저자는 박사 제니퍼 양 및 알렉산더 (사샤) 카우 프만이 기술 뿐만 아니라 수많은 도움과 중요 한 토론 기술 지원에 대 한 감사합니다. 혈 청 호르몬 분석 실험 양 그 외 여러분, 복제 Ligand 분석 결과 및 분석 코어, 유 니스 케네디 슈 라이버 NICHD/NIH (NCTRI) 부여 P50-HD28934에 의해 지원 연구에 대 한 버지니아의 대학 센터에서 2017 수행 했다.
연구 지원의 소스: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM T32 NICHD 007203에 의해 지원 되었다.

여기 설명 하는 방법을 국립 연구소의 건강 동물 관리 및 사용 지침 계약 이며 기관 동물 관리 및 사용, 샌디에고가 주 대학에 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 처리에 순응
<ol><li>처리 절차<ol>
<li>캐비닛에 biosafety 마우스 케이지를 놓습니다. 감 금 소 그리고 biosafety 내각 내에서 적당 한 표면 (예: 깨끗 한 케이지 뚜껑)에 장소에서 첫 번째 마우스를 제거 합니다.</li>
		<li>부드럽게 잡고 한 손으로의 손가락 집게와 꼬리의 기지에 의해 작업 화면에서 마우스를 제 지 하십시오. 그런 다음 단단히 집게와 다른 손의 엄지는 꼬리의 끝에 기지에서 꼬리의 복 부 표면 뇌졸중. 6 배를 쓰 다듬어이 반복 (즉, 1 세트) 그것의 감 금 소에는 마우스를 반환.</li>
		<li>6 분 기다릴 고 1.1.2 단계를 반복 합니다. 참고: 총에서 단계 1.1.2 반복 됩니다 4 번 마우스 (즉 4 세트 6 선), 당을 각 마우스 처리의 매일에 24 꼬리 치기의 총을 받게 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>매일 처리의 주파수<ol>
<li>5 계획 된 혈액 컬렉션 하루 전에 2 주까지, 단계 1.1, 5 일 / 주 (마우스 토요일 또는 일요일 순응의 마지막 2 주까지 처리 되지 않습니다)에 설명 된 대로 마우스를 처리 합니다.</li>
		<li>샘플링 기간 동안 실험 치료 (예: scruffing 또는 복 주입) 추가 처리 하지 포함 됩니다, 각 처리 세션 동안이 처리 활동에 쥐를 익히다. 참고: 주입 절차에 순응에 대 한 가짜 주사를 수행 하는 무딘된 바늘을 사용 합니다.</li>
		<li>계획 된 혈액 컬렉션 하루 전에 2 주 동안 주 당 7 일 1.1에 설명 된 대로 마우스를 처리 합니다.</li>
		<li>적어도 2 주 전에 계획 된 혈액 컬렉션, 샘플링 하는 동안 쥐에 혼란을 최소화 하기 위해 쌍에서 쥐 집.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 혈액 컬렉션 튜브의 준비
<ol><li>유리병에 磁 LH 분석 결과 버퍼 준비: 0.2% 소 혈 청 알 부 민 및 0.05 %PBS [0.2 g KCl, NaCl, 8 g 1.44 g Na2HPO4 (무수), 0.24 g KH2포4, 1 L, pH 7.4, 필터 및 고압 초순] 트윈-20 4 ° c.에 저장 1 참고: 볼륨 磁 LH 분석 결과 버퍼의 준비를 계산할 수 있다 기반으로 샘플 및 샘플 (2.2 & 토론) 아래 표시 된 대로 당 볼륨의 수에</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브 (0.6 mL microcentrifuge 튜브)를 준비 합니다. 튜브와 aliquot 분석 결과 버퍼 (버퍼 튜브; 당 57 µ L 참고,이 볼륨 혈액 수집의 볼륨 또는 원하는 버퍼에 혈액의 비율에 따라 다를 수 있습니다). 관 수 샘플링 앞서 일 준비, 4 ° c.에 저장</li>
</ol>3. 혈액 컬렉션
<ol><li>혈액 수집 자료의 준비입니다.<ol>
<li>사용을 위한 biosafety 내각을 준비 하 고 후드에 또는 근처 장바구니에 다음과 같은 자료를 준비: 10 µ L 플라스틱 (3 µ L 또는 원하는 혈액 컬렉션 볼륨 설정), 피 펫 팁, 사용된 피 펫 팁, 타이머, 동물 숫자와 샘플 번호 (인쇄물에 대 한 쓰레기통 샘플링 또는 동물 문제에 관한 메모)에 대 한 얼음 양동이 혈액 컬렉션 튜브가 위, 그리고 작은 거 즈 (2 "x 2"). 참고:는 "계산" 실험실 타이머에 기능은 유용 그것은 쥐를 방해할 수 있는 청취 가능한 경보 없기 때문에</li>
		<li>영구 마커를 사용 하 여 샘플링 하는 동안 올바른 마우스의 급속 한 식별을 지원 하기 위해 각 마우스 (기지) 근처의 꼬리를 표시.</li>
	</ol>
</li>
	<li>꼬리와 사전 혈액 컬렉션 준비의 클리핑.<ol>
<li>혈액 컬렉션의 시작 하기 전에 45 분 그것의 감 금에서 최초의 마우스를 제거 하 고 캐비닛는 biosafety 내 (깨끗 한 케이지 뚜껑 잘 작동) 적당 한 표면에 놓습니다.</li>
		<li>날카로운, 살 균가 위를 사용 하 여 제거 무 균 준비 다음 마우스 꼬리의 끝의 1-2 m m (즉, 잡 목으로 알코올과 betadine). 참고:이 부드러운 구속 또는 isoflurane 마 취에서 깨어 동물에서 수행할 수 있습니다.  또한, 진통 현지 IACUC의 권고에 따라 제공할 수 있습니다.</li>
		<li>위에서 설명한 대로 신중 하 게 마우스의 꼬리를 치기 (1.1.2; 1-2 스트로크는 일반적으로 충분 한) 꼬리 끝에 혈액 형태의 물방울까지.</li>
		<li>깨끗 한 팁으로는 피 펫을 사용 하 여 꼬리 끝에서 3 µ L의 혈액을 수집 하 여 피 피 펫 팁 삭제.</li>
		<li>반환 하기 전에 마우스의 케이지를 혈 중지 되었습니다 확인 하십시오. 필요한 경우, 멸 균 거 즈와 부드러운 압력을 적용.</li>
		<li>모든 마우스 3.2.5 3.2.1-단계를 반복 합니다. 이후 혈액 샘플은 단단히 마우스의 꼬리는 꼬리의 끝에 혈액 형태의 물방울까지 쓰 다듬어 하 여 수집할 수 있습니다. 참고: 회사 선 후 혈액 작은 물방울을 형성 하지 않는 경우 비상 식 염 수에 젖은 거 즈 패드와 함께 발 수 있습니다. 병 더 높습니다 양식 덜 자주 샘플링 하는 동안 (즉, > 15 분 간격). 정 맥에서 혈전은 들어가면 샘플링 계속할 수 있습니다.</li>
		<li>이 사전 혈액 컬렉션 준비 기간 동안 약 45 분 마다 6 분 위에서 설명한 대로 각 마우스에서 3 µ L의 혈액을 수집 계속. 혈액과 피 펫 팁을 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혈액 샘플링<ol>
<li>위에서 설명한 대로 꼬리 끝에서 3 µ L의 혈액을 수집 합니다. 전체 3 µ L 샘플 (거품 또는 침구 오염) 없이 피 펫 팁에 고려 되도록 주의. 레이블이 지정 된 튜브에 분석 결과 버퍼에 혈액 샘플을 꺼냅니다. 반전 하 여 혼합 하 고 얼음 튜브를 반환.</li>
		<li>반환 하기 전에 마우스의 케이지를 혈액 흐름 중지 되었습니다 확인 하십시오. 필요한 경우, 멸 균 거 즈와 부드러운 압력을 적용.</li>
		<li>미리 정해진된 샘플링 기간 단계 3.3.1-3.3.2 각 마우스, 모든 6 분에 대 한 반복 합니다. 각 동물 조 난 (예: 부분적으로 닫힌된 눈 꺼 풀, 돌출된 위치 [다른 치료에 의해 발생 하지] 또는 처리 응답의 부족)의 표시를 모니터링 하 고 필요한 경우 샘플링, 종료. 참고: 행동 고민 또는 다른 합병증 샘플링의 종료를 필요로 하는 우리의 실험실에서 매우 드물게 발생 합니다.</li>
		<li>동물 혈액 샘플링을 따르는 안락사 하지는, 꼬리 끝에서 혈액의 흐름이 완전히 중지 되었습니다 확인 합니다. 각 동물의 케이지 (또는 변화 감 금 소)의 내부에서 유출된 된 혈액을 닦 고 주택 랙 동물 감 금 소를 반환.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 샘플 처리 및 분석
<ol><li>분석까지-20 ° C에서 혈액 샘플을 저장 합니다. 참고: LH는 전체 혈액 샘플 분석 결과 버퍼;에 희석에 분석 세라 나 플라즈마의 분리는 저장 하거나 분석 하기 전에 필요 합니다.</li>
	<li>분석 결과 혈액 샘플으로 磁 ELISA에 의해 이전1 및 보고서 값 ng/mL 전 혈 보정 분석 결과 버퍼에 샘플 볼륨의 희석에 대 한 다음의 설명.</li>
	<li>데이터 집합에서 LH 펄스를 식별 합니다. 계산 하 고 평균 펄스 진폭 및 펄스 주파수 (또는 간 펄스 간격) 데이터 집합에 대 한 적절 한 비교. 참고: 게시 된 기준13,14 및 프로그램,15,16 LH 펄스를 감지 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기는 쥐에 있는 타악기 LH 분 비의 평가 대 한 전체 혈액 꼬리 팁 샘플의 빈번한 혈액 컬렉션에 대 한 프로토콜에 설명합니다. 이 프로토콜의 사회 심리적인 스트레스에 노출 다음 타악기 LH 분 비의 급성 변화 탐지에 대 한 샘플의 수집을 가능 하 게 하 고 다른 급성 또는 만성 조작에서 LH 펄스의 평가 적합.
LH 펄스의 안정적이 고 강력한 프로필을 달성 하기 위한이 프로토콜의 중요 한 구성 요소에서 처리 하는 순응 기간. 호르몬 분 비 저하 시킬 수 있습니다 스트레스를 처리 하는 생각은 문학,17 에 따라 추측 되었지만 명시적으로 테스트입니다. 그러나, 최근 간행물에 묘사 된 대표적인 LH 펄스 패턴의 분석 처리를 철저 하 게 순응 하는 이점을 명확 하 게 보여 줍니다. 10 일 처리를 이용 하 여 초기 연구에서 LH 펄스는 아무 lh에서 펄스 발견 된 장기간으로 불규칙 한 간격으로 발생 했습니다. 1 정액 간행물 그 후 계속 있다 추세 문학에서 장시간 처리 (즉, 3 또는 4 매일 처리의 주). 5 , 6 , 8 여기에 설명 된 프로토콜 처리의 5 주 총을 포함 하지만, 세션 처리 및 experimentalists에 대 한 주말 작업을 최소화의 유사한 수를 달성 하는 첫 번째 3 주말에 처리 생략 합니다. 비록 우리가 유효한 임계값 수를 제공할 수 없습니다 세션 처리에 필요한 LH 펄스의 성공적인 탐지 우리 확장된 순응 기간을 고려 하는 것이 절차의 새로운 실무자를 격려 했다. 특정 실험 패러다임 (예: 공부 하는 젊은 동물에 LH 펄스), 아래 순응 처리의 몇 주 실용적 되지 않을 수 있습니다. 이 실험에 대 한 그것은 중요 한 그 충분 한 처리 순응 이루어집니다; 아마도 여러 처리 세션 일 당 충분 한 것입니다.
혈액 컬렉션 기간 동안 환경 스트레스를 최소화 하는 것은 또한이 프로토콜의 성공에 중요입니다. 이 목표를 추구 하 여 우리 전체 순응 기간 동안에 물고기 내 조용한 방에 우리의 쥐 집. 샘플링의 날에 동물 방 문의 외부에 "조용히 하십시오" 표시의 배치는 의도 하지 않은 방해를 제거 하는 데 도움이 있습니다. 혈액 컬렉션 기간 동안 한 천을 사용할 수 있습니다 biosafety 내각에 피펫으로 휴식, 플라스틱 팁 및 펜에, 따라서, 이러한 항목을 조작 하 여 발생 하는 잡음을 최소화 하는 장소를 제공 하. 마지막으로, 한 사람이 쥐를 처리 하 고 실험 당일 모든 혈액 샘플을 수집 해야 하는 것이 좋습니다. 이 개인 주의 그리고 일관 된 시간의 하루 (샘플링 시간 유사 해야 합니다), 동물 처리에 부지런 해야 이후 circadian 입력 스트레스 응답에 영향을 미칠 것으로 알려져 있습니다. 18 만약 LH 펄스는 드문 또는 탐지, 외부 스트레스의 소스를 식별 및 최소화 한다. 혈액 컬렉션 기간 동안 스트레스를 최소화와 관련 된 다른 절차상 세부 사항 꼬리의 클리핑 하 고 LH에 대 한 분석을 샘플 수집 사이 경과 시간의 금액입니다. 우리는 LH 분석 결과 대 한 샘플을 수집 하기 전에 45 분 각 마우스의 꼬리를 클립. 이 지연 샘플링, 동안 부과 된 어떤 추가 치료에서 클리핑 꼬리와 관련 된 스트레스를 일시적으로 분리 하는 역할 꼬리로 혼자 클리핑 입증 되었습니다 순환 corticosterone 농도 상승. 19 혈액 샘플 철회 (하지만 삭제)이 45 분 창 추가 마우스 처리 절차에 순응 하 고이 지연 동안 혈액 응고 형성을 방지.
쥐에 있는 빈번한 혈액 컬렉션에 대 한이 프로토콜을 사용 하는 경우 최종 고려 사항은 이다이 종족의 작은 혈액 볼륨 수와 수집 된 각 샘플의 볼륨을 제한 합니다. 농 무부 동물 검사 가이드에 따르면 쥐의 몸 무게의 킬로그램 당 피 72 mL 있다. 20 생존 실험에 대 한 혈액 량의 7.5%를 수집할 수 있습니다 1 주 복구 기간 주어 단일 샘플링 기간에 하 고 2 주 회복 기간으로 혈액 량의 10%를 수집할 수 있습니다. 우리가 정기적으로 수집 < LH 분 비 패턴에 어떤 부정적인 영향 없이 (를 포함 하 여 대표 결과 여기에 표시), 현재 자주 혈액 컬렉션 프로토콜을 사용 하 여 마우스의 예상된 혈액 볼륨의 7.5%. 우리 물고기에 성인 ovariectomized C57/Bl6 마우스 무게 약 22 g (1.58 mL의 이론적인 혈액 볼륨), 혈액의 118.5 µ L를 수집 허용. 7 사전 컬렉션 처리 샘플 (분석 하거나 분석 하지)에 더하여 30 샘플의 혈액 (샘플 당 3 µ L), 7.5% 혈액 볼륨 제한 아래 111 µ L의 총 180 분 이상 수집 됩니다. 그것은 혈액 샘플의 볼륨 LH 농도 낮을 것으로 예상 하는 경우 특정 조건에서 LH를 감지를 조정 해야 할 수 있습니다 주목 해야한다. Gonadectomized 마우스에서 3 µ L 전체 혈액의 LH 검출 하기 충분 하다. 더 큰 혈액 볼륨 수집은 LH 농도 낮고 따라서 LH 분석 결과의 감도에 가까울 것으로 예상 때 고려 되어야 한다. 따라서, 마우스의 작은 혈액 볼륨에도 불구 하 고 충분 한 혈액 샘플 180 분 동안 타악기 LH 분 비의 탁월한 프로필을 평가 하기 위해 수집할 수 있습니다.
결론적으로,이 자주 혈액 확장 프로토콜 하이라이트를 샘플링 처리 시간의 연장된 기간 동안 쥐에 타악기 LH 분 비의 평가 위해 순응 기간. 우리는이 프로토콜은 이전에 모니터링할 수 있는 LH 및 사회 심리적인 스트레스에 다음 노출의 강력 하 고 일반 펄스 특성 충분 한 증명 하고있다. 이 프로토콜은 다른 유형의 스트레스 나 생식 호르몬 분 비를 변경할 수 있는 다른 치료에 대 한 LH의 응답을 평가 하 적응 될 수 있다. 또한,이 혈액 컬렉션 프로토콜 성장 호르몬에 대 한 보고 되었습니다 시간이 지남에 농도에서 변화 하는 다른 순환 요인의 측정에 대 한 적응 될 수 있습니다. 21 그것은 LH의 분 비 패턴 이제 종에서 모니터링할 수 있습니다 내분비학의 분야에 놀라운 기여 복잡 한 유전 및 LH 맥 박 규칙을 연구를 분자 접근 vivo에서 사용할 수 있는 고 실용.

포유류의 생식 기능 생식 샘 자극 호르몬 분 비, 황 호르몬 (LH)과 여 포 자극 호르몬, 뇌 하 수 체에서 따라 달라 집니다. gonadotropins는 생식 샘 자극 호르몬-방출 호르몬 (GnRH)의 hypothalamic 분 비에 대 한 응답에서 중 타악기 또는 서 지 방지기 패턴에서 은닉 된다. LH와 FSH의 분 비와 합성 hypothalamic GnRH, gonadal 스테로이드 호르몬 그리고 activin-inhibin-follistatin 시스템으로의 무수 한을 포함 하는 분자의 다양 일 분 비, paracrine 및 autocrine 액션을 통해 통제 된다 스트레스와 에너지 균형을 포함 하 여 생리 적 조건입니다. 2
혈액에서 LH의 타악기 패턴 지 수 제거 약 뒤 말 초 혈액으로 LH의 오히려 갑작스러운 방전에서 발생 합니다. 중요 한 패턴의 기능으로는 각 LH 방전의 주파수 및 LH 응답의 진폭, 둘 다, 부분적으로에 의해 규정 됩니다 hypothalamic-뇌 하 수 체의 측정에 대 한 포털 혈액 수집에 어려움에 GnRH 인해 출시 타악기 GnRH, LH의 측정 및 샘플링 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 GnRH 규제에 대 한 프록시로 사용 됩니다. 따라서, 중요 한 정보는 단일 샘플에서 확인할 수 없는 LH 펄스의 진폭 및 주파수에 인코딩됩니다.
타악기 LH 분 비의 분석 역사적으로 큰 포유 동물 (인간, 영장류, 그리고 양) 그들의 큰 혈액 볼륨 및 빈번한 혈액 샘플 컬렉션에 대 한 내성 때문에 제한 되었습니다. 설치류에 빈번한 혈액 샘플링 쥐에 국한 되었고 내재 심 방 카 테 터를 통해 달성. 3 , 4 상대적으로 저렴 한 비용 및 유전자의 (예: cre-lox, CRISPR) 하 고 복잡 한 신경 회로 (예: optogenetics, chemogenetics) 조작 쥐 매력적인 모델 유기 체; 그러나, 빈번한 혈액 샘플의 달성 및 LH 농도의 후속 분석까지 최근 입증 하기 어려운. 이 기념비적인 작업 해당 및 동료에 의해 개척 되었다. 1 이후 다음, 여러 실험실 자주 혈액 샘플링 및 실험 패러다임의 다양 한 타악기 LH 분 비 평가에 매우 민감한 LH 분석 활용 하기 시작 했다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 그것은 지적 되어야 쥐에서 여러 개의 혈액 샘플을 수집 하는 실용적인 방법 추구 적어도 40의 년10 여러 수정 만든 길을 따라 진행에서 되었습니다. 11 , 12
LH 펄스 패턴 (즉, 주파수와 진폭)의 평가 주요 상세를 모니터링이 유전자 온순한 동물 모델에서 기저 생식 샘 자극 호르몬 분 비를 나타냅니다. 전통적으로, 마우스에 LH 농도 단일 혈액 샘플에서 결정 했다. LH 농도 자연스럽 게 각 펄스 동안 변동 하기 때문에 단일-지점 샘플의 1 개의 약점 높은 변수 데이터 집합입니다. 또 다른 약점은 절연된 측정 본질적으로 LH 분 비는 펄스의 패턴에 의해 전달 하는 중요 한 정보를 보고 싶어요. 따라서, 자유롭게 행동에서 빈번한 혈액 샘플을 수집 하는 방법, 억제 마우스 (샘플링 하는 동안 부드러운 처리) 제외 됩니다 향상 된 정보를 제공을 타악기 호르몬 규칙을 조사 하는 많은 실험실에 유용 합니다.
여기, 우리는 자주의 컬렉션에 대 한 프로토콜을 설명 (매 6 분) 혈액 샘플 깨어, 억제 쥐에서. 우리는 처리를 포함 하는 중요 한 것은, 사전 및 사후 평가 심각한 도전 하는 시간의 길이 확인할 수 있습니다, 동안 전체 혈액 샘플에서 타악기 LH 분 비의 강력 하 고 지속적인 탐지 수집을 허용 하는 순응 프로토콜 같은 동원 정지 및 억제의 사회 심리적인 스트레스에 대응. 전체 혈액 샘플에서 LH 농도 대 한 효과적인 분석 결과 이전; 설명 하고있다 1 이 프로토콜 LH 펄스 측정을 위한 혈액 샘플을 수집 하는 방법에 초점을 맞추고.

<table><tbody><tr><td>Biosaftey cabinet</td><td>Lab Products Inc</td><td>L/F-B</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A5403</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (anhydrous)</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Purified and filtered water</td></tr><tr><td>Broome Rodent Restraint Device</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-0460</td><td>Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.</td></tr><tr><td>DynPeak</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td></tr></tbody></table>

frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion

많은 내 분 비 시스템, 순환 요인 또는 호르몬, 해제 되지 않은 하지만 개별 펄스 방출 요인에 대 한 응답에서으로 분 비 됩니다. 싱글 포인트 샘플링 조치 정상적인 생리 적인 조건 하에서 또는 dysregulation의 조건 중 타악기 호르몬의 분 비 패턴의 생물학적 의미를 완전히 이해 하기에 적당 하지 않습니다. 황 호르몬 (LH)는 앞쪽 뇌 gonadotrope 세포에 의해 합성 하 고 펄스 평가 대 한 빈번한 컬렉션의 혈액 샘플을 필요로 하는 타악기 패턴에서 분 비. 이것은 높은 감도 LH 분석 결과의 발전으로 인해 최근까지 쥐에 가능한 되지 하 고 발전 하는 기술에 자주 낮은 볼륨 샘플 컬렉션, 처음 해당와 동료에 의해 설명. 1 여기 우리 LH의 분 비는 타악기를 검출 하기 위하여 충분 한 처리 순응와 쥐에서 자주 주변 혈액 샘플 컬렉션에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 현재 프로토콜 여러 시간 동안 LH의 강력 하 고 지속적인 펄스의 평가 허용 하는 확장 된 순응 기간을 자세히 설명 합니다. 이 프로토콜에는 꼬리의 끝은 잘리고 휴대용 피 펫을 사용 하 여 꼬리에서 혈액 수집. Gonadectomized 마우스에 타악기 LH의 평가 대 한 직렬 샘플은 중요 한 것은, 90-180 분에 대 한 5-6 분 마다 수집 된 혈액의 수집과 측정 LH의 강력한 펄스의 적절 한 처리를 주어진 깨어, 자유롭게 동작 마우스에서 달성 될 수 있다 순응 그리고 환경 스트레스를 최소화 하기 위해 노력입니다. 충분 한 순응 혈 전에 4-5 주 내에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 마우스, 신경 내 분 비 연구에 대 한 강력한 동물 모델에서에서 여러 시간 동안 타악기 LH 분 비 패턴의 평가 대 한 전체 혈액 샘플의 수집을 위해 방법론에 발전을 강조 한다.

4 쥐에서 대표적인 LH 펄스 패턴은 그림 1 (2017 양 외.에서 증 쇄 하는 데이터)에 표시 됩니다. LH는 급성 정신 스트레스도 전에 응답을 결정 하기 위해 자주 혈액 샘플에서 측정 했다. 성인 여성 C57/Bl6 마우스 ovariectomized 하 고 빈번한 혈액 컬렉션에 대해이 프로토콜에 설명으로 처리 했다. 혈액 샘플은 LH 타악기 분 비의 사전 처리 기준을 설정 하는 모든 동물에 첫 90 분 동안 수집 되었습니다. 샘플링의 두 번째 90 분 동안 제어 (비 압박) 동물 그들의 감 금 소에 남아 있고 구속 스트레스 동물 설치류 보호 장치에 배치 되었고 새로운 새 장에 격리. 제어 동물 전체 샘플링 기간에 걸쳐 명확 하 고 모호 하지 않은 LH 펄스를 보여주었다. 반면, 사회 심리적인 스트레스의 신속 하 고 명확 하 게 타악기 LH 분 비 억제.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57894/57894fig1.jpg"> 그림 1: ovariectomized 쥐에서 대표적인 LH 펄스 패턴. (A, C) 비 강조 쥐를 제어 합니다. (B, D) 스트레스 자제 0-90 분 (회색 음영된 지역)에서 부과 했다 쥐와 LH 분석 했다. 오픈 데이터 포인트 DynPeak로 식별 하는 펄스를 나타냅니다. 15 이 그림 양 그 외 여러분, 내분비학 158(11)에서에서 수정 되었습니다: 내 분 비 학회, 저작권 2017 허가 3716-3723, 2017. <a href="/files/ftp_upload/57894/57894fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

여기 억제 쥐에서 꼬리 팁 혈액 샘플링 프로토콜 자주 샘플 컬렉션에 대 한 선물이. 이 메서드는 타악기 황 호르몬 분 비의 사정 패턴에 대 한 유용 하 고 다른 순환 요인의 분석에 대 한 적응 될 수 있습니다.

타악기 황 호르몬 분 비의 평가 대 한 쥐에서 꼬리 팁 혈액 샘플링을 자주

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

frequent-tail-tip-blood-sampling-mice-for-assessment-pulsatile

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K 조회수.  University of California, San Diego School of Medicine. 여기 억제 쥐에서 꼬리 팁 혈액 샘플링 프로토콜 자주 샘플 컬렉션에 대 한 선물이. 이 메서드는 타악기 황 호르몬 분 비의 사정 패턴에 대 한 유용 하 고 다른 순환 요인의 분석에 대 한 적응 될 수 있습니다.

비디오: Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJL 마우스의 실험적 면역 Hypophysitis의 유도

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

연구

면역학 및 감염병학

Modified Blood Collection from Tail Veins of Non-anesthetized Mice with a Vacuum Blood Collection System and Eyeglass Magnifier

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. The tail veins of mice are small, and it is sometimes difficult to obtain the required blood volume by conventional puncture methods. This study investigates the superiority of repeated blood sample collection from tail veins of mice through use of a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier (experimental group) compared to conventional blood sampling methods (conventional group), performed by beginners and experts, respectively. With the help of an eyeglass magnifier, a butterfly needle tip is inserted into the tail vein of each mouse in the experimental group. When the vein is penetrated successfully, a blood sample is collected in the vacuum collection tube by insertion of the rubber end of a butterfly needle into the vacuum blood collection tube. The plunger is then used to collect blood without the help of the eyeglass magnifier in the conventional group. Success rates of blood sample collection by the beginners and experts were shown to be 70% vs. 100% (p &#60; 0.01) in the experimental group and 35% vs. 85% (p &#60; 0.01) in the conventional group. For both beginners and experts, puncture times required for obtaining required blood sample were significantly lower in the experimental group compared to the conventional group (2.40 &#177; 0.75 vs. 2.90 &#177; 0.31, p &#60; 0.05; 1.15 &#177; 0.37 vs. 1.55 &#177; 0.76, p &#60; 0.05). In conclusion, the presented blood sampling technique is feasible and easy to practice and enables frequent sampling of adequate blood volumes from non-anesthetized mice.&#160;

This study reports blood sampling from tail vein in mice using a vacuum extraction tube system with eyeglass magnifier. Our method is easy to practice and could be used for repeat blood sampling in mice.

진공 혈액 수집 시스템 및 안경 돋보기와 비 취 쥐의 꼬리 정 맥에서 혈 수정된

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. ...

행동분석학

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a lean PCOS-like mouse model that mimics women with PCOS is clinically meaningful. In this protocol, we describe such a model. By inserting a 4 mm length of DHT (dihydrotestosterone) crystal powder pellet (total length of pellet is 8 mm), and replacing it monthly, we are able to produce a PCOS-like mouse model with serum DHT levels 2 fold higher than mice not implanted with DHT (no-DHT). We observed reproductive and metabolic dysfunction without changing body weight and body composition. While exhibiting a high degree of infertility, a small subset of these PCOS-like female mice can get pregnant and their offspring show delayed puberty and increased testosterone as adults. This PCOS-like lean mouse model is a useful tool to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

We describe the development of a lean PCOS-like mouse model with&#160;dihydrotestosterone pellet to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

Polycystic 난소 증후군 연구 Hyperandrogenic 마우스 모델

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

발생학

Handling Techniques to Reduce Stress in Mice

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects on&#160;animal well-being and can also be a confounding factor for experimental variables such as anxiety measures. Over the years, handling techniques that minimize handling-related stress have been developed with a particular focus on rats, and little attention to mice. However, it has been shown that mice can be habituated to manipulations using handling techniques. Habituating mice to handling reduces stress, facilitates routine handling, improves animal wellbeing, decreases data variability, and improves experimental reliability. Despite beneficial effects of handling, the tail-pick up approach, which is particularly stressful, is still widely used. This paper provides a detailed description and demonstration of a newly developed mouse-handling technique intended to minimize the stress experienced by the animal during human interaction. This manual technique is performed over 3 days (3D-handling technique) and focuses on the animal&#39;s capacity to habituate to the experimenter. This study also shows the effect of previously established tunnel handling techniques (using a polycarbonate tunnel) and the tail-pick up technique. Specifically studied are their effects on anxiety-like behaviors, using behavioral tests (Elevated-Plus Maze and Novelty Suppressed Feeding), voluntary interaction with experimenters and physiological measurement (corticosterone levels). The 3D-handling technique and the tunnel handling technique reduced anxiety-like phenotypes. In the first experiment, using 6-month-old male mice, the 3D-handling technique significantly improved experimenter interaction. In the second experiment, using 2.5-month-old female, it reduced corticosterone levels. As such, the 3D-handling is a useful approach in scenarios where interaction with the experimenter is required or preferred, or where tunnel handling may not be possible during the experiment.

This paper describes a handling technique in mice, the 3D-handling technique, which facilitates routine handling by reducing anxiety-like behaviors and presents details on two existing related techniques (tunnel and tail handling).

마우스의 스트레스를 줄이는 취급 기술

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects ...

Blood Collection Through Subclavian Vein Puncture in Mice

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in research work. Tail blood collection is a popular method when a small amount of blood sample is needed. Orbital artery could be considered if a large amount of blood is needed but this blood collection method has ethical issues. Formerly, we demonstrated the feasibility and safety of blood sample collection through subclavian vein puncture in rats, and here we investigate whether this method could be used in mice. We report that this method is safe and practical for blood collection in mice. Blood collection through the subclavian vein puncture in mice can be a convenient method in daily research works.

Here, we present a protocol to take blood samples from the subclavian vein of mice.

생쥐의 쇄 골 정 맥 천자를 통한 혈액 채취

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in ...

의학

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

마우스에서 전신 지질 처리 용량 평가

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

쥐의 측면 꼬리 정맥에서 혈액을 샘플링

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

생물학

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

다낭성 난소 증후군 마우스 모형에 있는 간 포도당 생산의 평가

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

DDREADDs 기술 및 자동 혈액 샘플링

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of numerous inputs and neuronal populations in the modulation of LH release is still unknown. Measuring changes in LH levels in mice is often a challenge since they are easily disrupted by environmental stress. Current techniques to measure LH release and pulsatility require long-term training for mice to adapt to manipulation stress, certain restraint, the presence of the investigator, and working on individual animals, reducing its usefulness for many research questions.
This paper presents a technique to remotely activate specific neuronal populations using Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) technology coupled with automated sequential blood sampling in conscious, freely moving, and undisturbed mice. We first describe the stereotaxic surgery protocol to deliver adeno-associated virus (AAV) vectors expressing DREADDs to specific neuronal populations. Next, we describe the protocol for carotid artery and jugular vein cannulation and postsurgical connection to the CULEX automated blood sampling system. Finally, we describe the protocol for clozapine-N-oxide intravenous injection for remote neuronal activation and automated blood collection. This technique allows for programmed automated sampling every 5 min or longer for a given period, coupled with intravenous substance injection at a desired time point or duration. Overall, we found this technique to be a powerful approach for research on neuroendocrine control.

저자 스포트라이트: 의식이 있는 마우스의 정확한 호르몬 분석을 위한 자동 주입 및 혈액 샘플링

Luteinizing hormone (LH) pulsatility is a hallmark of reproductive function. We describe a protocol for remote activation of specific neuronal populations linked to serial automated blood collection. This technique allows timed hormonal modulation, multiplexing, and minimizing manipulation effects on LH levels in conscious freely moving, and undisturbed animals.

생쥐의 순환 황체 형성 호르몬을 유도하고 측정하기 위한 자동 혈액 샘플링과 결합된 원격 신경 세포 활성화

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

타악기 황 호르몬 분 비의 평가 대 한 쥐에서 꼬리 팁 혈액 샘플링을 자주

요약

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SJL 마우스의 실험적 면역 Hypophysitis의 유도

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생쥐의 순환 황체 형성 호르몬을 유도하고 측정하기 위한 자동 혈액 샘플링과 결합된 원격 신경 세포 활성화