깨지기 쉬운 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신 구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 견고한 폴리머라제 연쇄 반응 기반 분석

이 비용 효율적인 방법은 FXS 및 깨지기 쉬운 X 관련 질환의 분자 진단 및 스크리닝에서 광범위한 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다. 소요 시간이 빠르고 장비에 대한 투자가 줄어듭니다. 당사의 PCR 기반 분석체는 견고성과 신속한 보고 시간을 가진 중간, 사전 순열 및 완전한 돌연변이를 포함하여 FXS 및 깨지기 쉬운 X 관련 무질서의 전체 스펙트럼의 분류를 촉진할 수 있습니다.

절차는 퍼키넬머 싱가포르의 웬 추아에 의해 입증될 것입니다. PCR 버퍼 믹스, 샘플 희석제 및 DNA 샘플을 섭씨 20도 냉동고에서 제거하고 해동하는 데 20~30분 동안 실온에서 둡시하십시오. 시약을 사용하기 전에, 소용돌이와 잠시 아래로 회전.

분광계로 DNA 샘플 농도를 측정하고 필요한 경우 샘플 희석제를 사용하여 마이크로리터 당 25 나노그램으로 희석합니다. PCR 플레이트의 웰에 레이블을 지정하여 참조 및 테스트된 DNA 샘플을 식별하고 검사, 참조 및 음수 제어 샘플에 필요한 반응 수를 계산합니다. PCR 버퍼 믹스 15마이크로리터를 샘플 희석제 0.6 마이크로리터및 각 반응에 대해 폴리머라제 0.4 마이크로리터를 결합하여 PCR 마스터 믹스를 준비한다.

믹스를 소용돌이시키고 아래로 회전합니다. 그런 다음 혼합물의 18 마이크로리터를 각 우물에 분배합니다. 그런 다음 각 DNA의 두 마이크로 리터를 적절한 우물로 피펫합니다.

시약을 5번 위아래로 파이프로 섞은 다음 판을 밀봉합니다. 플레이트를 열순환기에 놓고 원고 의 방향에 따라 PCR을 실행합니다. 인큐베이터 셰이커를 섭씨 65도로 예열하고 각 PCR 제품에 1X TE 버퍼 80마이크로리터를 추가합니다.

멀티채널 파이펫을 사용하여 샘플을 PCR 정리 플레이트로 옮기고 플레이트를 셰이커에 넣습니다. 1200 RPM에서 10 분 동안 흔들면서 섭씨 65도에서 배양하십시오. 인큐베이션 후 인큐베이터 셰이커를 섭씨 25도로 식히고 진공 기기를 250밀리바르로 설정하고 필터를 통해 용액을 흡인시합니다.

15분 후, 우물에는 액체가 남아 있지 않아야 합니다. 진공을 끄고 각 웰에 1X TE 버퍼50 마이크로리터를 추가합니다. 이전 진공 설정을 사용하여 10분 동안 솔루션을 흡인합니다.

종이 타월 더미에 단단히 눌러 필터 플레이트의 바닥을 건조한 다음 각 우물의 하단 중앙에 1X TE 버퍼 20 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 셰이커에 놓고 섭씨 25도에 배양하고 1200 RPM에서 5분간 흔들어 줍니다. 인큐베이션 후, 정제된 PCR 제품의 최소 15마이크로리터를 신선한 96웰 PCR 플레이트로 전송한다.

시작하기 전에 DNA 염료 농축물, DNA 젤 매트릭스, DNA 마커, DNA 사다리 및 정제 된 DNA 샘플을 실온으로 가져옵니다. 주사기를 교체하고 베이스 플레이트를 조정하여 프라이밍 스테이션을 설정한 다음 주사기 클립의 레버를 놓고 상단 위치로 밀어 넣습니다. 크기 조정 소프트웨어를 시작하고 젤 염료 믹스를 준비합니다.

염료 농축액을 10초 동안 소용돌이치게 한 다음 아래로 회전합니다. 그런 다음, 젤 매트릭스 바이알에 염료의 25 마이크로 리터를 추가하고 혼합용액을 소용돌이. 젤 염료 믹스를 스핀 필터로 옮기고 원심분리기에 놓고 1500g에서 10분간 회전합니다.

젤 염료 믹스를 로드할 준비가 되면 새로운 DNA 칩을 프라이밍 스테이션에 삽입하고 G.Close로 표시된 젤 염료 믹스의 9마이크로리터를 프라이밍 스테이션에 넣고 플런서가 1 밀리리터 마크에 배치되도록 합니다. 주사기 플런저를 클립에 의해 보관될 때까지 아래로 누릅니다. 정확히 30초 동안 기다린 다음 클립을 놓습니다.

5초 더 기다린 다음 플런저를 1밀리리터 위치로 천천히 당깁니다. 프라이밍 스테이션을 열고 G.Add 5 마이크로리터의 마커를 사다리 기호와 12개의 샘플 우물각각에 추가하여 젤 염료 믹스 9개를 우물에 넣습니다. 사다리 기호와 PCR 제품 또는 물의 마이크로리터 1개를 샘플 우물에 추가하여 사다리의 마이크로리터 1개를 우물에 추가합니다.

2400 RPM에서 1 분 동안 칩을 소용돌이. 이를 생체 분석기에 삽입하고 5분 이내에 칩을 실행합니다. 실행이 완료되면 피크 데이터를 csv 테이블 파일로 내보냅니다.

전열 여성 샘플및 전체 돌연변이 여성 샘플은 참조 샘플로 사용됩니다. 상하 마커 피크는 단편 크기 프로파일에 포함되며 일반적으로 약 95개의 기본 쌍에서 프라이머 복합 피크가 있습니다. 이러한 참조 샘플은 회귀 표준 곡선을 구성하는 데 사용됩니다.

그런 다음 선형 회귀 표준 곡선을 사용하여 알 수 없는 샘플의 반복 크기를 계산합니다. 임상 정상, 중간, 전열, 전체 돌연변이 및 모자이크 전체 돌연변이 샘플은 이 방법으로 올바르게 분류될 수 있다. 경우에 따라, 정상 균질 알렐의 존재로 인해 가능성이 있는 미세 유체 전기 포감 결과에 하나의 피크가 표시됩니다.

최적이 아닌 결과의 한 가지 유형은 모호하거나 해석할 수 없는 기준 편향이며 기기 오작동으로 인한 것으로 의심됩니다. 이 절차를 시도할 때 프로토콜을 시작하기 전에 적절한 양의 DNA와 품질을 보장하는 것이 중요합니다. FMR1 유전자 염기서열분석은 AGG 중단 패턴을 확인하기 위해 수행될 수 있다.

그리고 메틸화에 민감한 제한 효소 또는 양성환 변형 분석이 메틸화 상태를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 이것은 빠르고 견고하며 비용 효율적인 기술입니다. 그것은 FXS와 깨지기 쉬운 X 관련 무질서의 캐리어 상태에 인구 기지를 둔 연구 결과에서 그밖 연구원을 도울 것입니다.