Name: simple and effective administration and visualization of microparticles in the circulatory system of small fishes using kidney injection
Uploaded: 2018-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection at JoVE.com

저자는 크게 비디오 프로토콜의 준비에 Bogdan Osadchiy 및 Evgenii Protasov (이르쿠츠크 주립 대학, 러시아)의 도움을 인정합니다. 이 연구는 기초 연구 (#15-29-01003)에 대 한 러시아 과학 재단 (#15-14-10008) 및 러시아 재단에 의해 지원 되었다.

모든 실험 절차는 동물 실험에 대 한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 실시 했다 하 고는 동물 주제 연구 위원회 연구소의 생물학의 이르쿠츠크 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. Microcapsules의 제조
참고: Microcapsules 형광 염료를 들고 반대로 충전된 polyelectrolytes7,8의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 모든 절차는 실 온에서 수행 했다.
<ol><li>형광 염료를 포함 하는 다공성 CaCO3 microcores 합성, 혼합 SNARF-1-dextran 솔루션 (FITC BSA 등 대부분 폴리머 바인딩된 형광 염료를 사용할 수 있습니다.)의 2 개 mL ~ 2 mg/mL의 농도에서 0.6 mL CaCl2의 1 mol/L 솔루션 와 나2CO3 빠른 교 아래. 참고: photobleaching;에 형광 염료의 다른 감도에 관심을 지불 (SNARF-1) 같은 빛에 민감한 형광 프로브를 사용 하는 경우는 미의 저장 하 고 조작 해야 합니다 수행할 수 가능한 작은 빛으로.</li>
	<li>동요의 5-10 s, 후 전송 현 탁 액 2 mL microcentrifuge 튜브와 15에 대 한 원심 분리기 CaCO3 microcores 펠 렛에 10000-12000 g에서 s.</li>
	<li>삭제는 상쾌한, 이온된 수, ~ 2 mL와 코어를 세척 하 고 떨고 하 여 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>세 번 총에에서 원심 분리 세척 절차를 반복 합니다. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>그들의 집계를 줄이기 위해 초음파 목욕에서 1 분 microcores를 품 어. 주의: 헤드폰으로 귀를 보호 하기 위해 잊지 마세요.</li>
	<li>서식 파일에서 첫 번째 폴리머 레이어를 입금, 1 mol/L NaCl에에서 poly(allylamine hydrochloride) (PAH)의 4 mg/mL 해결책의 ~ 2 mL에 코어를 resuspend.<ol>
<li>일정 한 동요와 ~ 5 분에 대 한 솔루션에는 microcores를 유지.</li>
		<li>15 후 원심 분리의 s 삭제 언바운드 PAH와 상쾌한. 3 번 이상 여러 원심 분리 및 세척 단계를 통해 이온을 제거 된 물으로 덮여 microcores 세척. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
		<li>그들의 집계를 줄이기 위해 초음파 목욕에서 1 분 microcores를 품 어. 참고: 폴 리 (나트륨 4-styrenesulfonate)에서 시작 하는 경우 적용 된 형광 성 염료는 양이온, (PSS) 1 mol/L NaCl에에서 (단계 1.7 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>서식 파일에 두 번째 폴리머 레이어를 입금 PSS (또한 1 mol/L NaCl을 포함 하는)의 4 mg/mL 해결책의 ~ 2 mL와 1.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>1.6 및 1.7 6 번 입금 12 폴리머 레이어를 단계를 반복 합니다. 참고: 권장 되지 않습니다 (~ 12 h 이상) 긴 휴식 ~ 3-5까지 절차에 레이어 입금 되었습니다 때문에 보험 없이 CaCO3 microcores recrystallize 하는 경향이 있습니다. Note PSS 범위는 microcores의 더 높은 집계 원인과 긴 일시 중지는 (PLL-g-PEG) outmost 레이어는 PAH 또는 폴 리-L-리 신 폴 리 에틸렌 글리콜으로 투입 하는 경우에 좋습니다.</li>
	<li>2 mg/ml PLL-g-말뚝 (microtube 당 ~ 1 mL) 적어도 2 시간에 대 한 커버 microcores를 품 어.<ol>
<li>Microcores 연속 원심 분리 및 물의 resuspension 단계를 통해 물으로 씻는 다. 마지막 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>빈 microcapsules를 하려면 대상된 microcores를 사용 0.1 mol/L ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (NaOH로 pH 7.1 조정)의 2 개 mL를 추가 하 여 CaCO3 서식 파일을 분해.<ol>
<li>외피의 ~ 5 분, 후 원심 45 s 및 삭제에 대 한 microcapsules EDTA와 상쾌한.</li>
		<li>1.10 1.10.1 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.9 %NaCl 여러 원심 분리를 통해 세 번 45 내 단계 microcapsules 세척 세척 단계 뒤에 s. 원심 분리의 마지막 단계, 후에 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 주입에 대 한 최종 microcapsule 솔루션 유지 되어야 한다 살 균 (예를 들어 추가 하 여 암 피 실린, 0.1 mg/mL), 그리고 미디어 생체 조사 (isotonic 미디어 중립 ph) 대상이 되어야 합니다.</li>
	<li>형광 현미경 hemocytometer에 준비 된 microcapsules의 농도 견적 한다. microcapsules의 그림의 일련, 한 백 microcapsules ImageJ9 또는 해당 소프트웨어를 사용 하 여에 대 한의 직경을 측정 하 고 히스토그램을 사용 하 여 크기 분포를 조사.</li>
	<li>저장소는 획득된 캡슐화 프로브 어둠 속에서. 참고: 살 균 0.9%에서 여러 빨 래 후 NaCl, microcapsules는 4 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있다 저장 동안에 microcapsules의 완전 한 건조 하는 것은 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>2. 준비의 광학 설치 및 Microencapsulated SNARF-1의 교정
참고: microencapsulated SNARF-1 거친 pH 측정 형광 현미경7의 두 채널의 이미지를 사용 하 여 만들 수 있습니다 하지만 섬유 분석기에 연결 된 한 개 채널 형광 현미경이이 프로토콜에 적용 했다.
<ol><li>필요한 일련의 형광 필터 적용 된 형광 염료의 특성에 따라 형광 현미경에 놓고 형광 램프를 켭니다.<ol>
<li>접 안경에 레버를 당겨. 주의: 초과 빛 분석기 매트릭스를 손상 수 있습니다. 따라서, 레버는 "아이피" 모드는 분석기를 사용 하지 않을 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>분석기와는 다른 쪽 끝을는 겨냥 틀을 광섬유의 한쪽 끝을 연결 합니다. 어댑터를 사용 하 여 카메라 튜브의 초점 또는 형광 현미경의 다른 사용 가능한 포트에는 겨냥 틀을 배치 합니다.</li>
		<li>분석기를 켭니다. 분 광 계 제어 프로그램을 실행 하 고는 분석기 측정을 위한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microcapsule 배치의 교정에 대 한 microcapsule 정지 (이온된 수 µ L 당 10 ~ 000 microcapsules)의 ~ 5 µ L 현미경 슬라이드에 놓고 건조 (35 ° C에서 온도)에서 예를 들어 어두운 장소에 드롭.<ol>
<li>Microencapsulated SNARF-1의 스펙트럼 특성을 보정 하려면 다른 pH 값 범위 ~ 6-9에에서 버퍼의 시리즈를 사용 합니다. ~ 10 µ L SNARF-1-dextran와 말린된 microcapsules에 버퍼를 삭제 하 고는 coverslip로 그것을 커버.</li>
		<li>현미경 단계에 유리 슬라이드를 놓습니다. Microcapsules를 × 40 목표를 사용 하 여 찾습니다.</li>
		<li>카메라 포트를 현미경 레버를 설정. 그들의 형광 분석기를 등록 합니다. 레버는 접 안 렌즈를 다시 설정 합니다. 참고: 배경 수준 보다 훨씬 스펙트럼 신호는 다는 것을 확인 하 고 보기의 필드에 microcapsules는 거품에서 (로 전환 하 여 낮은 확대 필요한 경우) 확인 합니다. 동일한 microcapsules의 장시간된 조명을 하지 마십시오. SNARF-1은 photobleaching에 민감합니다.</li>
		<li>10-15 회 다른 microcapsules에 대 한 단계 2.2.3을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 등록 된 스펙트럼에 대 한 형광 피크 비율 (예: R 또는 Scilab 사용)을 계산 하 고 회귀선 (각 버퍼)에 대 한 평균 비율 및 다음 수식을 사용 하 여 중간 pH 사이 결정: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg"> 참고: SNARF-1 스펙트럼 protonated 및 deprotonated 염료의 방출에 해당 하는 두 개의 봉우리 있으며 봉우리 사이의 비율 매체의 pH에 반응입니다. 이 연구에서 605, 660 nm의 형광 강도 사이 비율 사용 됩니다. 이 파장은 사용 하는 필터 설정에 따라 선택 됩니다. a 와 b 는 계수 비 선형 회귀 (예: R를 사용 하 여)에 의해 결정 됩니다. 0.15 및 1.1 값은, 각각,의 최소 및 최대 값 나605/I660 는 교정 중 관찰.</li>
	<li>약 5 성인 동물에서 물고기 혈액의 약 10 µ L를 수집 합니다. 장소 1 µ L/mL와 페 트리 접시에 마 취에 대 한 정 향 오일의 서 스 펜 션 물 생선과 동물의 측면에는 지 느 러 미의 pinches을 응답 하지 않습니다 때까지 기다렸다가 (보통 2 ~ 3 분). 유리 슬라이드에 물고기를 전송 합니다. 물고기 꼬리는 바소와에서 잘라내어 꼬리 정 맥에서 물고기 혈액의 약 2 µ L를 수집. 참고: 혈액 응고 방지 하기 위해, 헤 파 린 (5000 U/mL)와 절 개를 치료 하 고 heparinized 유리 모 세관 및 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 혈액을 수집.<ol>
<li>microelectrode의 끝에 피 펫과 혈액의 약 10 µ L 똑 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 결정 합니다.</li>
		<li>말린된 microcapsules와 함께 슬라이드에 혈액을 삭제 하 고 등록 교정 버퍼 (2.2-2.3 단계)에 대 한 설명으로 형광 강도의 비율.</li>
	</ol>
</li>
	<li>곡선 (대 한 자세한 내용은 참조 Borvinskaya 외. 20175) 물고기 혈액 측정 일치 하도록 교정 곡선의 선형 계수를 조정 합니다.</li>
</ol>3입니다. 주입에 대 한 준비
<ol><li>날카로운 바소와 플라스틱을 제거 하 여 인슐린 펜 (또는 주사기)의 끝에서 강철 바늘을 놓습니다. 참고: 모든 얇은 바늘 (Ø0.33 m m 또는 더 적은) 또는 유리 모 세관 (일반적으로 Ø1 m m) microinjection10,11준비 될 수 있다.</li>
	<li>유리 microcapillary; 중간 바늘 삽입 신속 하 고 부드럽게 솔더 가스 토치를 사용 하 여.</li>
	<li>유리 microcapillary는 microinjector에 연결 하 고 세 번 살 균 물으로 플러시. 액체는 바늘에 흐르는 확인 하십시오.</li>
	<li>증류수로 시스템을 채우십시오. 참고: 시스템에 있는 아무 거품 다는 것을 확인 하십시오.</li>
</ol>4입니다. 주입
<ol><li>Microcapsules의 준비 된 현 탁 액 resuspend (살 균 0.9 %NaCl에서, 또는 어떤 다른 매체 든 지에 사용 microliter 당 0.5 6 백만 microcapsules의 농도 주사) 1 분 동안 초음파 목욕을 사용 하 여. 참고: 다음 주입 동안 침전 하는 microcapsules 경향이 있기 때문에 동요는 microcapsules와 유리병 기계적으로 (로 터를 사용 하 여) 또는 수동으로 수 분 마다 그들을 resuspend 하 고 그들의 집계를 방지.</li>
	<li>장소 마 (정 향 오일 물에 0.1 mL/L)와 페 트리 접시에 물고기 2 ~ 3 분 대기 물고기의 측면에는 지 느 러 미의 빛 핀치에 응답 하지 않습니다 때까지.</li>
	<li>숟가락을 사용 하 여, 마 취에서 생선을 전송 하 고 부드럽게 머리 (사람을 위해 오른 손잡이) 왼쪽으로 또는 오른쪽 (왼손잡이 사람)에 대 한 가로 위치에 젖은 스폰지에 두십시오.</li>
	<li>주사의 바로 전에 1-2 m m 유리 모 세관으로 공기의 microinjector와 연결 된 빨 아. 그런 다음, 분산 된 microcapsules의 약 2 µ L와 함께 로드 됩니다. 참고: 주입, 전에 microcapsule 솔루션 물고기 지켜진다 온도를 조정할 수 합니다.</li>
	<li>부드럽게 비 지배적인 손 가진 스폰지에 물고기의 시체를 안정화 합니다.<ol>
<li>물고기의 측면 라인을 찾아. 정신적으로 복 부 구멍의 끝에는 operculum에서 확장 하는 세그먼트를 선택 합니다. 이 세그먼트의 중간을 찾아. 더 낮은 복 부 방향으로 1 m m 바늘을 넣어.</li>
		<li>된다고 운동, 생선 비늘, 고 펑크 부드럽게 이동 합니다. 테이블 표면에 45 °의 각도에서 본문에 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>그것은 신중 하 게 그것에 대하여 휴식 때까지 척추 쪽으로 바늘을 밀어.</li>
		<li>신장에 microcapsules의 현 탁 액의 약 1 µ L를 놓고 천천히 바늘을 철회. 참고: 적절 한 바늘 사이트를 찾을 수 쉽게, 유용 그림 2A 와 2B와같이 아래 빛을 사용 하 여 물고기를 transilluminating 하 여 트렁크 신장을 찾는 연습을 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>씻어 주사 사이트에서 유출된 된 microcapsules를 제거 하는 물 스트림 꼬리에 머리에서 물고기.</li>
</ol>5. Vivo에서 시각화
<ol><li>해 부가 위를 사용 하 여 물고기 머리에서 아가미 덮개를 제거 하 고 물고기 아가미를 발가 벗기다. 린스 물으로 아가미.</li>
	<li>숟가락을 사용 하 여, 현미경 슬라이드에 물고기를 전송 하 고 형광 현미경의 스테이지에 배치. 참고: 연속 절차 동안 물고기의 아가미를 건조 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. 이 방지 하려면 정기적으로 축 축 하 게 그들 파스퇴르 피 펫 (1-2 분 마다 약)를 사용 하 여 물으로.</li>
	<li>방을 어둡게 하 고 형광 microcapsules 데 아가미 검사 낮은 배율 (x 10의 목표)를 사용 하 여. 참고: 물고기 순환 시스템에 몇 가지 형광 입자의 도입에 대 한 절차를 사용 하는 경우이 좋습니다 주사 하기 전에 예기치 않은 형광 입자에 대 한 몇 가지 개인의 아가미를 검사. 야생-타입 zebrafish의 아가미 autofluorescence, 필요가 없습니다 하지만 경우에 따라 (같은 음식 조각 또는 단 세포 symbionts) 산발적 형광 입자 아가미에 수 있습니다. 경우 필요한, 이러한 입자 인식 될 수 있다 그들의 특정 모양에 따라 (예를 들어 음식 조각을 구형 microcapsules 달리 불규칙 한 모양) 또는 형광 스펙트럼 (즉, 색상).<ol>
<li>더 높은 크기 (× 40 목표), 렌즈를 전환 하 고 한 microcapsule 또는 microcapsules의 그룹 보기의 필드의 중앙에 위치 합니다.</li>
		<li>연결된 분석기와 포트에 레버를 설정. 스펙트럼 신호를 기록 합니다.</li>
		<li>레버는 접 안 렌즈를 다시 설정 합니다.</li>
		<li>여러 번 다른 microcapsules에 대 한 측정을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구에 대 한 적절 한 환기와 수족관에 물고기를 전송 합니다. 참고: 최소의 연습으로, 그것은 주입 및 물고기 마다 2-3 분의 대략적인 속도로 기록 하는 신호를 수행할 수 있습니다. 측정 반복된 낮은, 무해 한 복용량 마 취의 또는 고정의 또 다른 방법은 사용 하 여 하나의 개별 여러 번 반복할 수 있습니다. 장기 관찰에 대 한 지속적인 마 취12시스템을 사용 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

Zebrafish 신장으로 미의 주입을 보여 우리 반 투과성 microcapsules 지시자 염료와 로드를 사용 합니다. 따라서, 프로토콜 반대로 충전된 polyelectrolytes7,8,,1516,17의 레이어, 레이어 어셈블리를 사용 하 여 microcapsules의 제조에 대 한 지침을 포함 ,18 (그림 1A). 이 기술의 장점은 사용 가능한 실험실 장비로 수행 하기 쉽습니다. 조건 및 화합물 사용에 따라 조작된 microcapsules 0.5에서 나노미터 두께 전해질 셸15100 µ m 까지입니다. 합성 매개 변수 크기 (그림 1B 및 1 C)에 약 2-6 µ m이 원고 중합체의 (뿐만 아니라 최종 생체 레이어) 12 층으로 구성 된 탄력 있는 microcapsules에에서 설명 합니다. microcapsules의 크기를 결정 하는 가장 중요 한 단계 서식 파일 microcores의 형성 이다. 이 프로세스 포함 한다 탄산 칼슘 결정의 자발적인 형성 되며 따라서, 얻은 입자 균일 하지 않은. 따라서, 모든 일괄 처리에 대 한 microcapsule 크기 분포의 특성화를 수행 되어야 한다.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 micromanipulation 기술의 사용 없이 zebrafish 순환 시스템으로 미의 납품의 최적화 이다. 레트로 궤도 주입 하 여 전체 셀의 세부 사항3에 이전 설명 하고있다. 그러나, 우리의 경험에, 그것 쉽지 않다 복고 궤도 구멍은 매우 작고 인 두와 아가미 아치, 실수로 바늘으로 손상 하기 쉬운 위치 때문에 작가 의해 설명 된 주입 효율을 얻기 위해 초보 사용자를 위한. 밀리미터 미만부터 정확도 필요 주사, 제대로 주입 다소 어려운 작업입니다. 동등 하 게 신속 하 고 효율적 대안 (표 1) 물고기 신장 실질에 직접 주입 하는 것입니다. 주입, 동안 바늘 기계적 손해 신장 모세 혈관과 혈관 (예를 들어, 최대 후부 추기경 정 맥), 순환 시스템 (그림 2E)으로 미의 입구를 수 있습니다. 마지막으로, 성인 zebrafish에 트렁크 신장의 중앙 급등이 큰 만큼 (최대 2 m m) microsurgical 장비 없이 수동 분사에 대 한.
주사 바늘의 적절 한 위치 하는 것이 성공적인 수동 관리에 대 한 중요 합니다. Transilluminating 물고기 그림 2A 와 2B와 같이 아래 빛을 사용 하 여 트렁크 신장 그대로 동물에 찾는 연습할 수 있습니다. 그림 2B 에서 구성표에서는 주사를 제대로 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 혈 류로 미를 관리 하는 절차 못하면 다시 주입 개인의 생존 율에 거의 아무런 영향 짧은 시간 내 같은 펑크에서 만들 수 있습니다.
(테스트도 성공적으로 성인 붕어 Poecilia reticulata에) 성인 zebrafish의 트렁크 신장에 주입 허용 동물 사망률;과 생선 류에 microparticle 배달의 효과적인 방법입니다. 그러나, 주입 된 볼륨에 있는 변이 때문에 약국에 대 한 완벽 하 게 적당 하다. 이 방법의 약점은 빠른 관리 때문에 복 부에 신장에서 솔루션의 중요 한 누설. 그럼에도 불구 하 고, 혈 류 량으로 주입 하는 물질의 상대적 양은 수 될 대략 추정 아가미 모세 혈관 (표 2)의 시각화를 사용 하 여. 사출 볼륨의 엄격한 제한은 없습니다 하지만 정지 이상 1 µ L의 효과적인 것 같습니다. 최고의 유리 모 세관 microinjection;에 대 한 적용 될 수 있습니다. 그러나, microcapsules의 많은 집계 선동 경향이 있기 때문에 31-29 G의 사용 권장 (Ø 0.33-0.25 m m) 강철 바늘을 바늘 루멘에 나 막 신을 피하기 위해.
신장 혈 류 량으로 주사를 통해 microcapsule 배달의 성공 아가미에 형광 입자의 존재에 대 한 빠른 검사를 사용 하 여 모니터링 해야 합니다. 아가미는 vivo에서 관측을 위해 쉽게 접근할 수 있는 기관 이다. 길 필은 혈액 모 세관 혈액의 흐름 intravital 이미징 아가미에 특히 편리 하 게 호흡기 상피의 얇은 층에 의해 보호 (자연 광학 창의 일종)의 네트워크. 관측을 수행 하려면 연골 아가미 덮개는 필 라 멘 트 폭로 잘릴 수 있다. 이 절차는 수명 감소 없이 잘 화난된 물 denuded 아가미 살 수 있는 물고기에 대 한 안전. 또한, 큰 물고기의 아가미 방법19에서 operculum 추진 하면 현미경으로 시험 될 수 있다. 성공적인 주입의 경우 형광 미 즉시 아가미 (그림 3)에 나타납니다. Note는 이식된 미는 순환 혈액 볼륨에 상당히 녹아 있는 그리고 입자는 아가미 모세 혈관에 도달, 따라서 미의 충분 한 농도 검출 후 물고기 아가미에 선택 해야 합니다 물고기 신장 (표 2)으로 하는 주입
이식에 대 한 제안된 절차는 작은 물고기의 다른 종의 관련 연구의 넓은 범위에 적용할 수 있습니다. 기술을 개발 하 고 순환 시스템으로 형광 미의 주입을 위해 최적화 된 데에 불구 하 고 그것은 비 색 마이크로/나노 입자의 주입에 대 한 적용할 수 있습니다 또는 해산 물질; 그러나,이 경우 주입의 효과 다른 방법으로 확인 되어야 한다. 현재 기술된 단계는 이러한 목적에 대 한 최적의 사용 하 여 다른 광학 마이크로-또는 nanosensors, 맥 관 구조의 시각화, 백신 이나 약물의 배달 일부 광학 표시 사업자의 주입으로 생리 적 모니터링 유전자 변형된 세포입니다.

동물 유기 체에 마이크로 크기 입자의 관리 약물 및 백신 납품1, 맥 관 구조 시각화2, 유전자 변형 세포 이식3및 작은 광학 센서 이식 등의 분야에서 중요 한 작업입니다. 4 , 그러나 5., 작은 실험실 동물의 혈관 시스템으로 미 입자에 대 한 주입 절차는 어려운, 특히 섬세 한 수생 생물에 대 한. Zebrafish 같은 인기 있는 연구 표본에 대 한 조언 비디오 프로토콜을 사용 하 여 명백 하 게이 프로시저를.
Intracardiac 및 모 세관 microinjections zebrafish 혈액으로 microobjects의 납품을 위한 훈련 된 인력과 독특한 미세 시설 필요. 이전, 역 궤도 수동 주입3 전체 셀의 관리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법으로 제안 했다. 그러나, 우리의 경험에 눈 모 세관 네트워크의 작은 지역 때문에 걸리는이 기술에서 원하는 결과 달성 하기 위해 많은 연습.
여기, 우리 기술 순환 시스템으로 강력 하 고 효율적인 microparticle 이식 하는 방법 성인 zebrafish의 신장 조직에 직접 수동 주입는 모세 혈관과 신장 혈관이 풍부 하다. 이 기술은 세포 이식 zebrafish 신장6에 대 한 비디오 프로토콜에 기반 하지만 외상 및 시간이 걸리는 microsurgical 단계 탈락 했다. 제안된 된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다.
제안 된 프로토콜의 중요 한 부분이 이다는 이식된 미 (해당 되는 경우에 그들은 형광 또는 colorized) 아가미 모세 혈관에 주입 품질, 수의 거친 상대 평가의 확인에 대 한 수의 시각화 주입 된 입자, 그리고 순환 혈액에서 직접 생리 측정 스펙트럼 신호 감지. Vivo에서 zebrafish 혈액 pH microencapsulated 형광 프로브, SNARF-1, 원래에 제안 된 Borvinskaya를 사용 하 여의 측정을 위한 프로토콜 설명 설명된 기술의 가능한 응용 프로그램의 예를 들어, 외. 20175.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-dextran, 70000 MW</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler</td></tr><tr><td>Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>Fluorescent probe</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>Fluorescent probe</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>Cationic polymer</td></tr><tr><td>Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>Anionic polymer</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>To dissolve applied polymers</td></tr><tr><td>Water Purification System</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>To prepare deionized water</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Stegler</td><td></td><td>For CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research&amp;nbsp;plus pipette, 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research&amp;nbsp;plus pipette, 10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips, volume range 200 to 1000 &amp;micro;L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips, volume range 0.1-10&amp;nbsp;&amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed</td><td>BioSan</td><td></td><td>For microcapsule centrifugation-washing procedure</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Microcapsule synthesis and storage</td></tr><tr><td>Shaker Intelli-mixer RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>To reduce microcapsule aggregation</td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td></td><td></td><td>To reduce microcapsule aggregation</td></tr><tr><td>Head phones&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>To protect ears from ultrasound</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>To dissolve the CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates</td></tr><tr><td>Monosodium phosphate</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>Preparation of pH buffers</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>Preparation of pH buffers</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>To adjust the pH of the EDTA solution and buffers</td></tr><tr><td>Thermostat chamber</td><td></td><td></td><td>To dry microcapsules on glass slide</td></tr><tr><td>Hemocytometer blood cell count chamber</td><td></td><td></td><td>To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>In vivo visualization of microcapsules in fish blood</td></tr><tr><td>Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided)</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>Visualization of microcapsules with fluorescent probes</td></tr><tr><td>Fiber spectrometer QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 &amp;mu;m, 2 m</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>To connect spectrometer with microscope port</td></tr><tr><td>Collimator F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>To connect spectrometer with microscope port</td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Coverslips, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Glass microcapillaries Intra MARK, 10 &amp;micro;L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>To collect fish blood</td></tr><tr><td>Clove oil</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>Fish anesthesia</td></tr><tr><td>Lancet No 11</td><td>Apexmed international B.V.</td><td>P00588</td><td>To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector</td></tr><tr><td>Heparin, 5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection</td></tr><tr><td>Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>To determine fish blood pH</td></tr><tr><td>Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>For injection procedure. Any thin needle (&amp;Oslash; 0.33 mm or less) is appropriate</td></tr><tr><td>Glass capillaries, 1 x 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger&amp;auml;te GmbH &amp;amp; Co</td><td>9201075</td><td>For injection procedure</td></tr><tr><td>Gas torch</td><td></td><td></td><td>To solder steel needle to glass capillary</td></tr><tr><td>Microinjector IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>For precise dosing of microcapsules suspension</td></tr><tr><td>Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Plastic spoon</td><td></td><td></td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Damp sponge</td><td></td><td></td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>To remove the gill cover from the fish head</td></tr><tr><td>Pasteur pipette, 3.5 mL</td><td>BRAND</td><td>Z331767</td><td>To moisten fish gills</td></tr></tbody></table>

simple and effective administration and visualization of microparticles in the circulatory system of small fishes using kidney injection

맥 관 구조 시각화, 약물 및 백신 납품, 작은 광학 센서 및 유전자 변형 세포의 이식에 대 한 살아있는 유기 체에 마이크로 크기 입자의 체계적 관리를 적용할 수 있습니다. 그러나, 생물 및 동물 실험실에서 주로 사용 되는 작은 동물에 정 맥 microinjections 매우 어려운 고 숙련 된 직원을 필요. 여기, 물고기 신장에 주입 하 여 성인 zebrafish (Danio rerio)의 순환 시스템에 미의 도입에 대 한 강력 하 고 효율적인 방법을 설명합니다. 시각화는 맥 관 구조에 소개 된 미, 하 우리는 물고기 아가미에 간단한 intravital 이미징 기술을 제안 합니다. 주입 된 microencapsulated 형광을 사용 하 여 달성 되었다 vivo에서 zebrafish 혈액 pH의 모니터링 조사, SNARF-1, 설명 기술의 가능한 응용 프로그램 중 하나를 보여 줍니다. 이 문서는 pH에 민감한 염료의 캡슐화에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 빠른 주사의 원리와 형광 신호의 비보에 기록에 대 한 취득된 microcapsules의 시각화를 보여 줍니다. 주입의 제안된 방법 낮은 사망률에 의해 특징입니다 (0-20%)와 높은 효율 (70-90% 성공), 그리고 그것을 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 쉽습니다. 관 상용 열대어와 메 다카 같은 다른 작은 물고기 종에 모든 설명 된 절차를 수행할 수 있습니다.

얻은 결과 제시 프로토콜의 세 가지 주요 범주 중 하나에서 온: 형광 염료 (그림 1)에 추가 시각화와 microcapsules의 신장 주입의 캡슐화에 의해 형광 미의 형성 모세 혈관 (그림 2 및 3) 아가미와, 마지막으로, vivo에서 스펙트럼의 녹음 SNARF 1 형광 모니터링 하 혈액 pH 수준 (그림 4).
반대로의 계층으로 염료를 포함 하는 템플릿 CaCO3 코어의 코팅을 사용 하 여 레이어, 레이어 접근 청구 (PAH와 PSS) 고분자 및 생체 고분자 (PLL-g-PEG)의 가장 바깥쪽 레이어는 간단 하 고 비용 효율적인 방법 SNARF-1-dextran, FITC BSA 등 다른 (그림 1A) 다른 형광 프로브를 캡슐화 하는 것을 허용. 그 결과, 안정적인 반 투과성 탄성 포탄 크기 및 형광 염료와 로드의 미세 빈 microcapsules (그림 1B) 얻을 수 있습니다. 이 기술에 의해 조작 하는 microcapsules는 일반적으로 비-유니폼, 입자 크기와 각 일괄 처리 (그림 1С) 독특한 중간 크기의 정규 분포.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57491/57491fig1.jpg"> 그림 1 : 레이어, 레이어 합성 및 빈 전해질 microcapsules의 형광 염료와 로드. (A) (Gurkov 외. 20164출판 비슷한 스키마에서 얻을) microcapsules 어셈블리의 계획. (B) 빈 microcapsules의 그림은 형광 염료 FITC BSA와 로드. (C) 그림 1B에서 microcapsules의 배치의 크기. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57491/57491fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
작은 물고기의 순환 시스템에 강력 하 고 효율적인 microparticle 이식 물고기 신장에 직접 수동 주입 하 여 수행할 수 있습니다. 물고기 몸 (트렁크 신장)의 적절 한 사이트에 빵 꾸 미 수동 주입의 신속한 배달을 위해 결정적 이다. 생선 신장은 조 혈 기관 이다 안료 melanophores를 포함 하 고 따라서, 그것은 잘 착 색. 그것은 수영 방광의 투명 한 챔버 사이 자리 잡고, 때문에 약한 염색 또는 그림 2A 와 2B와 같이 하단 광원을 사용 하 여 작은 물고기의 transillumination에 의해 그대로 동물에서 기관 식별 하기 쉽습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57491/57491fig2.jpg"> 그림 2 : 신장 주입에 대 한 적절 한 사이트의 지역화. (A) 는 제 브라의 트랜스 조명 트렁크 신장 (화살표)의 지역화를 보여 줍니다. (B) 제도 적절 한 펑크 사이트를 식별 하는 방법을 보여 줍니다. 흰색 점선 물고기의 복 부 세그먼트의 측면 라인을 나타냅니다. 화살표는 펑크와 척추 쪽으로 주입의 적절 한 방향에 대 한 사이트를 나타냅니다. 수영 방광은 녹색 선으로 지정 됩니다. Zebrafish 신장 기관 및 몸 벽의 제거 다음의 (C) 시각화. 화살표의 트렁크 신장 중앙 부푼 것을 가리킵니다. (D) D. rerio 의 화살 조직학 섹션에서는 성인 물고기의 내부 장기의 일반 해부학 (H & E 얼룩). (E) 후부 추기경 정 맥의 루멘을 가리키는 화살표 (D)에서 축소는 물고기 신장 (점선)의 현미경 사진. 별표는 수영 방광을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57491/57491fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
확인 하려면 주사 절차의 성공, 낮은 배율 (x10-20 목표)에 아가미의 급속 한 시각 검사 물고기 아가미 덮개 (그림 3A) 절단 후 여야 한다. 주입 위치에 남아 또는 신체 구멍 (그림 3B)으로 흘리 고 microcapsules의 대부분에도 불구 하 고 주사를 올바르게 수행 하는 경우 그것은의 아가미 모세 혈관에 자유롭게 떠 형광 microcapsules를 관찰 하는 (그림 3C) 주사 후 즉시 denuded 물고기 아가미. 경우 없는 형광 입자는 아가미, 동일한 찔린에 주입을 반복 가능 하다. 혈 류 배달 총 주입 된 물고기의 약 70-90%에서 얻을 수 한다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57491/57491fig3.jpg"> 그림 3 : 길 모 세관에서 추가 시각화와 microcapsules의 신장 주입. (A) zebrafish 류에 microcapsule 배달의 전체 체계. (B) 녹색 FITC BSA 염료 (펑크 사이트는 화살표로 표시 됩니다)와 microcapsules의 주입 후 zebrafish의 형광 이미지. (C) (B)에서 축소 하는 물고기의 아가미의이 그림 신장 주입에 의해 microcapsules의 성공적인 납품을 보여줍니다 (야생-타입 zebrafish의 아가미가 없는 autofluorescence). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57491/57491fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
물고기 트렁크 신장에 직접 주입 하는 동안 광범위 한 일반적으로 멍이 형성 펑크 사이트 아래 나타내는 실질 모세 혈관에 신장 혈관 손상. 신속 하 게 계약 하는 빵 꾸 때문에 몸에서 혈액 누설이 있다. 내부 출혈에 불구 하 고 개인 약 80-90% (표 1) 절차를 통해 살아남은 여전히 복구할 수 있습니다. 그것은 또한 어 종 부상13,14후 nephrons 드 노 보 를 재생할 수 있습니다 알려져. 경우 물고기의 20% 이상이 죽어가 고 있다, 하나는 anesthetization 제대로 수행 되도록 확인 해야 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">캡슐화 된 형광 염료</td>
			<td rowspan="2">n</td>
			<td rowspan="2">농도, µ L 당 microcapsules</td>
			<td rowspan="2">사출 볼륨, µ L</td>
			<td rowspan="2">Microcapsules µ m의 평균 직경</td>
			<td rowspan="2">생선 류에 배달 %</td>
			<td colspan="2">주입 후 사망률 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 h</td>
			<td>1 일</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">트렁크 신장에 주입</td>
		</tr>
<tr>
<td>FITC BSA</td>
			<td>36</td>
			<td>4 x 106
</td>
			<td>1.6</td>
			<td>2.7</td>
			<td>94</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>SNARF-1-dextran</td>
			<td>29</td>
			<td>3-6 10 x5
</td>
			<td>1-2</td>
			<td>5.1</td>
			<td>72</td>
			<td>7</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>RITC dextran</td>
			<td>20</td>
			<td>6 x 106
</td>
			<td>2</td>
			<td>2.0</td>
			<td>70</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.9 %NaCl</td>
			<td>41</td>
			<td>-</td>
			<td>1-2</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">레트로 궤도 주입</td>
		</tr>
<tr>
<td>FITC BSA</td>
			<td>9</td>
			<td>1 x 105
</td>
			<td>2</td>
			<td>4.2</td>
			<td>11</td>
			<td>22</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>RITC dextran</td>
			<td>11</td>
			<td>6 x 106
</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>9</td>
			<td>18</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. Zebrafish 혈 류로 microcapsules의 납품의 안전 그리고 효율성. 절차의 성공 물고기 아가미 모세 혈관에 형광 물질의 존재에 의해 결정 됩니다.
주입 된 미의 농도가 부족 한 경우, 몇 가지 입자 물고기 아가미에 급속 하 게 구상 될 수 있을 수 있습니다. 같은 시간에 너무 높은 농도 가진 서 스 펜 션 바늘을 막힐 수 있습니다. 평균 직경 2 ~ 5 µ m와 레이어, 레이어 조립된 microcapsules, 경우 µ L 당 약 4 * 105-6 * 106 microcapsules의 농도 물고기 신장 (테이블에 삽입 후 어려움 없이 검출 물고기 아가미에 최적 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>농도, µ L 당 microcapsules</td>
			<td colspan="7">다른 개인의 아가미에 현미경 분야의 보기 (× 20 목표)에서 microcapsules의 수 (n = 7 농도 당)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x 106
</td>
			<td>> 100</td>
			<td>> 100</td>
			<td>0</td>
			<td>> 100</td>
			<td>≈ 70</td>
			<td>≈ 50</td>
			<td>> 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x 105
</td>
			<td>≈ 10</td>
			<td>≈ 20</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>≈ 20</td>
			<td>≈ 40</td>
			<td>≈ 15</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x 104
</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 x 103
</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. FITC BSA 포함 된 microcapsules에서의 시각적 계산의 기록 D. rerio 후 아가미 주입 (1.6 µ L) 트렁크 신장으로.
물고기 순환 시스템으로 미 이식의 제안된 된 방법 microencapsulated 형광 프로브, SNARF-1 (그림 4)에 의해 vivo에서 zebrafish 혈액 pH의 모니터링에 대 한 적용할 수 있습니다. SNARF-1 (그림 4A) protonated 및 deprotonated 염료의 방출에 해당 하는 두 개의 봉우리는 스펙트럼, 따라서 미디어의 다른 pH에서 봉우리 사이의 비율의 곡선 수 교정 플롯 (그림 4B). 혈액의 구성 요소에 캡슐화 된 SNARF-1의 (그림 4B), microcapsules 및 유리 microelectrode와 pH-미터 혈액 pH의 동시 측정에 의해 실험적으로 평가 될 수 있는 판독 영향. Zebrafish 혈액에서 microcapsules에 대 한 상 상속 보정 곡선 계수 같은 실험적으로 측정 하는 pH 차이 의해 버퍼의 곡선을 이동 하 여 표시 한다 (Borvinskaya 외. 20175 에 대 한 자세한 내용은 참조).
Zebrafish 아가미 모세 혈관에서 혈액 pH microcapsules (그림 4C)의 주입 후 적어도 몇 시간 동안 안정적인 남아 있습니다. 같은 시간에 짧은 hypercapnic 노출 연구 vivo에서 작은 물고기에 대 한 방법의 적용을 보여 혈액 pH의 통계적으로 유의 한 감소에 지도 한다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57491/57491fig4.jpg"> 그림 4 : Zebrafish 혈액의 모니터링의 대표적인 예 Microencapsulated 염료 SNARF-1의 형광 스펙트럼의 등록에 의해 рН. (A) 준비 된 microcapsules의 스펙트럼 SNARF-1 다른 pH에서 나트륨 인산 염 버퍼에 로드합니다. 나트륨 인산 염 버퍼 및 추출 된 zebrafish 혈액 준비 pH에 민감한 microcapsules의 (B) 보정 곡선. 모든 측정, 평균 ± 표준 편차 그려져 있습니다. (C)는 vivo에서 모니터링 zebrafish 혈액 рН의 캡슐화 된 형광 SNARF 1 염료 zebrafish 아가미 모세 혈관에 의해의 대표적인 예입니다. 제어 조건에서 혈액 산도 5 분 노출 심한 hypercapnia (녹은 CO2의 900-1000 mg/L)에서 발생 물고기 혈액의 산성화 동안 microcapsules, 주사 후 4 시간 동안 안정 남아 있습니다. 별표 p < 0.01 (맨-휘트니 U 테스트)와 병렬 제어 그룹에서 통계적으로 유의 한 차이 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57491/57491fig4large.jpg">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

이 문서에서는 빠르고, 최소 침 습으로 주사를 형광 미의 작은 물고기의 circulatory system 및 물고기의 혈액에 미의 비보에 시각화의 원칙을 보여 줍니다.

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K 조회수.  Institute of Biology at Irkutsk State University. 이 문서에서는 빠르고, 최소 침 습으로 주사를 형광 미의 작은 물고기의 circulatory system 및 물고기의 혈액에 미의 비보에 시각화의 원칙을 보여 줍니다.

비디오: Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

연구

생물학

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

발생학

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

성인 Zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Intramyocardial Injection for the Study of Cardiac Lymphatic Function in Zebrafish

Zebrafish have proved to be an important model for studying cardiovascular formation and function during postembryonic development and regeneration. The present protocol describes a method for injecting fluorescent tracers into the zebrafish myocardium to study interstitial fluid and debris uptake into cardiac lymphatic vessels. To do so, microspheres (200 nm diameter) and quantum dots (&#60;10 nm diameter) are introduced into the myocardium of live zebrafish, which can be tracked using ex vivo confocal microscopy. These tracers are then tracked intermittently over several hours to follow clearance from the myocardium into cardiac lymphatic vessels. Quantum dots&#160;are transported through cardiac lymphatic vessels away from the heart, while larger microspheres&#160;remain at the injection site for over three weeks. This method of intramyocardial injection can be extended to other uses, including the injection of encapsulated MS or hydrogels to locally release cells, proteins, or compounds of interest to a targeted region of the heart.

The present protocol allows efficient and stable delivery of fluorescent microspheres (MS) and quantum dots (QD) into the myocardium of live fish that can be tracked (traced) over time.

Zebrafish have proved to be an important model for studying cardiovascular formation and function during postembryonic development and regeneration. The ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

보 먼의 공간 2 광자 현미경에 의해 촉진 생쥐에서의 Micropuncture

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Intrathoracic Injection for the Study of Adult Zebrafish Heart

The adult zebrafish heart provides a powerful model in cardiac regeneration research. Although the strength of this system is based on transgenic approaches, a rapid delivery of exogenous factors provides a complementary technique in functional studies. Here, we present a method that relies on administration of a few microliters of solution into the pericardial cavity without causing myocardial damage. Intrathoracic (IT) injections can efficiently deliver proteins and chemical compounds directly onto the heart surface. The injected substances diffuse through the epicardium into the underlying cardiac tissues. Compared to intraperitoneal (IP) injections, the main advantage of intrathoracic injections is the focal administration of the tested factors on the target organ. The delivery of molecules directly into the pericardium is a suitable strategy for studies of cardiac preconditioning and regeneration in adult zebrafish.

This method relies on the injection of 0.5&#8722;3 &#956;L of solution into the thorax of adult zebrafish. The procedure efficiently delivers proteins and chemical compounds into the proximity of the zebrafish heart without damaging the organ. The approach is suitable for testing effects of exogenous factors on various tissues of the heart.