이 연구는 일본 교육문화체육관광부(18K04843)에서 YST ERATO(JPMJER1502)에서 N. 노무라까지 과학연구보조금으로 부분적으로 지원되었다.

1. 샘플 준비
<ol><li>유리 슬라이드에 우물이 있는 1mm 두께의 실리콘 개스킷을 놓습니다.</li>
	<li>실리콘 개스킷의 우물에 1mm 두께0.8%(w/v) 아가로즈 슬래브를 놓습니다.</li>
	<li>임의미생물세포배양주의 세포밀도를 600nm(OD660) = 1.0에서 광학 밀도로 희석한다.</li>
	<li>아가로즈 슬래브에 세포 현탁액의 5 μL 알리쿼트를 놓습니다.</li>
	<li>유리 커버슬립으로 부드럽게 덮습니다.</li>
</ol>2. 현미경의 설정
참고: CRIF 기술은 공초점 반사 현미경 검사법(CRM)과 멀티채널 공초점 현미경 분석법을 결합합니다. CRM은 세포 선천성 형광과는 무관한 세포 형태학 및 공간 국소화를 위한 정보의 근원 역할을 합니다. 멀티채널 공초점 현미경 검사는 세포 선천성 형광의 스펙트럼 정보를 제공합니다. 다음 프로토콜에서, CRM 또는 공초점 형광 현미경 분석기로 취득된 모든 심상은 CRM 영상 또는 다중 채널 공초점 현미경 분광법 심상으로, 각각 지칭된다.
<ol><li>소멸된 스펙트럼 채널과 공초점 현미경을 광증 튜브(PMT) 또는 GaAsP 검출기에 연결합니다. 참고: 이러한 설정은 여러 제조업체에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>현미경에 높은 숫자 조리개 (NA) 목표를 적절한 배율로 장착하십시오. 참고: NA > 1.4를 가진 63x 목표는 세균성 세포를 분석하기 위해 권장됩니다.</li>
	<li>현미경에 반 반사 거울(예: NT 80/20)을 장착하여 사고 광의 세포 분산에 의존하여 세포 형태를 시각화하는 CRM을 수용하십시오.</li>
	<li>멀티채널 공초점 현미경 검사법의 경우 현미경에 이색 거울을 장착하십시오. 예를 들어, MBS InVis405, MBS458, MBS458/514, MBS488/543, 또는 MBS 488/543/633 빔 스플리터 405, 458, 488, 514, 543, 또는 633 nm, excitationly를 사용합니다.</li>
	<li>레이저 파워 미터를 사용하여 각 여기 파장에 대한 조명 강도를 조정합니다. 여기 파장을 통해 현미경 의 밑에 출력을 일정하게 유지하십시오 (예를 들어, 63x 목표와 함께 50 μW를 사용하십시오).</li>
</ol>3. 이미지 수집
<ol><li>현미경 소프트웨어를 사용하여 핀홀 크기를 1AU로 설정합니다.</li>
	<li>각 여기 파장에 대해 픽셀 거주 시간(예: 스캔 속도)을 설정합니다. 참고: 픽셀 이너무 긴 픽셀 거주 시간은 세포를 손상시킬 수 있습니다. 셀의 광피해를 최소화하기 위해 픽셀이 지나치게 긴 시간을 피하십시오. 세균성 시료의 경우, 픽셀 거주 시간 <55.6 μs/μm2 (현미경의 절개 출력이 ~17 μW/cm2인 경우)는 일반적으로 성장 억제를 피하기에 적합하다. 이 매개 변수는 유기체 및 실험 설정에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>스캔 해상도를 설정합니다. 박테리아와 같은 작은 세포의 경우 1,024 x 1,024의 스캐닝 영역을 사용하십시오.</li>
	<li>관심 영역이 다루어지되도록 Z 스캐닝 범위를 설정합니다. 참고: 아가로즈 슬래브에 분포된 세균 및 효모 세포 샘플의 경우, -15 μm의 Z 스캐닝 범위는 일반적으로 충분합니다.</li>
	<li>가시 파장 범위(예: 416-691 nm)를 캡처하기 위해 탈세 검출기를 설정합니다. 8-10 nm의 스펙트럼 창을 사용합니다.</li>
	<li>다중 채널 공초점 현미경 이미지를 가장 긴 에서 최단 흥분 파장에서 순서로 획득하여 형광 이미지의 Z 스택을 만듭니다.</li>
	<li>CRM 이미지를 획득합니다.</li>
	<li>획득한 이미지를 16비트 티프 파일로 디렉토리에 저장합니다. XXX가 흥분 파장인 명명 규칙 XXXcYzZZ.tif를 사용하여 파일의 이름을 지정하고, YY는 검출기 채널 번호이고, ZZ는 Z 슬라이스 번호이며, "c"와 "z"는 각각 검출기 번호와 Z 슬라이스 번호의 접두사입니다.<ol>
<li>예를 들어, 다중 채널 공초점 마이크로스펙트로스크 이미지가 405nm, 검출기 어레이의 제1 검출기 채널의 내분 파장으로 촬영되고, Z-스택의 5번째 슬라이스인 경우, "405c01z05.tif"라고 지칭한다. CRM 이미지의 경우 XXX 대신 문자열 "CRM"을 사용합니다(예: "CRMc01z05.tif"). 참고: 2D 또는 3D 세분화가 이미지 데이터에 가장 적합한지 여부를 결정합니다. 작은 세포가 2D 평면에 제약을 받는 상황에서 2D 세분화 방법을 사용합니다(예: 유리 표면에 어항을 인고하는 세균 모집단). 세포 집단이 3차원 공간(예를 들어, 생물막 및 조직 샘플)에 분포되는 상황에서 3D 세분화 방법을 사용하거나 세포 크기가 광학 슬라이스의 두께(예를 들어, 효모 세포, 포유류 세포)의 두께보다 크다. 2D 세분화의 경우 섹션 4를 참조합니다. 3D 세분화의 경우 섹션 5를 참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 2D 이미지 분석
<ol><li>워크스테이션에 이미지 분석 소프트웨어(예: MATLAB)를 장착합니다.</li>
	<li>단세포 선천적 형광 서명의 세포 세분화 및 재구성을 수행합니다.<ol>
<li>이미지 분석 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>제공된 스크립트 "Script2D.m"를 두 번 클릭하고 엽니다.</li>
		<li>편집기 탭으로 이동한 다음 실행을 클릭합니다. 폴더 선택 창이 나타납니다.</li>
		<li>3.8단계에서 만든 디렉토리를 선택한 다음 열기 를 클릭하여 진행합니다. 분할 매개 변수의 입력을 묻는 대화 상자가 자동으로 나타납니다. 참고: 테스트 목적으로 제공된 데이터 집합("Sample_2D")을 선택합니다. 샘플 데이터 집합은 압축 된 파일로 제공되며 사전에 추출해야합니다.</li>
		<li>분할 매개 변수 입력: 이미지 비나화에 대한 이미지 Binarization (0-1) = 0.45, 셀 영역(픽셀) = 200, 셀 영역(픽셀) = 10, 검출 기 수 = 32에 대한 낮은 임계값. 확인 을 클릭하여 진행합니다. 참고: 이러한 매개 변수는 이미지 품질에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>CRM 이미지를 표시하는 새 이미지 창이 나타나야 합니다. 백그라운드 영역(예: 셀이 없는 영역)을 선택하여 백그라운드 빼기에 사용합니다. 마우스 드래그하여 CRM 이미지 내에서 사각형을 그립니다. 선택한 영역 내에서 두 번 클릭하여 선택을 확인합니다.</li>
		<li>4.2.4 단계에서 선택한 동일한 디렉터리에서 서명 이라는 새 디렉터리를 찾습니다. 참고: 제공된 코드는 자동으로 이 디렉터리를 만듭니다. "서명" 디렉터리는 일반적인 접두사 "서명"후에 일련 번호가 매겨진 .png 파일로 각 미생물 셀의 타고난 형광 서명을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.3D 이미지 분석
<ol><li>워크스테이션에 이미지 분석 소프트웨어(재료 표)를 장착합니다.</li>
	<li>단세포 선천적 형광 서명의 세포 세분화 및 재구성을 수행합니다.<ol>
<li>이미지 분석 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>제공된 스크립트 "Script3D.m"를 두 번 클릭하고 엽니다.</li>
		<li>편집기 탭으로 이동한 다음 실행을 클릭합니다. 폴더 선택 창이 나타납니다.</li>
		<li>3.8단계에서 만든 디렉토리를 선택한 다음 열기 를 클릭하여 진행합니다. 분할 매개 변수의 입력을 묻는 대화 상자가 자동으로 나타납니다. 참고: 테스트 목적으로 제공된 데이터 집합("Sample_3D")을 선택합니다. 샘플 데이터 집합은 압축 된 파일로 제공되며 사전에 추출해야합니다.</li>
		<li>분할 매개 변수 입력: 이미지 비나화에 대한 이미지 비나화 임계값 (0-1) = 0.01, 셀 볼륨(픽셀) = 1,000, 셀 영역(픽셀) = 20, X 픽셀 크기 [μm/픽셀] = 0.26, Y 픽셀 크기 [μm/픽셀] = 0.26, Z 픽셀 크기 [μm/픽셀] = 0.42= 0.42, 및 검출기 의 수 = 32. 확인 을 클릭하여 진행합니다. 여기 파장의 수에 대한 입력을 묻는 대화 상자가 나타납니다. 참고: 이러한 매개 변수는 이미지 품질에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>이미지 수집에 사용되는 파장의 수를 입력합니다(예: 405, 488, 561, 630이 사용되는 경우 대화 상자에 4 를 입력). 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>가장 짧은(즉, 상자 이름: 여기 1번)에서 대화 상자에 가장 긴 파장에 이르는 순서로 여기 파장을 입력합니다. 확인 을 클릭하여 진행합니다. CRM 이미지를 제공하는 새 이미지 창이 팝업되어야 합니다.</li>
		<li>백그라운드 빼기에는 임의백 영역(즉, 셀이 없는 영역)을 선택합니다. 마우스 드래그하여 CRM 이미지 내에서 사각형을 그립니다. 선택한 영역 내에서 두 번 클릭하여 선택을 확인합니다.</li>
		<li>5.2.4 단계에서 선택한 디렉터리에서 서명 이라는 디렉토리를 찾습니다. 참고: 제공된 코드는 자동으로 이 디렉터리를 만듭니다. "서명" 디렉터리는 일반적인 접두사 "서명"을 한 후 일련 번호가 매겨진 .png 파일로 각 단일 미생물 셀의 타고난 형광 서명을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 통계 분석
참고: 치수 감소 기술(예: 주 성분 분석[PCA])을 수행하여 세포 집단의 하이퍼스펙트럼 분포를 시각화합니다. 제공된 스크립트(PCA.py)는 두 개의 셀 모집단(즉, 두 클래스)에 대해 PCA를 실행합니다.
<ol><li>워크스테이션에 프로그래밍 언어와 함께 제공되는 라이브러리 및 모듈(재료 표)을 장착합니다.</li>
	<li>C 드라이브(또는 이와 동등한)에 빈 디렉터리를 만들고 디렉토리 "Parent_directory"(예: C:/)의 이름을 지정합니다. Parent_ 디렉토리).</li>
	<li>두 셀 모집단의 형광 서명(예: 4.2.7단계에서 생성된 .png 파일)을 두 개의 개별 디렉터리로 저장합니다. 참고: 두 디렉터리 모두 "Parent_directory"에 있어야 합니다. C:/Parent_directory/ <img alt="image 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">푸티다KT2440/ <img alt="image 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">시그니처01.png <img alt="image 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">시그니처02.png <img alt="image 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">: <img alt="image 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">푸티다KT2442/ 
	 <img alt="image 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">시그니처01.png 
	 <img alt="image 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">시그니처02.png 
	 <img alt="image 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">:</li>
	<li>"Parent_directory"에 PCA.py 다운로드합니다.</li>
	<li>워크스테이션의 명령줄 인터페이스를 엽니다.</li>
	<li>명령줄 인터페이스에 "파이썬 C:/Parent_directory/PCA.py"를 입력합니다.</li>
	<li>'대상 디렉토리 선택'이라는 메시지가 표시된 후 'Parent_directory'을 선택합니다.</li>
	<li>"C:/Parent_directory"에서 결과 PCA 플롯이 포함된 "PCA.png"를 찾습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

재현 가능한 결과를 얻기 위해 밀접하게 따라야 하는 두 가지 중요한 점이 있습니다: 1) 심내 목표하에서 레이저 전력 출력을 관찰하고, 2) 정확한 세포 세분화를 수행한다.
첫 번째 점은 다른 실험 중 타고난 형광 서명을 비교할 때 특히 중요합니다. 최대 전력 출력이 레이저 라인 간의 크기 순서까지 다를 수 있기 때문에 단순히 동일한 "백분율 출력" 설정을 여기 파장(예: 405, 488, 514 및 530 nm 레이저 라인 모두에 대해 5%의 전력 출력을 사용하는)에 적용하지 마십시오. 또한, 목표와 내부 광학은 일반적으로 고르지 않은 광학 흡수 특성을 가지며, 이는 또한 고려해야 한다. 이러한 이유로 레이저 파워 미터(재료 표)를 사용하여 목표하에서 출력을 측정하는 것이 좋습니다. 레이저 라인의 출력이 몇 년 동안 크게 붕괴 될 수 있기 때문에 이 측정을 몇 가지 실험마다 또는 주기적으로 하는 것이 좋습니다.
두 번째 점, 정확한 세포 세분화는 종 내 또는 종 간 가변성이 우려되는 상황에서 특히 중요합니다. 부정확한 세포 세분화(그림 1D)는 이상값 데이터 포인트(그림 1E, 빨간색 삼각형으로 표시)와 더 큰 명백한 종 내 가변성을 초래합니다. 세분화 매개 변수는 추가 분석 또는 교육 기계 학습 모델로 진행하기 전에 세분화 결과를 원래 CRM 이미지에 오버레이하여 셀 세분화 정확도를 검사하여 신중하게 결정해야 합니다. 품질이 좋지 않은 이미지로 작업하는 경우 정확한 세분화를 달성하기 위해 추가 이미지 처리가 필요할 수 있습니다. '가우시안 필터' 또는 '중앙값 필터'를 사용하면 거친 아티팩트를 제거할 수 있으며, 양자 간 필터 처리는 스트라이프 배경을 카운터로 처리합니다.
품질이 좋지 않은 광학(예: 비공초점 등급 목표) 또는 검출기 감도 가 부족하여 희미한 선천성 형광 서명의 검출을 처리하는 것은 어려울 수 있습니다. 여기에 설명된 설정을 사용하여 111이전에는 선천적 형광이 너무 희미하여 선천적 형광 서명을 재구성하는 세포 샘플의 어떤 유형도 발생하지 않았습니다. 여기에 대한 높은 방출 출력과 더 긴 픽셀 거주 시간을 사용하여 더 강한 방출 신호를 얻을 수 있지만, 이것은 세포 샘플에 손상을 일으킬 수 있습니다. 희미한 선천적 형광이 문제가되는 경우의 잠재적 인 해결책은 예를 들어 국물 대신 버퍼 또는 합성 미디어에서 세포를 일시 중단하여 배경 신호 강도를 줄이는 것입니다. 아가로스 슬래브가 본전 및 이전 연구에서 세포를 유지하였음에도 불구하고 유리 바닥 접시 및 미세 유체 장치와 같은 세포 용기의 유형은 이 기술에 적합하고 적합합니다15.
공초점 현미경 방법은 부착 세포 인구, 생물막 및 조직 샘플을 위한 공간 해상도 및 시상 분석을 제공합니다. 예를 들어, 이 방법론의 잠재적 인 절충은 유동 사이토미터에 비해 최대 처리량입니다. 단일 스캔 세트로 수백~100개의 선천형 형광 서명을 수집하는 전체 공초점 스캔 세트는 최대 몇 분정도 걸릴 수 있습니다. 유량 사이토미터는 광학 설계로 인해 민감하지 않지만 잠재적으로 몇 배의 크기로 인해 처리량을 달성할 수 있습니다.
선천적 형광 서명에서 특정 피크를 담당하는 화합물을 엄격하게 식별하는 것은 일반적으로 복잡한 특성으로 인해 도전적입니다. 그러나, 비타민(예를 들어, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드[FAD]), 코엔자임(예를 들어, 니코티나미드 아데닌 디뉴클레오티드[NADH]) 및 리포푸스신 안료와 같은 다수의 생물학적 관련 분자가 세포에서 주요 형광이 될 수 있다고 제안되었습니다. 예를 들어, FAD는 350-450 nm 사이의 최대 흥분과 약 525 nm16에서 방출 피크를 가지고 있습니다. 무료 NADH는 단백질 바운드 NADH의 방출 스펙트럼은 16,17,18과 다르지만 각각 340 nm 및 460 nm에서 흥분 최대 및 방출 피크를 가지고 있습니다. 스트레스 또는 숙성 세포와 연관되는 것으로 알려진 리포색소침착은 광범위한 흥분 범위(350-500 nm) 및 방출 범위(450-600 nm)16,18을 갖는다.
CRM의 사용은 세포 윤곽을 식별하는 정보의 독립적 인 소스를 제공하고 따라서 CRIF의 또 다른 중요한 이점을 제공합니다 : 3D 공간에 분포 된 개별 세포에서 형광 신호의 선택적 추출. 이는 중간 성분, 분비된 대사산물 및 세포외 매트릭스로부터 비세포 신호로 오염된 방대한 수의 세포로부터의 신호의 평균 혼합물인 전체 미생물 식민지 또는 벌크 배양 현탁액의 형광 특성의 전통적인 분석에서 한 걸음 앞으로 나아간 것을 나타낸다.  단세포 인천성형광 서명의 분석은 그대로 세포의 생리적 상태의 예측 특성화를 허용하고, 세포의 분포 및 생리 상태의 현세적 발달을 해결하기위한 잠재적 인 솔루션을 제공합니다.

셀1 내의 다양한 생체 분자는 자가 형광 신호를 방출하고, 세포의 타고난 형광 서명은 이러한 신호의 조립으로 구성된다. 이 시그니처 형광은 다양한 세포 특성과 생리적 상태의 차이를 반영합니다. 선천적 형광의 분석은 최소 침습적이며 온화한 신진 대사 수정에서 완전한 세포 파괴에 이르기까지 다양한 흔적을 남기는 전통적인 침습적 미생물 프로브를 보완 할 수 있습니다. DNA 또는 세포 함량 추출2,3, 시투 혼성화4의 형광등, 그리고 게놈에 형광 기자 유전자의 도입과 같은 전통적인 기술은 세포 유형 또는 생리적 상태를 결정하는 데 효과적이지만, 일반적으로 세포의 조작또는 침습적 태깅이 필요합니다.
벌크 미생물 배양 현탁액5,6, 활성 슬러지7, 포유류 조직8,9 및 포유류 세포를 포함한 다양한 살아있는 및 그대로 미생물 식민지의 타고난 형광에 대한 연구는 선천성 형광 분석이 세포 유형 및 생리 상태의 태그 없는 분석을 용이하게 하는 것으로 나타났습니다. 선천적 형광 서명은 전통적으로 단일 세포 수준이 아닌 인구 수준에서 분석되어 클론 배양을 필요로합니다. 대조적으로, confocal refction microscopy-보조 단세포 innate fluorescence 분석 (CRIF) 기술11 여기에 설명된 각 개별 살아있는 미생물 세포의 타고난 세포 형광 서명을 재구성하고 카탈로그합니다. 더욱이, CRIF는 3차원(3D) 공간에 분포되는 집단 내에서 단일 미생물 세포의 선천적 형광 서명을 체계적으로 대조할 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="720">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Agarose</td>
			<td style="width:220px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">312-01193</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Beam splitters</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cover slips</td>
			<td style="width:220px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C024601</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass slides</td>
			<td style="width:220px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S011120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Half-reflection mirror</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NT80/20</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Laser power meter</td>
			<td style="width:220px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">PM400 (power meter console) and S175C (sensor)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">LB Broth</td>
			<td style="width:220px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:119px;">20066-95</td>
			<td>For bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:220px;">The MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Microscope objective</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;">440762-9904</td>
			<td style="width:167px;">e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microscope software</td>
			<td style="width:220px;">Carl Zeiss, Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PBS(-)</td>
			<td style="width:220px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">166-23555</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:215px;">Programming language</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Silicone gasket</td>
			<td style="width:220px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P24744</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Workstation</td>
			<td style="width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1500-250G</td>
			<td>For yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">YPD medium</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstruction of single-cell innate fluorescence signatures by confocal microscopy

여기서 설명된 공초점 반사 현미경 보조 단세포 인천성광 분석(CRIF),3차원(3D) 공간에 분포된 인구에서 각 개별 라이브 셀로부터 선천적인 세포 형광 시그니처를 재구성하는 최소 침습적 방법이다. 세포의 타고난 형광 시그니처는 세포 내의 다양한 생체 분자에 의해 방출되는 형광 신호의 모음입니다. 이전 연구는 타고난 형광 서명이 다양한 세포 특성과 생리적 상태의 차이를 반영하고 세포 특성화 및 식별을위한 풍부한 정보 소스임을 확립했습니다. 선천적 형광 서명은 전통적으로 인구 수준에서 분석되어 복제 배양을 필요로하지만 단일 세포 수준에서는 그렇지 않습니다. CRIF는 개별 세포에서 형광 신호의 3D 해상도 및/또는 선택적 추출을 요구하는 연구 결과에 특히 적합합니다. 형광 서명은 세포의 타고난 특성이기 때문에 CRIF는 그대로 및 단일 세포의 유형 및 / 또는 생리 적 상태의 태그없는 예측에도 적합합니다. 이 방법은 이종 집단에서 각 단일 세포의 표현형이 세포 태그없이 현미경의 밑에 그것의 자동 형광 서명에 의해 직접 평가될 수 있는 능률적인 세포 분석을 위한 강력한 공구일 지도 모릅니다.

도 1A는 전통적인 스펙트럼 플롯(top)과 히트맵(middle)으로 제시된 세균 세포의 전형적인 단세포 형광 서명을 나타낸다. 도 1B는 토양 박테리아집단의 원래 CRM 이미지 위에 중첩된 정확한 2D 세포 세분화의 결과를 나타낸다(슈도모나스 푸티다 KT2440)12. 인구에 대한 그 결과 타고난 형광 서명은 도 1D의 히트맵으로 제시됩니다. 성공적인 세포 세분화 에 따라 인구 내 변동성은 상대적으로 미미했다. 부정확한 세포 세분화의 예는 도 1B에 도시된 것과 동일한 P. putida에 겹쳐지는 도 1C에 도시된다. 인구의 타고난 형광 서명에 부정확한 세포 세분화의 영향은 상당한 수의 이상치(그림 1E, 빨간색 삼각형)에서 쉽게 명백합니다. 부정확한 세포 세분화는 정확한 세포 세분화에 따라 얻어진 단단한 클러스터에 비해 PCA 후 느슨한 클러스터를 초래하였다(도 1F).
전형적으로 종 내 가변성에도 불구하고, 다른 세포 모형의 선천적인 형광 서명은 별개의 클러스터를 형성합니다. 도 2C는 분류적으로 가까운 균주 쌍에 대한 PCA 분석의 결과를 제시한다 (P. putida 변형 KT2440 및 변형 KT244213). 각 개별 집단(그림 2A, B) 내에서 관찰된 사소한 가변성에도 불구하고 각 모집단은 PCA 분석 플롯(그림 2C)에 고유한 클러스터를 형성했습니다.
도 3A는 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae YM427114의 집단의 원래 CRM 이미지 위에 중첩 정확한 3D 세포 세분화의 결과를 보여줍니다. 도 3B는 인구에 대한 결과 타고난 형광 서명을 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120fig1v2.jpg"> 도 1: 세분화 및 명백한 종 내 가변성의 정확도. (A) 세균 세포의 전형적인 단세포 인천성 형광 서명 (P. putida KT2440), 스펙트럼 플롯 (상단) 및 열지도 (중간)로 제시. 방출 파장이 무지개 색 맵(아래쪽)으로 표시됩니다. 스펙트럼 플롯의 Y 축과 열 맵의 색상은 모두 상대형광 강도를 나타냅니다. 하단의 숫자는 여기 파장을 나타냅니다. 이미지 분석 알고리즘에 의한 정확한(B) 및 부정확한(C) 세포 영역 인식의 시각적 표현. 라이트 블루 차도는 토양 박테리아 P. 푸티다 KT 2440의 인구에 대해 검출된 세포 영역을 나타낸다. 패널 C 에 적색 번호가 있는 Blob은 알고리즘이 부적절한 바이너화 임계값 설정으로 인해 비셀 영역(즉, 배경 잡음)으로 분류된 잘못된 탐지의 예입니다. 스케일 바 = 전체 1 μm. 패널 D 및 E 는 각각 정확하고 부정확한 세포 세분화로 생성된 동일한 집단에 대한 타고난 형광 서명을 묘사합니다. 각 열은 1 x 192 매트릭스로 표시되는 재구성된 단일 셀 하이퍼스펙트럼을 나타내며, 여기서 노란색-파란색 색상 맵은 상대형 형광 강도를 나타냅니다. (F) PCA를 사용하여 시각화된 정확한(라이트 블루) 및 부정확한(빨간색) 세분화의 선천적 형광 서명의 차이. 각 축 레이블은 구성 요소 수와 PCA 분석에 대한 누적 백분율 기여를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61120/61120fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120fig2v2.jpg"> 그림 2: 선천성 형광 서명의 종내 및 종간 가변성. P. putida KT2440 (A) 및 P. putida KT2442 (B)의 인구에 대한 열지도로 제시 된 타고난 형광 서명. (C) P. putida KT2440 (빨간색, n = 288) 및 P. putida KT2442 (파란색, n = 373)에 대응하는 PCA를 사용하여 시각화 된 두 개의 타고난 형광 시그니처 쌍의 투영. X-및 Y축은 각각 PC1 및 PC2를 나타냅니다. 인세트 번호는 각 클러스터의 중심을 나타냅니다 (1: P. putida KT2440, 2: P. putida KT2442). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61120/61120fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120fig3v2.jpg"> 그림 3: 3D 세분화 및 타고난 형광 서명 추출의 예. (A) 신진 효모S. 세레비시아 에 YM4271의 세포 집단으로 인식된 영역의 3D 투영. 시작 번호는 식별 번호입니다. (B) 3D 영역에서 추출한 선천성 형광 서명의 열지도. X축 번호는 식별 번호에 해당합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61120/61120fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

여기서, 3차원 공간에 분포된 모든 개별 라이브 셀로부터 광적으로 추출 및 분류하는 프로토콜(즉, 세포 자동 형광)을 제시한다. 이 방법은 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 및 동물의 세포를 포함하여 단일 세포 해상도에서 다양한 생물학적 시스템의 타고난 형광 서명을 연구하는 데 적합합니다.

공초점 현미경 검사법에 의한 단세포 인천성형광서명의 재구성

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

reconstruction-single-cell-innate-fluorescence-signatures-confocal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

2.7K 조회수.  University of Tsukuba. 여기서, 3차원 공간에 분포된 모든 개별 라이브 셀로부터 광적으로 추출 및 분류하는 프로토콜(즉, 세포 자동 형광)을 제시한다. 이 방법은 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 및 동물의 세포를 포함하여 단일 세포 해상도에서 다양한 생물학적 시스템의 타고난 형광 서명을 연구하는 데 적합합니다.

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Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

연구

생물학

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

절연 및 Chlamydomonas Centrioles의 단일 입자 재건을 위한 형광 이미징

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often require indirect methods due to their small diameter (40-250 nm), which is beneath the diffraction limit of typical light microscopy. We have developed a super-resolution microscopy-based visualization of EVs to bypass the diffraction limit in both two and three dimensions. Using this approach, we can resolve the three-dimensional shape of EVs to within +/- 20 nm resolution on the XY-axis and +/- 50 nm resolution along the Z-axis. In conclusion, we propose that super-resolution microscopy be considered as a characterization method of EVs, including exosomes, as well as enveloped viruses.

Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) is used to bypass the typical diffraction limit of light microscopy and to view exosomes at the nanometer scale. It can be employed in both two and three dimensions to characterize exosomes.

3 차원에서 세포 외 소포의 직접 스토카스틱 광학 재건 현미경 검사

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...