이 프로토콜은 3D 콜라겐 샌드위치 환경에서 마우스 간세포의 격리 및 재현 가능한 장기 배양을 용이하게하여 정경 구조 형성 및 체외 치료에 대한 반응을 연구합니다. 일단 기술이 마스터되면, 그것은 체외 연구를 위한 높게 실행 가능하고 순수한 마우스 간세포 인구의 큰 양을 얻기 위한 빠른 방법입니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 인 Lenka Sarnova가 될 것입니다.
1차 간세포 절연 전날, 10X DMEM 100마이크로리터, 증류수 485마이크로리터, 500마이크로리터에 수산화나트륨 15마이크로리터를 쥐꼬리 콜라겐 1개에 추가합니다. 중화 콜라겐의 pH를 확인하십시오. 약 7.5이어야 합니다.
미리 차가운 200 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여, 플라스틱 3.5센티미터 직경 배양 접시각각에 중화 콜라겐 용액 100 마이크로리터를 얼음에 넣고 하룻밤 동안 표준 문화 조건하에서 접시를 놓습니다. 다음 날 아침, 콜라겐 층을 접시당 섭씨 37도의 1밀리리터로 37도 이상 3시간 동안 섭씨 37도에서 재수화합니다. 간을 분리하기 위해 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 마취 된 마우스를 supine 위치에 해부 매트에 놓고 매트에 하부 및 상부 사지를 테이프로 놓습니다.
70%에탄올로 복부를 면봉하고 음모 부위에서 각 앞다리까지 V자 절개를 합니다. 가슴을 접어 서 복 강을 밝히고 해부 현미경 아래에 매트를 놓습니다. 작은 내장과 결장은 Caudal 방향으로 이동하여 IVC를 노출시키고 2밀리리터 주사기를 37도 의 밀리리터 용액 C.Canula에 연결하고 PBS에 젖은 면봉을 사용하여 간을 다이어프램까지 누릅니다.
간 바로 아래에 IVC 주위에 젖은 봉합사를 놓습니다. 그런 다음 30 게이지 바늘을 장착한 인슐린 주사기를 사용하여 45도 각도로 구부러진 후, 헤파린의 밀리리터당 10마이크로리터를 포털 정맥에 주입한다. 간을 통조리로 삼려면 미세 수술 가위를 사용하여 간 바로 옆에 있는 IVC에서 작은 절개를 하고 캐뉼라를 절개에 삽입하십시오.
봉합사와 두 개의 수술 매듭을 제자리에 고정하고 관류 완충제가 간에서 흘러 나올 수 있도록 포털 정맥을 잘라냅니다. 그런 다음 주사기 플런저를 천천히 우울하여 약 15 초 동안 용액의 2 밀리리터로 간을 견딜 수 있습니다. 모든 용액이 전달되면, 신선한 섭씨 37도 용액 C와 연동 펌프를 미리 채우고 시스템에 기포가 없는지 확인하기 위해 관혈 장치를 확인하십시오.
주사기에서 캐뉼라를 조심스럽게 분리하고 빠르게 연결하지만, 달리는 연동 펌프의 튜브를 캐뉼라에 조심스럽게 연결합니다. 분당 2.5 밀리리터로 즉시 관류를 시작합니다. 2분 후 용액 D로 전환하고 10분 동안 관류를 계속하십시오.
관류의 끝에서, 조심스럽게 37섭씨 용액의 20 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원추형 튜브로 간을 수확 E.To하여 1 차 간세포를 분리하고, 칸눌라에 의해 간을 잡고, 간질로 간을 감싸고, 간구를 완충체로 노크하기 위해 튜브의 벽 주위의 조직을 문지르십시오. 모든 조직이 으깬 경우, 조직 슬러리를 70 마이크로미터 모공 나일론 여과기로 옮겨 고립된 세포를 새로운 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다. DMEM에서 40%의 20 밀리리터에서 간 세포를 원심분리에 의한 퇴적물을 회수하고 펠릿을 재중단합니다.
원심분리에 의해 살아있는 및 죽은 세포를 분리하고 20 밀리리터의 용액 E.원심 분리 후, 계산을 위한 신선한 용액 E의 10 밀리리터에서 펠릿을 재연한다. 계산 후, 1차 간세포 수를 간세포 배양 배지의 밀리리터 당 5개의 실행 가능한 세포로 3.75배 10배로 조정한다. 3D 콜라겐 샌드위치로 분리된 1차 간세포를 배양하려면 1밀리리터 파이펫을 사용하여 콜라겐 코팅 된 각 3.5 센티미터 직경 접시에 두 밀리리터의 셀을 고르게 분배하십시오.
세포 배양 인큐베이터에 세포를 3시간 동안 배치합니다. 인큐베이션 동안, 입증된 대로 접시당 중화 쥐 꼬리 콜라겐 1개의 용액100마이크로리터를 준비한다. 인큐베이션이 끝나면 배지 및 부착되지 않은 세포를 접시당 중화 콜라겐 100마이크로리터로 조심스럽게 교체하고 판을 세포 배양 인큐베이터로 1시간 동안 되돌려 보냅니다.
콜라겐이 고화되면, 각 접시에 신선한 간세포 배양 배지의 2 밀리리터를 신중하게 추가하고 현미경으로 매일 문화를 확인하는 3 ~8 일 동안 배양자에게 배양을 반환합니다. 3D 콜라겐 샌드위치 내의 1차 간세포의 면역 라벨링을 위해 각 샌드위치를 섭씨 37도 PBS로 조심스럽게 세척하고 실온에서 30분 동안 PBS당 PBS에서 4%의 파라포름알데히드1밀리리터로 배양을 수정합니다. 고정이 끝나면 PBS 의 2 밀리리터에서 10 분 동안 세 번 설거지 하면 세척당 0.1 %의 Tween 20으로 보충하십시오.
마지막 세척 후, PBS에서 1밀리리터0.1 의 글리신과 0.2%트리톤 X-100의 1밀리리터로 세포를 실내 온도에서 1시간 동안 세척한 다음 PBS 플러스 트위엔 20에서 3개의 세척을 시연하였다. 다음으로, 진공에 연결된 10마이크로리터 로드 팁을 사용하여 콜라겐의 상단 층을 부드럽게 방해하고 PBS Tween에서 5%소 세럼 알부민 1밀리리터로 비특이적 결합을 차단합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 접시에 용액을 차단에 희석 된 관심의 기본 항체를 추가하고 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양한다.
다음 날 아침, PBS Tween에서 3 개의 15 분 세척으로 설거지 다음 적절한 이차 항체로 5 시간 동안 37도에 라벨을 붙입니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS Tween으로 배양물을 두 번, 현미경 검사용 페이드 장착 배지로 접시를 장착하기 전에 입증된 증류수로 1회 세척합니다. 3D 콜라겐 샌드위치를 파종한 지 하루 만에 마우스 기본 간세포가 클러스터를 형성하고 담즙 카날리큘리의 대략 정기적인 네트워크에서 자체 조직되었습니다.
3 6 일 이내에, 5 10 세포의 클러스터는 일반적으로 카나리아 네트워크를 형성하는 완전히 편광 된 간세포로 관찰됩니다. 독소 또는 사이토스켈레톤 을 바꾸는 약물로 치료하는 것은 간세포 세포 골격과 담즙 카날리쿨리 너비, 모양 및 수의 변화를 초래합니다. 에탄올 치료는 케라틴 8의 조직에 온화한 영향만 을 나타내지만, 담즙 수반 폭의 불법성 및 분포를 증가시킨다.
ZO-1 염색의 신호 강도는 에탄올 처리 후 접합의 손실을 시사하는 처리되지 않은 대조군에 비해 에탄올 처리 담즙 카날리큘리에서 감소된다. Blebbistatin와 actomyosin 수축의 억제는 무질서한 모양의 형성을 유도, 두꺼운, 둥근 담즙 카날리큘리. 또한, 오카다산으로 치료하는 것은 케라틴의 물리적 특성에 강하게 영향을 미치고 치료되지 않은 대조군에 비해 현저하게 좁혀진 담즙 카날리큘리를 초래하는 인산을 억제합니다.
또한, 에탄올 치료는 알라닌과 아파르타테 아미노 전달의 수준을 크게 높여 심각한 간세포 손상을 시사하는 반면, 블리스타틴 치료는 트랜스아미나아제 수치와 오카다산 치료에 대한 고려 변화가 발생하지 않으며, 알라닌 아미노트랜스퍼효소의 가벼운 생화학적 변화를 유발하지만 아미노트랜스퍼효소를 분리하는 어떠한 변화도 유발되지 않는다. 캐니언레이션 과 관류의 시작 부분에 상대적으로 빠르게 작동 하 고 관류 시스템에 입력 하는 거품을 방지 하는 것이 중요 하다. 세포 용액은 단백질 발현 및/또는 활성화 단계의 변화가 치료 중에 발생하는지 여부를 결정하기 위해 관심있는 단백질에 대한 중복 우물에서 수집 될 수 있습니다.
