우리는이 문서에 기여에 대 한 Broadie 연구소 회원을 감사합니다. 이 작품 NIH R01s MH096832 및 MH084989 K.B.에 의해 지원 되었다 고 NIH predoctoral 친목 F31 MH111144 D.L.K.

1. 애벌레 접착제 해 부
<ol><li>철저 하 게 혼합 실리콘 탄성 엘라 스토 머 키트 (자료 테이블)에서 에이전트를 경화 실리콘 탄성 중합체의 1 부분으로 기본의 10 개 부분.</li>
	<li>몇 시간 (때까지 더 이상 터치 스티커)에 대 한 탄성 중합체와 75 ˚C에서 뜨거운 접시에 치료 22 x 22 m m 유리 coverslips 코트.</li>
	<li>단일 탄성 중합체 코팅 유리 coverslip을 애벌레 해 부에 대 한 준비에 맞춤 plexi 유리 절 개 챔버 (그림 1, 하단)에 넣으십시오.</li>
	<li>표준 microelectrode 끌어당기는 사람을 사용 하 여 원하는 테이퍼 팁 크기를 붕 규 산 유리 모 세관에서 접착제 펫을 준비 합니다.</li>
	<li>부드럽게 micropipette 팁 오프 하 고 다른 쪽 끝을, 유연한 플라스틱 튜브 (1/32"내부 직경, ID 3/32" 외부 직경, OD, 1/32"벽;의 2 피트 자료의 테이블) 와 입 (P2 피 펫 팁) 피팅.</li>
	<li>애벌레 해 부에 대 한 준비에 접착제 (자료 테이블)의 작은 양 (~ 20 µ L)으로 작은 컨테이너 (0.6 mL Eppendorf 관 모자)를 채우십시오.</li>
	<li>챔버 (mM)에 염 분 채우기: 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 자당 및 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 산 (HEPES) pH 7.2.</li>
	<li>알 렉 사 Fluor 647에 활용 된 안티-말 무 과산화 효소 (HRP) 항 체를 추가 (안티-HRP:647; 1 mg/mL 재고에서 희석 1시 10분)은 NMJ를 라벨에 대 한 해 부21,22동안 연 접 맨끝.</li>
	<li>좋은 붓 (크기 2)를 사용 하, 식품 유리병에서 방황 하 고 세 번째 탈피를 제거 하 고 탄성 중합체 코팅 커버 유리에 놓습니다.</li>
	<li>유리 제 micropipette 팁을 첨부 (1.5 단계)와 입에 의해 생성 된 부정적인 공기 압력을 사용 하 여 접착제의 작은 볼륨을 채우십시오.</li>
	<li>위치 유 충 등 사이드를 집게와 접착제 탄성 중합체 코팅 coverslip 작은 머리 입으로 긍정적인 공기 압력을 사용 하 여 접착제의 드롭.</li>
	<li>확인 하 고 동물 상당량이 두 접착제 첨부 파일 사이의 긴장 된 유 충의 후부 끝이 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 (블레이드 3 m m; 테이블의 자료), 후부 및 수직 컷 등 쪽 midline 따라 수평 컷 (~ 1 m m)를 확인.</li>
	<li>부드럽게 잘 집게 (#5, 테이블의 자료)를 사용 하 여 등 기관, 창 자, 뚱뚱한 몸 및 다른 내부 장기를 덮고 있는 근육 제거.</li>
	<li>4 몸 벽 날개, 수평 및 수직으로 체 벽을 부드럽게 스트레칭 하를 접착제로 붙이는 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 복 부 신경 코드 (VNC), 신중 하 게 모터 신경은가 위로 잘라 들어올린 다음 VNC를 완전히 제거.</li>
	<li>해 부 생리를 바꿉니다 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 (CaCl2없이 위의 해 부 식 염 수와 동일)는 염 분을 무료 자전거.</li>
</ol>2. 옵션 1: 높은 [K+] FM 염료 로드
<ol><li>FM1 43 재고 솔루션 (4 m m)에서 90 m KCl 해결책 (높은 [K+] 해 부 염 분에서) 4 µ M의 최종 농도 대 한 m의 1 mL에 1 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>교체를 피 펫을 사용 하 여 Ca2 +-SV endocytosis 염료의 통풍 관을 자극 하 고 [K+] FM 염료 솔루션과 영상 실에서 무료 염 분.</li>
	<li>즉시 시작 자극 기간 depolarizing [K+]의 미리 결정 된 기간에 대 한 디지털 타이머 (예., 5 분; 그림 2)입니다.</li>
	<li>건강 한 애벌레 준비를 확인 하려면 높은 [K+] 도발은 기간 동안은 근육의 강한 수축 note.</li>
	<li>타이머 기간 끝나면 신속 하 게 높은 [K+] FM 염료 솔루션을 제거 하 고 대체 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-높은 [K+] FM 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
</ol>3. 영상: Confocal 현미경 검사 법
<ol><li>똑바로 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지 NMJ 염료 형광 (다른 현미경 사용 될 수 있다)에 물 집중 목표 X 40.</li>
	<li>이미지 근육 복 부 세그먼트 2-4 (다른 NMJs 몇 군데 수)의 4 NMJ 적절 한 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 이미지를 수집 하 고.</li>
	<li>HeNe 633 nm 레이저를 사용 하 여 HRP:647 (와 긴 패스 필터 > 635 nm)와 아르곤 488 nm 레이저 FM1-43 (대역 통과 필터 530-600 nm)와 자극을 자극.</li>
	<li>운영 체제는 최적의 이득 및 두 채널에 대 한 오프셋을 결정 합니다. 참고:이 설정은 실험의 나머지 부분에 걸쳐 일정 한 유지 됩니다.</li>
	<li>시 냅 스 터미널의 바닥에 HRP 표시 위에서 전체 선택한 NMJ 통해 confocal Z 스택 가져가 라.</li>
	<li>주의 주의 NMJ 몇 군데 (세그먼트, 측면 및 근육)의 FM 역 염색 후 정확한 동일한 NMJ에 초과 되도록 합니다.</li>
</ol>4. 높은 [K+] 자극: FM 염료 내리기
<ol><li>대체 캘리포니아2 +-무료 염 분 높은 [K+] 염 (FM1 43 염료) 없이 드라이브 도발은를 가진 SV exocytosis 염료 릴리스.</li>
	<li>높은 [K+] 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 디지털 타이머를 즉시 시작 (예., 2 분; 그림 2)입니다.</li>
	<li>타이머 기간 끝나면 즉시 높은 [K+] 염 분을 제거 하 고 대체 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-높은 [K+] 염 분 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
	<li>동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 특정 수 있습니다.</li>
</ol>5. 옵션 2: 전기 자극 FM 염료 로드
<ol><li>필요한 테이퍼 팁 크기를 microelectrode 끌어당기는 사람 (테이블의 재료)를 사용 하 여 흡입 피 펫을 준비 합니다.</li>
	<li>화재-폴란드어 마이크로 포지 microelectrode 끝까지 단일 모터 신경 꽉 맞는와 빨려 수 있습니다.</li>
	<li>micromanipulator에 흡입 피 펫 전극 홀더에 고 긴 유연한 플라스틱 튜브와 주사기를 연결 하십시오.</li>
	<li>자극 매개 변수 설정 (예., 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 시간 5 분 (그림 2) 또는 1 분 (그림 3)).</li>
	<li>대체 Ca2 +-FM1 43 염 분 (4 µ M, 1 mM CaCl2) 전기 생리학 장비에 위의 애벌레 준비에 무료 염 분.</li>
	<li>현미경 단계에 준비 넣고 유 충과 흡입 피펫은 초점 (40 X 물 침수 목표)에 때까지 무대를 마련 합니다.</li>
	<li>부정적인 공기 압력 흡입 전극으로 주사기에 의해 생성 된 선택 된 hemisegment를 innervating 컷된 모터 신경의 루프를 빨 아.</li>
	<li>선택 된 hemisegment에 있는 근육 수축에 대 한 시각적으로 모니터링 하는 동안 자극의 짧은 버스트와 함께 흡입 전극 기능을 테스트 합니다.</li>
	<li>SV endocytosis를 선택한 매개 변수 (단계 5.4) 및 FM1 43 염료의 통풍 관 (그림 2)를 사용 하 여 모터 신경 자극.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-FM1 43 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-위에서 confocal 영상 프로토콜을 사용 하 여 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
	<li>(세그먼트, 측면 및 근육) FM 염료 내리기 후 정확한 동일한 NMJ에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 몇 군데 NMJ의 주의 기록해 둡니다.</li>
</ol>6. 전기 자극: FM 염료 내리기
<ol><li>대체 Ca2 +-(FM1 43 염료) 없이 일반 식 염 수와 염 분 및 전기 생리학 장비 무대에 다시 준비를 놓습니다.</li>
	<li>역에 대 한 자극 매개 변수 설정 (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 2 분 (그림 2) 또는 20 시간 (그림 3)).</li>
	<li>동일한 모터 신경, 위와 같이 동일한 전극에 빨 아 그리고 SV exocytosis FM1 43 염료 릴리스를 활성화 하 자극.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-외부 염료 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
	<li>동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 확인 합니다.</li>
</ol>7. 옵션 3: Channelrhodopsin 자극 FM 염료 로드
<ol><li>ChR2 공동 인자 모든 trans 망막 (에탄올에 용 해, 100 µ M 최종 농도)를 포함 하는 음식에 ChR2 표현 애벌레를 올립니다.</li>
	<li>카메라 포트를 장착 해 부 현미경 스테이지에 플 렉 시 유리 챔버에 애벌레 준비를 놓습니다.</li>
	<li>파란색 LED를 연결 (470 nm; 자료의 테이블) 프로그래밍 가능한 자극 하는 동축 케이블을 사용 하 고 카메라 포트에 LED를 배치.</li>
	<li>블루 LED 빛 빔 현미경 확대/축소 기능을 사용 하 여 해 부 애벌레 함수에 초점.</li>
	<li>대체 Ca2 +-optogenetic 스테이지의 FM1 43 염 분 (4 µ M, 1 mM CaCl2) 위의 애벌레 준비에 무료 염 분.</li>
	<li>(예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 시간 5 분 (그림 2)의) 자극 기를 사용 하 여 LED 매개 변수를 설정 합니다.</li>
	<li>빛 자극을 시작 하 고 (예를 들어, 5 분; optogenetic 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 타이머 추적 그림 2)입니다.</li>
	<li>타이머 중지, 신속 하 게 FM 염료 솔루션을 제거 하 고 대체 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-FM 염료 솔루션 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경 위에서 이미징 프로토콜을 사용 하 여 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
	<li>(세그먼트, 측면 및 근육) FM 염료 내리기 후 정확한 동일한 NMJ에 대 한 액세스를 보장 하기 위해 몇 군데 NMJ의 주의 기록해 둡니다.</li>
</ol>8. Channelrhodopsin 자극: FM 염료 내리기
<ol><li>대체 캘리포니아2 +-카메라 포트 LED와 해 부 현미경 스테이지 (FM1 43 염료) 없이 일반 염 분으로 무료 염 분 유 충에 초점을 맞춘.</li>
	<li>언로드 (예를 들어, 15 V, 20 Hz 주파수, 20 ms 기간 및 2 분 (그림 2)의 시간)에 대 한 자극 매개 변수를 설정 합니다.</li>
	<li>빛 자극을 시작 하 고 optogenetic 자극 기간 미리 결정 된 기간에 대 한 타이머 추적 (예: 2 분; 그림 2)입니다.</li>
	<li>타이머 기간 끝나면 빨리 FM 염료 솔루션을 제거 하 고 바꿉니다 캘리포니아2 +-SV를 막으려고 무료 염 분 사이클링.</li>
	<li>캘리포니아2 +빠른 승계에서 세척-외부 염료 완전히 제거 되도록 하기 위해 식 염 수 (5 x 1 분)을 무료.</li>
	<li>신선한 캘리포니아2 +에서 애벌레 준비를 유지-confocal 현미경으로 즉시 이미징에 대 한 무료 염 분.</li>
	<li>동일한 confocal 설정을 사용 하 여 위에서 설명한 동일한 NMJ에 FM1 43 염료 형광 이미지를 확인 합니다.</li>
</ol>9. 형광 정량화
<ol><li>이미지 J (NIH 오픈 소스)에서 이미지를 로드 하 고 이미지를 클릭 하 여 최대 강도 투영을 만듭니다 | 스택 | Z 프로젝트입니다.</li>
	<li>안티를 사용 하 여-HRP:647 채널, 이미지 이동 | 조정 | 임계값와 슬라이드 그냥 NMJ 선택 될 때까지 상단 도구 모음.</li>
	<li>자동 선택 도구 사용 하는 NMJ에 클릭 합니다. 불연속은 NMJ 이면 Shift 버튼을 누른 상태 고 모든 부품을 선택 합니다.</li>
	<li>FM1 43 염료로 이미지를 변경 하 고 이동 분석 | 형광 측정을 측정 합니다.</li>
	<li>(식별 된 세그먼트, 측면 및 근육) 같은 NMJ에서 "내려진된" 이미지에 대 한 단계 9.1-9.4 반복 합니다.</li>
	<li>로드 된 염료의 백분율을 얻으려면, 언로드/로드 형광 강렬의 비율을 가져가 라. 참고:이 절차는 "타원형" 또는 "자유형" 선택 도구를 사용 하 여 bouton 당 bouton 기준 형광 분석을 수정할 수 있습니다. 배경 형광 근육 형광을 샘플링 하 여 공제 될 수 있습니다. 에이전트를 줄이기 위해이 배경을 추가할 수 있습니다.</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.

높은 [K+] 염 분 depolarizing 자극은 훨씬 활동 종속 FM 염료 사이클링, 하지만 가능성이 적어도 생리29에 대 한 세 가지 옵션의 쉬운. 이 간단한 방법은 모든 액세스할 수 셀 전체 동물에 depolarizes 하 고 그래서 감독된 연구를 허용 하지 않습니다. 로컬로 micropipette와 높은 [K+] 염 분을 적용 하는 것만이 여전히 사전/postsynaptic 세포와 시 냅 스 연결 가능성이 명과1depolarize 것입니다. 또 다른 주요 관심사는 그 높은 [K+] 도발은 드라이브 빠른 형성의 대량 endosomes 거의 unstimulated boutons에서 볼 수 있습니다. 그러나, 대량 endosome 형성 변이29, 진짜 생리 적인 과정을 나타내는 의해 차단 하는 활성 메커니즘입니다. 따라서, 높은 [K+] 도발은와 FM1 43 이미징 선택적으로 시 냅 스에서 대량 endocytosis 공부를 사용할 수 있습니다. 흡입 전극 모터 신경의 전기 자극은 훨씬 더 많은 제어 방법입니다. 그것은 하나의 축 삭 번들만 자극 하 고 연 접 테르미니 직접 depolarized 장점이 (물론, 근육 섬유는 다음 depolarized 송신기 행동에 의해). 그것은 그러므로 자극 하지 같은 동물에 NMJs의 훌륭한 내부 통제를 제공 한다. 이 메서드는 엄격 하 게 제어 전기 생리학 기록4와 직접 비교를 사용 하는 높은 [K+] 자극 메서드와 달리 자극 매개 변수 하나를 수 있습니다. 그러나,이 기술은 특수 장비와 기술, 상당히 높은 수준의 요구 이며 따라서 액세스. 타겟된 channelrhodopsin (ChR2)의 빛 기반 활성화 선택 뉴런30를 표적으로 하기의 이점이 있다. 이 방법은 전기 생리학 방법 가진 아무 친밀도 요구 하 고 어떤 실험실에서 매우 저렴 한 장비와 함께 할 수 있습니다 하지만이 방법은 기본적인 익숙하다고 초파리 유전학 않아도.
자극 매개 변수 선택은 SV 사이클 역학 높은 변수 고기1유전 조건의 범위 내에서 쿼리 테스트를 위해 매우 중요 하다. 모든 방법에 대 한 외부 [캘리포니아2 +] 사용 SV의 원동력을 제어 키 매개 변수는 사이클링. 높은 [K+] 자극 방법으로 중요 한 선택은 [K+] 사용는 도발은 힘의 정도 결정 합니다. Drosophila haemolymph의 측정 [K+] 5mm, 나타내고 90mm는 일반적으로 가장 자주 활동 자극3,7,,1517 선택 농도 , 그러나 31., 30-90 m m에서 [K+] 범위는 자극 강도5,,1632를 고용 되었습니다. 또 다른 중요 한 매개 변수 결정 두 FM1 43 로드 및 언로드에 대 한 높은 [K+] 자극의 길이입니다. 로드에 대 한 기간 전체 자전거 SV 인구는 효과적으로 로드 여부, 또는 활성 소포7의 하위 집합을 결정 합니다. 마찬가지로 공개 하거나 애매 한 돌연변이 고기 비율에 의존 수 있는 SVs exocytosis 자극 기간에 진행의 백분율 변화 사이클링 주파수2SV 지시 내리기 위한 기간. 흡입 전극 전기 모터 신경 자극, 매개 변수 선택 포함 또한 자극 전압, 주파수, 기간 및 펄스 간격. 일시적으로 꽃무늬 활동 SV 역학7, 자전거의 핵심 결정 이며 다른 자극 패턴 선택적으로 고유한 SV 풀을 동원 수 있습니다. 타겟 라이트 기반 ChR2 정품 인증 선택 (빛의 강도 변수)와 위의 모든 등 추가 유전자 변형 옵션에서 설명한 다음 섹션. 이러한 매개 변수를 선택 더 많은 실험 제어 뿐만 아니라 증가 기술 복잡성 온다.
Channelrhodopsin-2 (ChR2)는 빛 문이 막 채널 모노-및 divalent 양이온33침투성. ChR2 자극을 선택 하는 경우 Gal4 드라이버, UAS-ChR2 구성 및 채널 활성화를 위한 광원 변수를 포함 하 여 만들어질 많은 선택이 있다. 매우 특정 하에서 유비 쿼터 스 Gal4 드라이버 다양 합니다. 예를 들어, 유비 쿼터 스 UH1 Gal4 (daughterless) CcapR-Gal4 (Janelia) 근육에 ChR2를 드라이브 하는 반면 모든 셀에 ChR2를 표현 것 6/7 NMJ 그러나 하지 근육 4 NMJ31,34. 이 선택도 강력한 내부 통제로 사용할 수 있습니다. 마찬가지로 많은 UAS-ChR2 변종, ChR2-H134R (여기에 사용된, 돌연변이 잔류물 원인 증가 photocurrents)35, VChR1, 최고와 많은 더 많은36를 포함 하 여 있다. 이 채널 이체의 각각 게이팅, 전도도, 이온 선택도, 속도 론 및 둔감 빛의 고유 속성이 있습니다. 일부 구문을 포함 FM 이미징 방해할 수 있는 형광 태그 note. MCherry는 UAS-ChR2-H134R 여기 사용 예를 들어 태그입니다 (예: 587 nm, em: 610 nm), FM1-43 detectible 방출 생성 하지 않습니다 하지만 (예: 479 nm, em: 598 nm) 필터 이미징. 기술적인 매개 변수 선택에는 광원, 파장 및 강도 채널 활성화에 대 한 포함 됩니다. 여기에 사용 되는 옵션은 자극 시 금 근육 수축에 의해 시각적으로 확인 하는 저렴 한 블루 발광 LED. 우리는 또한 ChR2를 활성화에 성공 confocal 레이저 스캐닝은 충분 한 epifluorescence를 사용 하 여. Epifluorescence 대상된 자극 (전체 동물 대신 특정 세그먼트)에 사용 될 수 있지만 자극 매개 변수, 제어 하기 어려운 반면 기간 및 빛의 주파수를 변경 하는 간단한 자극까지 쉽게 연결 하는 LED 펄스입니다. 해 부 현미경 카메라 포트를 통해 LED 빛을 초점 더 많은 제어, 강렬한 빛 자극 수 있습니다.
그것은 복 부 신경 코드/뇌 자극 패러다임 동안 그대로 여부를 결정 하는 실험입니다. 우리는 여기, 사용 하는 세 가지 방법의 비교에 대 한 전체 중앙 신 경계를 제거 하기로 하지만 때로는 업스트림 배선 그대로15왼쪽. 합병증은 신 경계 전체 왼쪽 때마다 발생 하는 내 인 성 신경 활동. 이 활동의 정도 동물, 해 부 전문은 실험의 큰 정도에 의존 하는 동물에서 높은 변수. 이 변수 활동이 아니다 그러므로 전적으로 인해 고용 exogenous 자극15FM1 43 염료 로드 되 고, 그 금액에 기여할 수 있다. 관련된 기술적인 합병증은 그대로 해 부 애벌레 계약 움직이다 운동, 근육이이 변위 NMJ 이미징 크게 방해. 이 운동은 중앙 신 경계를 제거 하 고 또한 캘리포니아2 +의 응용 프로그램을 통해 완화는-4이미징 동안 무료 염 분. 여기에 사용 된 이러한 접근은 NMJ 준비에서 이미징 우수한 FM1 43 염료를 설정 하기에 충분. 그러나, 일부 경험 (예: ryanodine, philanthotoxin-433), 근육 수축 억제 또는 활동 전위 차단제 (예, 테트로도톡신)37,38을 사용 하는 약물을 추가 하기로 결정 했다. 약물의 범위는 SV 사이클의 특정 단계를 강조 하거나 돌연변이 고기 neurotransmission 메커니즘을 검사 하기 위해 선택적으로 조작에 사용할 수 있습니다. 예를 들어 일부 경험 고용 (활성화 전압-문이 나+ 채널39) Veratridine SV SV endocytosis를 향상 시키기 위해 보유 수영장 Cyclosporin A (Calcineurin 활동40억제)에서 로드를 증가 하 고 산림 (adenylyl 있고41, 시 냅 스 전송42향상 활성화)는 엑 소/엔도 자전거 풀7,43,44증가. 이러한 약리 조작 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. 마지막으로, FM1 43 배경 정도의 절 개, 세척 효과 자극 프로토콜의 품질에 따라 발생할 수 있습니다. 일부 추가 β-cyclodextrin Advasep-745또는 수성 fluorophore sulforhodamine46일반적인 형광 담금질 하 여 신호 대 배경 비율 개선의 sulfobutylated 파생 합니다.
SV 주기 (예, 전기 생리학, synaptopHluorin, 전자 현미경 검사 법)의 더 이해 FM 형광 이미징 동행 수 있는 수많은 기술이 있다. 여기에 FM 형광 photoconversion SV를 조사 하는 데 사용 되는 표시 예 ultrastructural 세부 주기. SVs는 공간적, 기능적으로 명료한2의 여러 가지 풀으로 구성 됩니다. 쉽게 releasable 수영장 (RRP) 급성 자극에 즉시 공개 하는 소포를 포함 합니다. 더 큰 재활용 수영장 SV 릴리스 적당 한 활동의 조건 하에서 유지합니다. 내부 보유 수영장 (RP)는 (겉보기 근처 생리) 강한 자극2만 채용 된다. SV 풀을 활성화 자극 사용47의 유형에 따라 그리고 FM photoconversion를 사용 하 여 초파리 NMJ에서 보고서는 이러한 다른 SV 풀48의 공간 속성과 기능에 중요 한 통찰력. FM photoconversion SV 풀 다른 자극 패러다임, 그리고 긴 논의 밀매 상호 작용 endosomes SVs49쿼리 질문에서 활성화 연구를 사용할 수 있습니다. 실험 시 냅 스에서 다른 활동-종속 변경 함께에서 FM 영상에 관심이 있다면, 거기는 FM1 43 염료 (FM1-43FX)의 보도의 하면 고칠 수 아날로그 이다. 이 조사 해야 하나 활동-종속 염료 로드, 후 초파리 NMJ를 해결 하기 위해 허용 하 고 다음 항 체 라벨 bouton 활동 수준 (FM 염료 형광) 및 활동-종속 표현 사이의 상관 관계에 대 한 테스트와 함께 후속를 관심의 단백질입니다. 미래에, 그것은 매우 보람이 있을 FM 염료의 조합 수 있도록 추가 방법을 아름 다운 초파리 NMJ 모델 시 냅 스에서 다른 이미징 접근 이미징.

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 냅 모델 아름 답게 특징은 시 냅 스 형성 유전자 섭1의 광대 한 스펙트럼과 기능을 공부 하 고 사용 되었습니다. 여러 축 삭 분 지, 각각 많은 확대 시 냅 스 boutons 모터 신경 맨끝에 의하여 이루어져 있다. 이 널찍한 varicosities (최대 5 µ m 직경에서) neurotransmission 기계, 균일 한 glutamatergic 시 냅 스 소포를 포함 하 여 모든 포함 (SVs; ~ 40 nm 직경에서) cytosolic 예비에 쉽게 releasable 풀2. 이 소포는 연 접 원형질 막 퓨전 사이트 활성 영역 (AZs), 어디 exocytosis 트랜스에 대 한 조미료 신경 전달 물질 방출을 중재에 도킹-시 냅 스 통신. 그 후, SVs는 반복된 엑 소/endocytosis 사이클 키스 실행 재활용 또는 clathrin 중재 된 endocytosis (CME)를 통해 원형질 막에서 검색 됩니다. Drosophila NMJ은 쉽게 접근 가능 하 고 모두 분리 및 SV 주기 돌연변이 적합. 앞으로 유전 스크린을 사용 하 여, 새로운 돌연변이 SV 사이클3에 대 한 중요 한 새로운 유전자의 식별을 끌고있다. 또한, 이미 알려진된 유전자로 시작 하는 역 유전 접근은 돌연변이 고기4사이클의 주의 설명을 통해 새로운 SV 사이클 메커니즘의 해명에 이르렀다. Drosophila NMJ 광학 트랙 소포 neurotransmission 동안 순환 하는 방법을 통해 SV endocytosis 및 exocytosis 메커니즘을 해 부에 대 한 실험 시 냅 스 준비로 거의 이상적 이다.
다양 한 형광 마커 중 역학, 소포의 시각적 추적 허용 하지만 가장 다재 다능 한 마오, F., 동부 표준시 알에 의해 처음 합성 FM 염료 아날로그. 5. FM 염료는 친수성 머리와 스펙트럼 속성 부여 중앙 지역으로 향기로운 반지를 통해 연결 된 질 성 꼬리를 포함 하는 구조적으로. 이러한 styryl 염료 역 막에 분할 할 하지 '플립플롭' 막 전단지 사이 고 그래서 결코, cytosol에서 무료 고 물5보다 훨씬 더 막에 형광. 지질 bilayer에 가역 삽입 형광6에 40-fold 증가 발생합니다. 신경 시 냅 스에서 클래식 FM 염료 라벨 실험 SV endocytosis 통해 염료를 로드 depolarizing 자극 하는 동안 염료와 시 냅 스 준비 목욕 이루어져 있다. 외부 염료 다음 씻 고 SV 주기 이미지 로드 시 냅 스7를 칼슘 무료 벨소리 솔루션에 체포 됩니다. 염료 무료 목욕에 자극의 두 번째 라운드 exocytosis, 형광 강도 감소를 측정 하 여 따라 할 수 있는 과정을 통해 FM 석방을 트리거합니다. 풀 vesicles의 수백을 포함 하는 단일 소포에서 SV 인구 양적 모니터링된6,7일 수 있다. 기능적으로 뚜렷한 SV 풀의 활동-종속 동원 해 부 키스-및-실행 CME 사이클링8,9대를 비교 하 고 FM 염료 사용 되었습니다. 방법은 별도로 분석 결과 갖는, 자연과 소형 시 냅 스 사이클 활동 (아주 작은 형광 변화를 감지 하 여 photobleaching를 줄이기 위해 매우 중요 한 장비)와10에 수정 되었습니다. 분석 실험으로 확장할 수 있습니다 ultrastructural 단계로 photoconverting 형광 FM 신호 전송 전자 현미경 검사 법11,12,13,14 전자 밀도 라벨으로 .
역사적으로, 칼륨 ("높은 [K+]" 라 함)의 높은 농도에 입욕 시 냅 스 준비 되었습니다 depolarizing SV 사이클링;을 유도 하는 자극에 대 한 선택의 방법 개구리 해 NMJ5년까지 경작 설치류 두뇌 hippocampal 신경15, 초파리 glutamatergic NMJ 모델16,17. 높은 [K+] 이렇게 간단, 특수 장비, 필요 고 따라서 대부분의 실험실에 액세스할 수 하지만 응용 프로그램 및 데이터 해석에 대 한 제한이 있습니다. 훨씬 더 순수 적절 한 방법을 사용 하는 신경4,5,12의 흡입 전극 전기 자극. 이 방법은 활동 전위 전파 연 접 신경의 직접적인 자극에 대 한 터미널, 고 결과 electrophysiological 분석 neurotransmission 함수13,14의 직접 비교 될 수 있다 15, 하지만 특수 장비를 필요로 하 고 기술적으로 훨씬 더 도전적인는. Optogenetics의 출현으로 channelrhodopsin 신경 자극의 사용 이진 Gal4/UAS 시스템20을 사용 하 여 채널 식의 꽉 spatiotemporal 제어를 포함 하 여 추가적인 이점이 있다. 이 방법은 흡입 전극 자극 보다 기술적으로 훨씬 쉽게 하며 매우 저렴 한 LED 광원 보다 아무것도 더. 우리 모두 비교 하 고 대조 초파리 NMJ에서 이러한 세 가지 다른 자극 방법 FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide)의 이미지를 사용 하는 여기,: 간단한 높은 [K+ ], 전기 및 새로운 channelrhodopsin 접근을 도전.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9644388</td>
			<td>To put on cover glass for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22-1</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td>To put SylGard on for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Top Hot Plate Type 2200</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>HPA2235M</td>
			<td>To cure the SylGard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexi glass dissection chamber</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Handmade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>To make suction and glue micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>TET-031A</td>
			<td>For mouth and suction pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 pipette tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td>For mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6-mL Eppendorf tube cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Used to put glue in for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond 3M</td>
			<td>WPI</td>
			<td>vetbond</td>
			<td>Glue used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P-217</td>
			<td>Forsaline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>For saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP:Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>123-605-021</td>
			<td>To label neuronal membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>94376864793</td>
			<td>To manipulate the larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Dumostar Tweezers #5</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14177</td>
			<td>Used during dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T35356</td>
			<td>Fluorescent styryl dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td>For timing FM dye load/unload&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 META laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging the fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 SP2 version 6.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for imaging on confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeNe 633nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite HRP:647 during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon 488nm laser</td>
			<td>Lasos</td>
			<td></td>
			<td>To excite the FM dye during imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Forge</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>To fire polish glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe Slip Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>301625</td>
			<td>To suck up the axon for electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manipulator (magnetic base)</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-9</td>
			<td>To control the suction electrode for electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>To control the LED and electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X Achroplan Water Immersion Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used during electrical stimulation and confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans Retinal</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Essential co-factor for ChR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi Microscope with camera port</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2000-C</td>
			<td>Used during channelrhodopsin stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 470nm</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>M470L2</td>
			<td>Used for ChR activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td>To control the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Power Supply</td>
			<td>Cincon Electronics Co.</td>
			<td>TR15RA150</td>
			<td>To power the LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>To measure LED intensity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fm dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation

FM 염료는 시 냅 스 소포 (SV) 주기를 공부 하는 데 사용 됩니다. 이러한 amphipathic 프로브는 친수성 머리와 소수 성 꼬리, 수용 성 역 입력 하 고 종료 막 지질 bilayers 능력 들을 만들고 있다. 이러한 styryl 염료는 상대적으로 비-형광 수성 매체에 있지만 원형질 막의 외부 전단에 삽입 한 > 형광 40 X 증가. 신경 시 냅 스에서 FM 염료는 SV endocytosis, 매매 모두 시간과 SV 풀 사이 함께 출시 된 SV exocytosis neurotransmission의 연 접 단계를 시각화 하는 강력한 도구를 제공 하는 동안 내 면. Glutamatergic 냅 개발 및 기능의 기본 유전자 모델은 Drosophila 신경 근육 학 교차로 (NMJ), FM 영상을 염색 SV 역학 돌연변이 조건의 넓은 범위에서 계량을 광범위 하 게 사용 되었습니다. NMJ 시 냅 스 터미널은, 아름 다운 배열의 큰 시 냅 스 boutons 이미징 응용 프로그램에 적합 합니다. 여기, 우리가 비교와 초파리 NMJ 활동 종속 FM1 43 염료 글귀/릴리스를 자극 하는 세 가지 방법으로 대조: 높은 [+K] 신경 근육 학 조직 depolarize, 2) 흡입 전극 모터 신경의 응용 프로그램 1) 목욕 연 접 신경 맨끝, 및 3 depolarize를 자극) 대상의 도발은 빛 자극, 공간 제어를 위한 channelrhodopsin 이체의 유전자 변형 식. 이러한 메서드의 마다 장점과 단점 SV 주기 유전자 변이 효과의 연구에 대 한 초파리 NMJ에. 우리는 이러한 장점과 단점 각 전략을 구체적인 방법론을 함께 자극 방식의 선택에 도움을 논의할 예정 이다. 형광 이미징, 뿐만 아니라 FM 염료 ultrastructural 수준에서 SV 사이클 메커니즘 연구를 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 시각화 하는 전자 밀도 신호를 photoconverted 수 있습니다. 우리 confocal의 비교를 제공 하 고 전자 현미경 이미징 도움말 가이드에 초파리 NMJ 자극의 다른 방법에서 미래 실험 패러다임의 선택.

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FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

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Nanyang Technological University

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Channels and the Electrical Properties of Membranes

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8.3K 조회수.  Vanderbilt University. 시 냅 스 소포 (SV) 자전거는 신경 시 냅 스에서 세포 커뮤니케이션의 핵심 메커니즘. FM 염료 통풍 관 및 릴리스 양적 SV 엔도-및 exocytosis 시 금의 기본 수단입니다. 여기, 우리는 모든 자극 방법 FM1 43 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) 모델 시 냅 스에서 자전거를 비교 합니다.

비디오: FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

기본 모드 네트워크를 검사하기 위해 Transcranial 자석 자극과 fMRI를 결합

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

연구

신경과학

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

TMS의 국가 종속성 효과 : 동기 Phosphene 동작 좀보세요

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

NeuroStar TMS 장치 : FDA를 실시는 우울증 치료 프로토콜을 승인

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

달팽이 내부 세포에 문의 수입 성의 Dendrites에서 Postsynaptic 레코딩 : 리본 시냅스에서 모니터링 Multivesicular 릴리스

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a reduction in neuronal population and function. Damaged axons can release excitatory molecules including potassium or glutamate into the extracellular matrix, which in turn, can produce further insult and injury to the supporting glial cells including astrocytes and oligodendrocytes 8, 16. If the insult persists, cells will undergo programmed cell death (apoptosis), which is regulated and activated by a number of well-established signal transduction cascades 14. Apoptosis and tissue necrosis can occur after traumatic brain injury, cerebral ischemia, and seizures. A classical example of apoptotic regulation is the family of cysteine-dependent aspartate-directed proteases, or caspases. Activated proteases including caspases have also been implicated in cell death in response to chronic neurodegenerative diseases including Alzheimer's, Huntington's, and Multiple Sclerosis 4, 14, 3, 11, 7.
In this protocol we describe the use of the NucView 488 caspase-3 substrate to measure the rate of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte (OLG) cell cultures 15, 5, following exposure to different extracellular stresses such as high concentrations of potassium or glutamate. The conditionally-immortalized N19-OLG cell line (representing the O2A progenitor) was obtained from Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, and has been previously used to study molecular mechanisms of myelin gene expression and signal transduction leading to OLG differentiation (e.g.6, 10). We have found this cell line to be robust with respect to transfection with exogenous myelin basic protein (MBP) constructs fused to either RFP or GFP (red or green fluorescent protein) 13, 12. Here, the N19-OLG cell cultures were treated with either 80 mM potassium chloride or 100 mM sodium glutamate to mimic axonal leakage into the extracellular matrix to induce apoptosis 9. We used a bi-functional caspase-3 substrate containing a DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 recognition subunit and a DNA-binding dye 2. The substrate quickly enters the cytoplasm where it is cleaved by intracellular caspase-3. The dye, NucView 488 is released and enters the cell nucleus where it binds DNA and fluoresces green at 488 nm, signaling apoptosis. Use of the NucView 488 caspase-3 substrate allows for live-cell imaging in real-time 1, 10. In this video, we also describe the culturing and transfection of immortalized N19-OLG cells, as well as live-cell imaging techniques.

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell imaging of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte cell cultures using the NucView 488 caspase-3 substrate. This technique is applicable for programmed cell death assays in real-time in a variety of cell types and tissues.

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

경피적 전기 신경 자극을 사용하여 신경 근육 기능의 평가

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

경고 설치류에 Transcranial 전기 두뇌 자극

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.