, 그리고 간질 조직으로부터 분리되는지 확인합니다. 덩어리가 남아 있으면 5분 동안 배양하고 다시 세리라울 수 있습니다. 해리 혼합물의 1 밀리리터당 33마이크로리터의 히알루로니다제 스톡 용액을 추가합니다.
그런 다음 P1000 파이펫으로 50회 세리라기하고 샘플을 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 인큐베이션 후 P200 파이펫으로 50회 세리라위드합니다. 눈에 보이는 튜블러 나 세포의 덩어리가 존재하지 않도록 한 후, 샘플의 총 부피의 10 %에 FBS를 추가하여 해리 효소를 담금하고 P200 파이펫으로 여러 번 세례합니다.
40 마이크로미터 셀 스트레이너의 중앙을 미디어로 적시고 흡인한 다음 미리 젖은 여조기에 샘플을 추가하고 필터링하여 단일 셀 서스펜션을 생성합니다. 7분 동안 100배 g의 서스펜션을 원심분리합니다. 상체를 버리고 신선한 BM에서 세포를 다시 중단합니다. 트라이판 블루 제외를 사용하여 혈종계에서 실행 가능한 세포를 계산한 다음 원심 분리기를 다시 원심분리기를 다시 사용하여 신선한 BM에서 다시 중단하십시오. 2D ECM 프리 배양의 경우, 플레이트 단일 셀 서스펜션을 4웰 챔버 슬라이드에 직접 플레이트하고 슬라이드를 섭씨 35도 인큐베이터에 넣습니다.
2D ECM 배양의 경우, 차가운 일대일 희석 세포 외 매트릭스 배지 100 마이크로리터를 4웰 챔버 슬라이드에 분배하여 젤이 접시 바닥을 덮도록 합니다. ECM이 젤로 중합할 수 있도록 최소 30분 동안 인큐베이터에 슬라이드를 넣은 다음 위에 셀 서스펜션을 추가합니다. 3D ECM 프리 문화를 원해보려면 아가로즈 3D 페트리 요리를 24웰 문화 요리에 넣고 BM 1밀리리터로 덮습니다. 요리는 35도 섭씨 인큐베이터에서 적어도 30 분 동안 BM에서 평형화 한 다음 BM을 버리고 신선한 BM의 1 밀리리터로 다시 한 번 평형을 반복하십시오. 모든 BM을 우물에서 제거하고 3D Petri 접시의 중앙 오목 내부가 아닌 신선한 BM의 200 마이크로 리터를 분배한 다음 마이크로 웰 인서트의 중앙 셀 파종 내부에서 남은 BM을 수집합니다.
단일 셀 서스펜션을 중앙 오목으로 분배하고 위아래로 부드럽게 세트리튜트합니다. 문화를 위해 가습섭 씨 35도 인큐베이터에 접시를 넣습니다. 다음 날, 아가로즈 3D 페트리 접시 주변에서 기존 미디어를 천천히 조심스럽게 제거하고 신선한 BM1 밀리리터로 대체하십시오. 오르가노이드는 하룻밤 동안 압축되어 바닥에서 휴식을 취할 수 있어야합니다.
3D ECM 배양의 경우, BM내 세포 현탁액의 동일한 부분을 차가운 사전 해동 ECM과 결합하여 단일 셀 서스펜션을 준비한다. 잘 혼합되어 있는지 확인하기 위해 여러 번 세리라위. 그런 다음 즉시 혼합물을 4웰 챔버 슬라이드에 분배하여 플레이트의 전체 바닥을 덮습니다.
챔버 슬라이드를 섭씨 35도에서 배양하고 내용물들이 적어도 30분 동안 중합되도록 합니다. 중합 후, 배양 위에 BM의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 문화는 섭씨 35도에서 모든 오르가노이드 모델 유형.
모든 문화 유형의 경우 미디어의 절반을 2일마다 신선한 BM으로 교환하십시오. 이 프로토콜은 청소년 골린 고환 세포를 사용하여 24 시간 이내에 오르가노이드 생성을 달성하는 데 사용되었습니다. 성공적으로 생성된 조직은 처음에 3D 세포 클러스터로 관찰되었다.
ECM 환경에서 셀 클러스터는 클러스터와 주변 환경 사이에 명확한 여백을 가지고 있습니다. 세포 클러스터는 또한 ECM을 통해 마이그레이션하고 함께 융합하는 것을 관찰했습니다. 3D ECM 배양은 다른 모든 문화 방법보다 드 노보 구조를 조립하는 데 훨씬 더 많은 시간이 필요했습니다.
그리고 3D ECM 프리 문화는 3D 아가로즈 페트리 접시의 각 우물 내에서 하나의 크고 컴팩트한 클러스터로 가장 큰 클러스터를 생산했다. 오르가노이드 모델이 토착 조직과 유사한지 여부를 평가하기 위해 생물학적 구조는 세포 별 마커를 위해 프로브되고 면역 형광으로 시각화되었습니다. 2D ECM 및 3D ECM 프리 방법은 고환 구획화의 매우 모방내형태가 있는 오르가노이드를 생산했습니다.
3D ECM 이없는 조립 된 오르가노이드에서 장기 분석을 수행했습니다. 오르가노이드는 14 일 동안 배양 된 다음 세포 및 구조 별 마커를 조사했습니다. 튜블러 와 같은 구조물이 관찰되었다.
3D ECM 없는 오르가노이드는 또한 생식선 자극을 가진 12 주 문화에 있는 내분비 기능을 위해 공부되었습니다. 테스토스테론과 인히빈 B는 모두 오르가노이드 조절 배지에서 정량화되었다. 후 12 주, gonadotropins에 대 한 제거 되었다 48 시간, 남성 호르몬과 inhibin B 농도 감소 원인.
생식선 호르몬 반환 될 때, 두 호르몬 농도 크게 증가, 적절 한 내 분 비 응답성을 보여주는. Organoid 어셈블리는 실행 가능한 미성숙 고환 세포의 자율적 행동을 활용합니다. 창의적인 실험은 맞춤형 셀 정렬 또는 하이브리드 세포 혼합물을 사용하여 쉽게 고안될 수 있습니다.
세포 파종 에 이어, 라이브 비디오 이미징 또는 시간 경과 이미징은 오르가노이드 자체 조립을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 문화 전반에 걸쳐, 오르가노이드 및 상태 배지는 조직학 및 아미노 분석 분석을 위해 수집될 수 있다.
