이 연구는 NIH 교부 금 HL66299 TS, RB, 및 SL, TS에 HL60024 및 HL136869 mf에 의해 부품에 투자 되었다.

모든 동물 절차 검토 했다 기관 동물 관리 위원회의는 남쪽 알라바 마의 대학에 의해 승인 하 고 모든 연방, 주, 및 현지 규정에 따라 수행 했다. 쥐 폐 microvascular 내 피 세포 (PMVECs)의 기본 문화 폐 생물학의 사우스 알라바 마 대학의 센터에서 셀 문화 핵심 시설에서 얻은 했다. 셀 앞에서 설명한 절차16를 사용 하 여 준비 되었다.
1입니다. 세포 독성 Supernatants의 세대
참고: 여기, 우리가 피 녹 농 균의 두 가지 변종이 사용: PA103 그대로 유형 III 분 비 시스템이 감염, 및 ∆PcrV는 유형 III 분 비 체계 부족 하는 동안 대상 셀에 ExoU 및 ExoT exoenzymes를 전송할 수 있는 접종을 다음 대상 셀에 exoenzymes 전송의 능력이.
<ol><li>보 글 보 너 (VB) 한 천 격판덮개17 에 박테리아를 행진 하 고 37 ° c.에 하룻밤 성장<ol>
<li>접시를 준비 하려면 확인 다음 재고 솔루션 (보 글 보 너 염; 10 x 주식): 2 세대 MgSO4, 20 g 구 연산 (자유로운 산), 100 g K2포4및 35 g NaH2포4측정. 1 L와 느린 배기 15 분 압력솥 ddH2O를 추가 합니다.</li>
		<li>450 mL ddH2O 한 천 7.5 g와 압력솥 위와 같이 배치 합니다.</li>
		<li>압력가 마로 소독, 다음 두 솔루션을 50 ° C 물 목욕으로 놓습니다.</li>
		<li>천 하 10 x VB 재고 소금 솔루션 50 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>400 µ g/l (사용 중인 피 녹 농 균 의 변종)에 carbenicillin를 추가 하 고 플라스 크를 소용돌이로 잘 섞어.</li>
		<li>장소 5 mL 개별 멸 균 문화 요리에 VB agar 솔루션의 응고, 및 다음 세균성 시드의 날 때까지 4 ° C에서 저장 한을 수 있습니다.</li>
		<li>세균성 시드 날, 미리 37 ° C에 접시를 따뜻하게 하 고 메 마른 루프를 사용 하 여 격판덮개에 박테리아를 행진 합니다. 장소는 37 ° C 배양 기에서 접시 하룻밤.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 Griffonia simplicifolia 와 긍정적인 얼룩에 의해 PMVEC 순도 확인 lectin 및 형광으로 부정적인 얼룩이 지기 나선 pomatia lectin (동맥 내 피 세포에 대 한 표식). Aliquot 세포와 동결에 액체 질소입니다.</li>
	<li>실험, 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 10% 태아 둔감 한 혈 청, 보충을 유지 하 고 5% CO2를 포함 하는 37 ° C 배양 기에서 세포 성장. 세포를 사용 하 여 구절 5-15에서.<ol>
<li>세포 독성 supernatants의 생성, 2 x 106 셀 개별 150 cm 요리에 접시 및 합류 달성 될 때까지 3-4 일에 대 한 성장. 실험 (아래 참조) 당 두 접시를 사용 합니다.</li>
		<li>세포 독성 supernatants의 분석, 대 한 6-잘의 개별 우물으로 플레이트 1 x 105 셀 접시 하 고 4 일 합류 달성 될 때까지 성장 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상쾌한 생산, 세척 단계 1.3.1 인산 염 버퍼 염 분에서에서 PMVECs의 두 150 cm 요리 중 하나, trypsinize, 및 다음 셀 계산 (우리는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라; 테이블의 자료를 참조). PMVECs와 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 다른 접시를 세척 하 고 중 긴장 20: 1의 감염 (MOI)의 다양성에 피 녹 농 균 의 감염. 이것은 다음과 같이 얻을 수 있습니다:<ol>
<li>P. 녹 농 균,540 0.25 = 2 x 108 CFUs/mL 명이. 이 희석을 준비 하려면 1 mL HBSS 1 mL 일회용 cuvette을 추가 합니다. 0.25의 OD540 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 하는 때 달성 될 때까지 단계 1.1에서에서 준비 된 접시의 충분 한 박테리아를 다쳤어요. 다음 단계는 박테리아를 필요 합니다 얼마나 많은 계산을 제공할 것입니다.</li>
		<li>문화 접시에 있는 PMVECs의 수 결정 되 면 (1.4 위의 단계), 박테리아는 PMVECs를 포함 하는 두 번째, 비 trypsinized 문화 접시에 추가 수 수 확인. 예를 들어 결정 되는 PMVECs의 문화 접시 107 셀 x 1.3를 포함 다음 준비 107 셀 x 20 박테리아/셀 x 1 mL/2 x 108 CFUs x 1.3 = 1.3 mL 박테리아.</li>
		<li>희석 박테리아의 1.3 mL HBSS로 20 mL의 최종 볼륨을 150 cm 접시의 전체 표면 액체, 커버 될 수 있다 다음 PMVECs의 접시에 희석된 박테리아를 추가.</li>
		<li>PMVECs 간격 셀 단층에 형성 하는 접시를 현미경으로 관찰 하면 볼 수 있습니다 때까지 4-5 시간, 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 박테리아와 주사 (참조 그림 1 갭 형성의 적절 한 수준에 대 한)를 품 어.</li>
		<li>상쾌한, 수집 다음 세포 파편을 제거 하는 탁상 원심 분리기에서 2000 x g에서 10 분 원심. 참고: 모든 탁상용 원심 분리기 생성 충분 한 g 수 강제 작은 unlysed 세포와 큰 세포 파편이이 단계에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>박테리아를 제거 하는 필터에 통과 상쾌한 다음 그것의 끝에 연결 된 0.2 µ m 필터 주사기에는 상쾌한 하 거 라.</li>
		<li>메 마른 상쾌한의 약 수를 사용 하 여 세포 독성 시험 (2.1 참조) 나중에 사용-80 ° C에서 상쾌한의 나머지 부분을 고정 하 고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 세포 독성 Supernatants의 분석
<ol><li>세포 독성 분석 실험<ol>
<li>6 잘 요리에서 PMVECs 합류까지 성장. 워시 우물 한번 HBSS, 다음 추가할 필터 소독 상쾌한 (어느 PA103 또는 ∆PcrV 주사 셀에서 수집)의 1.5 mL 개별 웰 스. 부정적인 통제로 또 다른 우물을 메 마른 HBSS를 추가 합니다.</li>
		<li>21-24 h에 대 한 CO2 인큐베이터에 접시에 놓은 다음 셀 살인/세포 독성에 대 한 관찰 (다음 단계 참조). 추가 실험에 대 한 세포 독성을 전시 supernatants 사용 하 고 그 셀 죽이 표시 되지 않는 삭제.</li>
		<li>셀 죽의 정량<ol>
<li>상용 LDH 시험 키트와 제조 업체의 사용 하 여 죽은 세포에서 측정 젖 산 효소 (LDH) 릴리스 절차를 권장 합니다.</li>
			<li>또는, 계량 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 현미경으로 세포 살해. 이 위해, 미세한 이미지와 그대로 셀을 포함 하는 문화 접시의 영역 기록 다음 셀 (지표는 단층에 세포 죽음의) 부족 한 영역을 계량 사용자 지정 ImageJ (국립 보건원) 매크로 (참조 보충 코딩 파일을 사용 하 여 ). 원하는 경우 매크로 단계 다음과 같이 수동으로 수행:<ol>
<li>매크로에 이미지 (RGB 또는 Tiff 형식)을 입력 하 고 15% 포화 픽셀 대비를 조정 합니다. 대비 조정 이미지를 복제 하 보기의 필드 내에서 세포와 간격 영역의 높은 콘트라스트 이미지를 "배경 빼기" 명령을 수행 합니다.</li>
				<li>이 이미지는 원래 이미지에서 빼기 하 고 이미지 계산기 "AND" 함수를 사용 하 여 원본 이미지와 결과 이미지를 결합. 블랙 (간격) 및 임계값 기능 (최소 0, 최대 5 개), 화이트 (셀) 마스크 결과 이미지를 변환 하 고 "이진 침식" 함수를 사용 하 여 이미지에서 노이즈를 제거.</li>
				<li>"지역 분수" 측정을 사용 하 여 결과 이미지에서 흰색 픽셀을 검정의 비율을 측정 합니다. 줄거리와 각 치료 시간에 대 한 익스프레스 소수 지역 최대 간격 영역의 % 포인트.</li>
				<li>계산 방법 및 Tukey의 포스트 hoc 테스트, p 값이 0.05 중요 하 게 고려 보다 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 비교 합니다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>문화 supernatants에 아 밀 로이드, oligomeric 타우, 및 Aβ의 존재를 확립 immunoblot 분석을 사용 합니다. Immunoblot 분석 표준 절차10,11,12, 전기 이동 법 전에 적어도 10 문화 supernatants 집중 제외를 사용 하 여 수행 합니다.<ol>
<li>상쾌한 집중, 상쾌한의 1-2 mL 인 막 10 kDa의 분자량 컷오프는 원심 필터 단위에 배치 합니다. 그런 다음 필터 단위 배치 탁상용 원심 분리기 및 원심 분리기 2000 x g 필요한 정도의 농도가 될 때까지 (보통 45-60 분)를 달성.</li>
			<li>집중 되어 표면에 뜨는11 에서 단백질의 양을 결정 하 고 젤의 개별 우물으로 동일한 양의 샘플을 로드 합니다.</li>
			<li>니트로, 단백질 전송 다음 A11 안티 아 밀 로이드 항 체, T22 안티 oligomeric 타우 항 체, 또는 뒤에 적절 한 2 차 항 체는 MOAB2 안티-Aβ 항 체도 말 프로브 젤을 실행 합니다. 개발 표준 화학 절차를 사용 하 여도 말.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Thioflavin T 시험을 하기 위해 계량 supernatants에서 amyloids thioflavin T 형광 (ThT)를 사용 합니다. 이러한 측정 supernatants 살 균 하는 필터를 사용 합니다.<ol>
<li>10 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)로 8 mg thioflavin T (ThT)를 일시 중단 하 여 재고 솔루션 (50 x) thioflavin T 준비 합니다. 혼합 후, 0.22 μ m 필터 입자 제거를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
			<li>측정을 위해 1 mL 분 광 광도 계 베트에 PBS의 1 mL를 ThT 주식의 20 µ L를 추가 합니다. 장소는 spectrofluorimeter로 희석된 샘플입니다.</li>
			<li>측정 기준 형광 방출 425 nm 여기를 사용 하 여 및 2 nm 단위로 450-575 nm에서 형광 방출 스캔 합니다.</li>
			<li>425 nm 여기를 사용 하 여 시간 경과 검사 수행 및 482 nm 방출, 데이터 취득 모든 0.2의 60에 대 한 s.</li>
			<li>초기 20 시간 경과 검사의 측정 빈 베트에 형광. 20 s, 검사를 일시 중지 하 고는 베트에 필터 살 균 상쾌한의 10 µ L를 추가. 반전으로는 베트를 혼합 하 고는 spectrofluorimeter로 다시 다음 장소.</li>
			<li>최종 40 획득 시간을 기준으로 검색을 다시 시작 데이터의 s.</li>
			<li>완료 되 면 시간 경과 스캔, 2.1.5.3에 같이 동일한 설정을 사용 하 여 최종 형광 방출 스펙트럼 스캔을 수행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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보고서에 없음입니다.

여기 방법 간단한 체 외에 유기 체를 일으키는 폐 렴으로 감염 시 세포 독성 amyloids의 세대의 데모를 허용 하는 설명 되어 있습니다. 이러한 방법에는 세포 배양 세포 독성 분석 실험, immunoblotting, 소설 현미경 방법 및 ThT 바인딩을 사용 하 여 죽이 세포의 정량 포함 됩니다. 그들은 자연 (그림 2 및 그림 4)에서 아 밀 로이드 이며 전시 프리온12의 특성 세포 독성 대리인의 분석은 설명 했다. 폐 렴 중 세포 독성 프리온 분자의 세대에 그들의 병원 방전에 따라 폐 렴 생존자에서 높은 사망률에 대 한 잠재적인 설명을 제공 한다. 실험 진행 중에는이 가능성을 테스트 합니다.
기술된 연구의 모든 주요 이벤트의 세포 독성 상쾌한 세대 이며 두 가지 중요 한 변수를 고려해 야 할 필요가. 먼저, 개요 실험 쥐에서 PMVECs 감염 단계 및 세포 독성 분석 결과 대 한 사용 되었다. 여부를 다른 세포 유형 cytotoxins의 생산을 위해 사용 될 수 있다 하지 조사 세부 사항에, 그리고 그것은 다른 세포 세포 독성 supernatants P. 녹 농 균의 다양 한 변종와 치료 다음과 생성할 수 있을 수 있습니다. 같이, cytotoxins는 자연 속에서 아 밀 로이드 있으며 oligomeric 타우와 Aβ 포함 합니다. 타우 및 베타 아 밀 로이드 단백질을 표현 하는 다른 세포 유형 테스트 하이 가능성이 남아 있지만 세균 접종, 다음 cytotoxins를 생성 하기 위해 유도 될 수 있습니다 기대 하는 합리적인 수 있습니다. 개요 절차 다른 세포 유형 다른 모욕 다음과 같은 세포 독성 amyloids를 생산 하기 위해 유도 될 수 있다 여부 검토를 위해 사용 될 수 있습니다.
세포 독성 supernatants의 세대에서 두 번째 중요 한 변수는 박테리아와 치료 기간입니다. 격차는 단층에서 볼 수 있습니다 때까지 진행 하는 PMVECs의 부 화를 허용 하는 필수적 이다. 셀 단층에 간격의 식별 표시 exoenzymes 호스트 세포 세포질에 슈 도모 나 스 박테리아에 의해 주입 되어 있으며 그는 exoenzymes 철회 셀 테두리 (그림 1)의 결과로 활성입니다. 우리의 경험 셀 테두리의 철회의 시간 포인트는 상쾌한으로 cytotoxin 출시의 신뢰할 수 있는 지표입니다. 그것은 유혹으로 출시 되 고 세포 독성 amyloids 중 oligomeric 타우, 타우 활동의 결과 microtubule depolymerization 세포 모양 변화에 기여 하는 두 개의 이벤트 관련 추측. 실험 어디 치료를 갭 형성을 유도 하는 데 필요한 시간 보다는 더 적은 있다에 약간 성숙한 세포 독성 아 밀 로이드 감지 되었습니다.
이 원고에 설명 된 세포 독성 분석 실험은 간단 하 고 신뢰할 수 있는. 세포 죽음 현미경 검사에 의해 쉽게 관찰 하 고 기록 된 미세한 이미지에서 직접 측정할 수 있다. 여기 설명 된 방법은 cytotoxin 생산 P. 녹 농 균과 쥐 폐 동맥 내 피 세포의 감염에 따라 평가 위해 독점적으로 사용 되었습니다. 그것은 절차 세포 독성 amyloids 에이전트, 병원내 관련 된 모두를 포함 하 여 일으키는 다른 폐 렴으로 감염에 따라 생산 여부를 평가 하기 위해 쉽게 적응 될 수 있는 가능성이 보인다 박테리아와 박테리아와 바이러스에 대 한 책임 지역 사회 획득 폐 렴의 종류입니다. 또한, 보고 절차만 배양된 세포의 감염 시 세포 독성 녹말 체 세대 검사 사용 되었습니다. 세포 배양은 인공 시스템, 그리고 대부분 여기에 설명 된 절차 동물 모델 및 인간의 환자 들의 폐 감염 시 cytotoxins의 생성을 평가 하기 위해 적용할 수 있다. 감염된 한 동물 또는 환자에서 bronchoalveolar 게 같은 생물 학적 체액의 수집 분석을 vivo에서 감염 과정 동안 생성 되는 세포 독성 amyloids 여기 보고의 동일한 종류에서 사용 될 수 있습니다. 물론, 박테리아를 가진 외피의 기간, 동물에 접종 할 때 매우 다를 수 있습니다 그리고 bronchoalveolar 게 궁극적인 치료 기간을 결정 하기 위해 여러 개의 시간 점에서 수집 해야 할 것입니다.
Immunoblot 분석 amyloids supernatants, oligomeric 타우 등 Aβ (그림 3)에 설명 했다. 비록 immunoblot 절차는 표준, immunoblot 분석을 시작 하기 전에 수행 해야 하는 중요 한 단계가입니다. 특히, 그는 supernatants 집중 될 적어도 10 배 immunoblotting 이전 immunoblot 분석에 의해 검출의 제한 해제 집중된 상쾌한에 아 밀 로이드의 금액으로 중요 하다. 여기 보고, 원심 필터를 장착 하는 튜브를 사용 하 여 정기적으로이 농도 단계에 사용 되는 방법 이지만 TCA 강수량, 같은 다른 방법 동일 하 게이 단계에 대 한 유용한으로 될 것 이라고 합리적인 것으로 보인다.
이미지를 사용 하 여 죽이 세포의 정량 중요 한 진보를 나타냅니다. 현재 죽은 세포에서 LDH 방출의 측정을 허용 하는 매우 비싼 키트의 구매에 의존 하는 세포 죽음을 측정을 위해 사용할 수 있는 절차. 여기서 설명 하는 분석 결과 ImageJ 프로그램 NIH 웹사이트에서 다운로드 하는 비용을 포함 한다. ImageJ 프로그램의 간단한 적응 셀 죽이의 상당히 정확한 측정을 허용 한다. 그러나, 그것은 작은 유물 몇 개요 프로토콜의 성능 중 발생 지적 가치입니다. 주요 문제는 초점 접촉의 지역과 같은 셀 조각 셀 다로 문화 요리와 관련 된 남아 있을 수 있습니다. 이 잔여 세포 파편 카메라에 의해 검출 될 수 있다 고 세포는 접시에 남아 있는 인공 표시 줄. 이와 같이, 그것은 드문 값이 100% 셀 죽이이 절차를 사용 하 여 얻어진 다입니다.
보고 분석 결과 시스템의 약점은 그 준비에 cytotoxin amyloids 결코 완전히 정의 된. 이와 같이, 정량이 어렵습니다. ELISA 분석 실험은 각 준비에 개별 종에 대 한 자세한 정보를 제공 하지 않고 다른 amyloids의 총 레벨을 제공 하기 위해 사용할 수 있습니다. 더 정확한 분석까지 질량 사양 또는 생체 외에서 아 밀 로이드 올리고 합성, 개발 될 수 있다와 같은 하나 현재 할 수 있는 최선 셀의 동일한 수를 가진 각 실험을 시작, 같은 기간 동안 품 어 이며 확인 세포 독성에 사용 된 이전 준비로 동일한 비율로 발생 합니다. 규범을 잘 설립의 변형 추가 불확실성을 소개합니다.
요약 하자면, 간단한 체 외에 방법 감염 폐 렴을 일으키는 에이전트 다음 폐 내 피 세포에 의해 독성 녹말 체 분자의 생산 위한 설명 되어 있습니다. 분석 실험 신뢰할 수 고 가능성이 다른 유기 체와 감염 된 동물과 인간 환자에서 얻은 생물 학적 체액을 사용 하 여 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 폐 렴의 장기적인 결과 조사 연구 및 최종 기관 실패 환자 병원 방전에에서 이어지는 메커니즘을 수립에 대 한 이러한 방법은 유용할 것 이다.

폐 렴 생존 하는 환자의 병원 방전1,을 따르는 달에서 사망률 높은2,,34,,56. 대부분의 경우, 죽음은 치기5,6뿐만 아니라 최종 기관 실패 신장, 폐, 심장, 또는 간 이벤트의 어떤 종류에 의해 발생 합니다. 이 환자 인구에 있는 높은 사망 율을 위한 이유는 결코 설립 되었습니다.
폐 렴으로 인수 되 고 중 커뮤니티-분류 또는 병원 인수 (nosocomial), 그리고 폐 렴을 일으킬 수 있는 에이전트 포함 박테리아, 바이러스, 버섯, 그리고 화학 제품. 병원내 폐 렴의 주요 원인 중 하나는 녹 농 균박테리아입니다. P. 농 균 exoenzymes 대상 셀7,8의 세포질에 직접 되 나 다양 한 이펙터 분자 전송 유형 III 분 비 시스템을 사용 하는 그램 음성 유기 체 이다. 폐 내 피 세포의 감염, 동안에 exoenzymes 대상 microtubule 관련 단백질 타우9,,1011,12의 내 피 형태를 포함 하 여 다양 한 세포내 단백질 , 폐 기능 그리고, 때때로, 죽음 감소 심각한 폐 부 증의 결과로 내 피 장벽 붕괴에 지도.
앞에서 설명 했 듯이, 초기 폐 렴을 생존 하는 환자의 병원 방전에 따라 첫 12 개월에 사망률 높은 있다. 이 현상을 설명 하는 잠재적인 메커니즘은 빈약한 장기 결과 리드 초기 감염 시 생성 되는 장 독 소의 일부 형식을. 두 가지 관찰이이 가능성을 지원합니다. 첫째, 교양 폐 내 피 세포 처음 P. 농 균 으로 취급 되는 박테리아는 항생제13에 의해 사망 후 주일 대에 실패 합니다. 둘째, 수명이 긴 prions 및 에이전트 프리온 특성을 가진 다양 한 인간과 동물 질환, 신 경계14,15와 관련 된 질병 특히 입증 되었습니다.
폐 감염 시 수명이 긴 세포 독성 대리인의 잠재적인 생산을 조사 하기 위한 방법 적 설명 했습니다. 일련의 간단한 체 외에서 분석 설명 되어 있습니다 여기 cytotoxin 생산 및 사용 하는 일반적인 폐 렴 원인이 에이전트, P. 녹 농 균감염 다음 활동 조사를 위해 사용할 수 있습니다. 이 분석 실험 조사 가능한 cytotoxin 유도 감염 원인이 폐 렴, 다른 에이전트를 사용 하 여 다음에 쉽게 적응할 수 있어야 하 고 또한 생성 된 supernatants 전체에서 cytotoxins의 효과 조사 하는 데 유용 해야 기관 또는 동물입니다. 마지막으로,는 여기에 설명 된 가능성이 가장 분석 실험 동물 및 인간의 생물 학적 체액 폐 렴 중 cytotoxins의 생산을 위한 테스트에 적응할 수 있을 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rabbit anti beta amyloid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>71-5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A11 amyloid oligomer antibody</td>
			<td>StressMarq</td>
			<td>SPC-506D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T22 anti-tau oligomer antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ABN454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat antirabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains PA103 and &#916;PcrV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Griffonia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Helix pomatia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron nitrocellulose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30898.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium salt</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>795496-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium phosphate heptahydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>MP021914221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>50-103-5801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10277</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

누가 살아남을 폐 렴 환자 병원 방전을 따르는 달에서 사망률 높은 있다. 그것은 폐 렴 중 폐 조직의 감염 이후의 끝 기관 실패를 이끌어 낼 수 있는 오래 된 cytotoxins의 생산에 결과 가설 되었습니다. 생체 외에서 분석 실험 폐 감염 시 cytotoxins 생산 가설 테스트를 개발 했습니다. 고립 된 쥐 폐 동맥 내 피 세포 및 박테리아 녹 농 균 모델 시스템으로 사용 되 고 cytoxins 내 피 세포의 감염 박테리아에 의해 다음의 생산 세포 배양 뒤를 사용 하 여 설명 된다 젖 산 효소 분석 실험 및 ImageJ 기술을 활용 하 여 새로운 미세한 메서드를 사용 하 여 직접 정량. 이러한 cytotoxins의 녹말 체 자연 및 immunoblotting 및 A11 안티 아 밀 로이드 항 체를 사용 하 여 immunodepletion thioflavin T 바인딩 분석 실험에 의해 입증 되었다. Immunoblotting를 사용 하 여 추가 분석 oligomeric 타우와 Aβ 생산 했 고 피 녹 농 균에 의해 감염에 따라 내 피 세포에 의해 발표는 설명 했다. 이러한 방법은 인간의 임상 샘플의 분석에 쉽게 적응할 수 있어야 합니다.

간단한 생체 외에서 시험 셀 박테리아 P. 녹 농 균감염의 supernatants에 cytotoxins의 존재에 대 한 분석 결과를 개발 되었습니다. 기본적으로, 감염 된 세포에서 배양 후 세균 또한 4 h 수집, 박테리아의 표면에 뜨는, 문화 살 균 필터에 의해 제거 되 고 살 균 상쾌한 셀의 새로운 인구에 추가 됩니다. 셀은 다음 상쾌한의 추가 후에 21-24 h를 관찰 하 고 셀 죽이 정량.
PMVECs의 confluent 레이어에 P. 녹 농 균 의 추가 셀 사이 간격의 형성을 유도합니다. Vivo에서, 갭 형성 폐부종과 폐 기능 감소에 지도 한다. 분석 결과 설명된에서 갭 형성은 사용 시간-포인트 심사에 대 한 셀 문화 supernatants PA103 가진 외피의 충분 한 기간으로 cytotoxin 릴리스에 대 한 격차에 표시 된 대로 셀 단층에서 양식을 시작 하는의 존재에 의해 표시 됩니다. 그림 1. ΔPcrV 박테리아는 이러한 보육 조건 셀 간격을 유도 하지 마십시오. 간격 감지 되는 상쾌한입니다 수집, 필터 살 균, 그리고 순진한 세포 독성 활동을 평가 하기 위해 PMVECs에 추가 됩니다. 그들의 각각 supernatants에 PMVECs 다음는 21-24 h에 대 한 인큐베이터에 배치 하 고 관찰 하 고 촬영. 그림 2에서 같이 상쾌한 피 농 균 긴장 PA103 감염 됐다 PMVECs에서 cytotoxins는 상쾌한의 추가 후에 21 h에 의해 경작 된 세포의 죽음을 유도 하는 포함. 대조적으로, 아무 세포 죽음 치료 어느 HBSS 중간 이나 상쾌한 녹의 ΔPcrV 변형에서 수집 하는 컨트롤 셀에서 관찰 되었다. Immunoblot 분석 시연 아니 amyloids PMVECs (그림 2)의 접종을 다음 ΔPcrV 긴장에 의해 생성 하는 동안 oligomeric 타우 등 Aβ, 녹말 체 분자 PA103 긴장으로 감염 시 생성 됩니다. 이 분석 결과에서 cytotoxins로 amyloids의 역할은 경작된 한 세포12추가 이전 상쾌한에서 amyloids의 immunodepletion에 의해 확인 됐다. 여기에 표시 되지, 비록 완전히 A11 안티 아 밀 로이드 항 체와 T22 안티 타우 올리고 머 항 체를 사용 하 여 세포 독성 상쾌한의 immunodepletion depletes supernatants PA103 감염 (Balczon 외. 2017 다음 생산에서 세포 독성 활동 12 그리고 Balczon 그 외 여러분, 준비에서).
셀 죽의 정량화의 소설 싸고 간단한 방법을 개발 했습니다. 이 분석 결과 대 한 ImageJ 소프트웨어 부족 셀 (셀 살인의 지표) 현미경 분야에서 분야의 직접 측정을 허용 하는 적응 하고있다. 이 방법의 신뢰성 측정 LDH 릴리스 셀에서, 셀의 잘 설립 방법에 직접적인 비교에 의해 확인 되었습니다. 그림 3에서 보듯이 미세한 필드의 흰색 셀을 포함 하는 지역과 부족 검정 셀 영역 변환 ImageJ 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 다음, 검정 흰색 영역의 간단한 비율 측정 셀 살인을 사용할 수 있습니다. 시작 셀 confluent 단층으로, 현미경 분야의 모든 영역을 흰색입니다. 그러나, cytotoxins를 포함 하는 supernatants의 추가 후에 18 h, 격차는 단층에 검출 될 수 있습니다. 세포 세포 독성 상쾌한의 36 h 후 추가까지 다음 선형 방식으로 증가 없는 문화 접시의 크기입니다. LDH 릴리스를 측정 하면 세포 독성 상쾌한의 추가 후에 18 h에서 처음 발견 되는 LDH 출시와 함께 동일한 결과 얻은 했다. LDH 릴리스는 다음 선형 방식으로 증가 최대 셀 죽이 상쾌한의 추가 후 36 h에서 측정 했다 때까지. 작은 세포 죽음 셀 ΔPcrV 주사 셀 (그림 3)에서 수집 하는 상쾌한 치료 또는 문화 HBSS 36 h에 대 한 치료를 측정 했다.
박테리아로 치료 하는 세포에서 출시 하는 아 밀 로이드의 금액 ThT 형광을 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 바인딩을 ThT amyloids의 형광 강도 증가 분자에 구조적 변화를 발생합니다. 이 분석 결과 대 한 thioflavin T는 베트에 추가 하 고 초기 형광 측정 된다. 샘플의 작은 약 수를 추가 하는 동안에 다음 형광 녹음 중지 됩니다. 다음은 베트는 fluorimeter에 반환 이며 변경 형광 방출 기록 됩니다. 그림 4에서처럼 상쾌한 PA103 긴장의 P. 농 균 포함 된 아 밀 로이드 형광 방출의 증가 의해 표시 된 대로 incubated 했다 셀에서 수집. 대조적으로, ΔPcrV 긴장으로 주사 PMVECs에서 상쾌한 증가 형광의 부재에 표시 된 대로 amyloids, 부족.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig1.jpg"> 그림 1입니다. PMVEC 형태학에 피 녹 농 균 inolculation의 효과. (A) 와 피 녹 농 균의 PA103 스트레인의 추가 (B) 후 4 시간 전에 PMVECs의 confluent 단층. 격차는 감염 된 세포에 세포 단층에 명확 하 게 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 100 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57447/57447fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig2.jpg"> 그림 2입니다. 세포 독성 supernatants의 분석. [I] 부분입니다. 제어 및 치료 세포의 대표 이미지입니다. PMVECs 21 h 상쾌한 세포 어느 게 PA103 박테리아 스트레인 또는 (B) ΔPcrV (C)와 주사에서 얻은 함께 치료 했다. 제어 셀 또한 HBSS 버퍼 (A)와 함께 21 h에 대 한 인 큐베이 팅 했다. 눈금 막대 = 100 µ m. [2] 부. ΔPcrV (A) 또는 PA103 supernatants의 대표 immunoblots 수집 (B) PMVECs 감염. 오 점 아 밀 로이드 (A11) 또는 oligomeric 타우 (T22)에 대 한 항 체를 조사 했다. KDa에 Mr . <a href="/files/ftp_upload/57447/57447fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig3.jpg"> 그림 3입니다. 셀 죽의 정량. (A) 다른 시간 지점에서 (표면에 뜨는 추가 후 h) 필드의 어느 지역에 포함 하 고 셀 부족 했다 흰색 또는 검은색, 각각 사용 하 여 변환 ImageJ 소프트웨어 대표 현미경 필드. 같은 위상 대비 이미지 변환도 표시 하기 전에. 바 = 100 µ m. (B) 표준 LDH 자료 분석 결과 및 ImageJ 분석 결과 사용 하 여 죽이 세포의 정량의 비교. N = 4, * *p < 0.05, * * *p < 0.01. <a href="/files/ftp_upload/57447/57447fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig4v2.jpg"> 그림 4입니다. 대표 ThT 형광 분석 결과 데이터. ThT를 포함 하는 빈 큐 벳 흥분 했다 425 nm 그리고 방출 형광 482에서 측정 했다 nm. 배경 형광 20 s, 그리고 상쾌한에서 어느 PA103-또는 ΔPcrV-주사 PMVECs는 큐 벳에 추가 되었습니다 수집 했다. 형광 방출 다음 40 초 기록 했다.

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Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

간단한 방법은 다음 폐 피 내 막의 감염 세포 독성 amyloids의 생산 위한 녹 농 균에 의해 설명 되어 있습니다.

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

5.5K 조회수.  University of South Alabama. 간단한 방법은 다음 폐 피 내 막의 감염 세포 독성 amyloids의 생산 위한 녹 농 균에 의해 설명 되어 있습니다.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

선정 Plasmodium falciparum</em인간 두뇌 내피 세포 Cytoadhesion위한> 기생충

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

슈도모나스 녹농균의 작은 식민지 변형의 문화와 알긴산의 정량화

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...