LC-MS/MS 진단 조각화 필터링을 통한 천연물 발견: Microcystin 분석을 위한 응용

천연 제품은 종종 화합물의 클래스로 생체 합성, 그리고 단일 제품으로. 진단 단편화 필터링은 복잡한 혼합물 내에서 모든 구조 관련 화합물을 검출하는 간단한 방법입니다. MZmine 소프트웨어 내에서 구현된 진단 조각화 필터링을 통해 분석가는 놓칠 수 없는 새로운 천연 제품에 대한 대량 분광법 데이터 세트를 탐색할 수 있습니다.

여기에는 새로운 바이오 제품과 새로운 독소가 포함됩니다. 음식과 물을 오염시키는 독소 클래스에 적용되는 진단 단편화 필터링은 노출 평가를 알릴 수 있습니다. 미생물 및 식물 추출물에 적용하면 새로운 화합물이 발견될 수 있습니다.

진단 조각화 필터링을 사용하면 화학 클래스를 정의하는 주요 탠덤 질량 분석 기능을 이해해야 합니다. 즉, 구조적으로 유사한 화합물은 특성 이온을 생성합니다. 제 이름은 숀 후그스트라입니다.

저는 우리 센터의 연구 기술자이자 소프트웨어 개발자이며, 절차를 시연할 것입니다. 미세 세포 분석용 샘플을 준비하기 위해 멸균 시아노박테리아 성장 배지의 30밀리리터를 밀리리터당 약 5배-10-5세포로 접종하고, 무균 조건하에서 250밀리리터 에를렌마이어 플라스크에서 혈전계로 세포 밀도를 모니터링한다. 광토트로직 배양 26일 후, 매일 한 번 소용돌이치는 섭씨 27도에서 12시간 광암제를 사용하여 시원한 백색 형광광으로 조명을 비추고, 47밀리리터 직경GF/C 유리 마이크로화이버 필터 용지를 사용하여 진공 여과에 의해 배양 배지로부터 세포를 분리합니다.

14 밀리리터 시험관에서 수확된 세포에 80%의 메탄올 3밀리리터를 넣고, 소용돌이를 30초 동안 각 튜브를 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, 3 회 연속 1 시간, 영하 20도 동결 및 15 분 실온 해동 사이클로 샘플을 lyse, 개별 0.22 마이크로 미터 폴리테트라플루오로틸렌 주사기 필터를 통해 각 생성 시아노 박테리아 세포 추출물을 필터링합니다. 부드러운 질소 가스 스트림을 사용하여 증발기로 추출물을 섭씨 30도에서 건조시키고 추출물을 섭씨 영하 20도에서 건조시 저장합니다.

액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 분석을 위해, 90%메탄올의 500 마이크로리터로 분석되는 건조된 잔류물을 재구성하고, 30초 동안 샘플을 소용돌이시킵니다. 호박색 고압 액체 크로마토그래피 바이알로 옮김합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 고해상도 질량 분광계에서 데이터 의존적 획득 방법을 사용하여 시아노박테리아 추출물을 분석합니다.

대부분의 미세 세포는 탠덤 질량 분석법, M ~ Z 135.0803 및 163.1114에서 두 개의 진단 제품 이온을 생산하는 ATA 잔류물을 함유하고 있습니다. 비표적 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 데이터 세트 준비, MZmine 2 열기 및 원시 데이터 방법 "드롭다운 메뉴"에서 원시 데이터 가져오기를 선택합니다. 그런 다음 미세 사이스틴 분석에서 데이터 파일을 선택하고 피크 피킹 필터를 선택하여 공급업체가 제공한 중심 알고리즘을 적용합니다.

가져온 데이터 종속 수집 파일의 진단 조각화 필터링 또는 DFF의 경우 커서를 사용하여 데이터 파일을 강조 표시하고 시각화"드롭다운 메뉴를 열어 DFF 옵션을 선택합니다. 나타나는 DFF 대화 상자에서, 분석물의 표적 클래스가 엘루트될 때 보존 시간 및 분의 범위를 입력하고, 적절한 경우 여러 충전 화합물에 대한 가능성을 포함하여 분석물의 표적 클래스의 질량 대 충전 비율 범위를 찾을 수 있습니다. 질량 분석 기기의 달성 가능한 탠덤 질량 분석 질량 정확도를 입력하고 질량 대 전하 비율의 클래스 별 제품 이온을 입력합니다.

클래스별 중립 손실을 입력하고, 병동 질량 분광법 스펙트럼의 기본 피크의 백분율로 간주될 진단 제품 이온 및/또는 중립 손실에 대한 최소 강도를 정의한다. 그런 다음 결과를 출력하기 위해 경로 및 파일 이름을 선택하고 확인을 클릭하여 DFF를 시작합니다. DFF 플롯은 설정이 성공적으로 완료되면 나타납니다.

분석가는 화합물 클래스 내에서 알려진 화합물의 탠덤 질량 스펙트럼을 해석하여 전체 화합물 클래스에 대한 진단인 제품 이온 및/또는 중성 손실을 식별해야 합니다. 이 DFF 플롯은 M.aeruginosa CPCC 300의 분석에 따라 생성되었다. x축은 정의된 DFF 기준을 충족시키는 전구체 이온의 이러한 질량 대 전하 비율을 나타내고, y축은 미세포 내의 모든 제품 이온의 질량 대 전하 비율을 나타내며 질량 분광측정 스펙트럼을 나란히 합니다.

이러한 분석을 위해, 미세 세포 신 검출에 대 한 기준 포함 전구체 이온 내에서 질량 대 전하 비율 400 받는 다 1, 200, 그리고 2 ~ 6 분 사이 보존 시간. 가장 중요한 것은, 이러한 탠덤 질량 분석 스펙트럼은 정의된 15% 염기 피크 강도 임계값보다 높은 질량 대 전하 비율을 모두 포함했다. 분석 중에 획득한 4, 116탠덤 질량 분광분석 스펙트럼중 26개가 DFF 기준을 충족하고 M.aeruginosa CPCC 300 추출물에서 검출되었다.

검출된 주요 미세세포는 자신있게 미세세포류 아르기닌과 탈백한 산성 미세시스틴 류신 아르기닌으로 할당될 수 있었다. 새로운 화합물은 진단 단편화 필터링을 사용하여 발견됨에 따라, 유기체는 NMR에 의한 화합물의 격리 및 특성화를 위해 대규모로 재배될 수 있다. 미세 세포에 적용될 때, 진단 단편화 필터링을 통해 기존의 표적 선별 방법이 샘플 내에 존재하는 주요 독소를 검출하는지 확인할 수 있습니다.