저자는이 연구에 사용 된 인간의 표본에 대 한 기증자, RCWIH BioBank 마운트 시 나이 병원/UHN 산부인과 부서 및 산부인과 감사 하 고 싶습니다. 우리는 잿 물 실험실, 특히 그녀의 방법 개발에 대 한 박사 캐롤라인 덩크의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 버로우즈 환영 기금 (부여 #1013759)에 의해 지원 됩니다.

Placentae 선택 제왕 섹션을 겪고 노동 여성에 건강 한 용어에서 수집 됩니다. 수집, 처리, 그리고 인간의 샘플의 일회용 마운트 시 나이 병원 윤리 위원회의 지침을 준수 합니다. 서 면된 동의 각 환자에 게 서 얻어진 다. 이 연구는 마운트 시 나이 병원에서 연구 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다.
1입니다. 준비
참고: 모든 단계 증기 두건에서 실시 되어야 하 고 모든 수술 장비 통해 압력솥 증기 두건에 배치 하기 전에 소독 해야 합니다. (병, 50 mL 튜브, 등) 다른 모든 자료는 70% 에탄올 용액으로 살 균 해야 합니다. 항상 착용 개인 보호 장비에 항상 유해 쓰레기 (연구실 코트, 장갑, 긴 머리를 다시 묶어, 등)와 함께 작업 하는 경우.
<ol><li>
효소 소화 솔루션 (최종 솔루션: 200 mL)
	<ol>
<li>플라스틱의 HBSS-180 mL / 500 mL 비 커에 살 균 감동적인 자석을 추가 하 고 플레이트 실 온에서 교 반에-.</li>
		<li>밖으로 무게 추가 하 고 다음 HBSS/솔루션에 천천히 순차적으로: 20 mL FBS, 400 mg 콜라 2 ([최종] = 2 mg/mL), 20 mg 간장 콩 트립 신 억제제 ([최종] = 0.1 mg/mL), 30 mg DNase 1 ([최종] = 0.15 mg/mL), 및 200mg BSA ([최종] = 1 mg/mL)</li>
		<li>감동 중간 속도를 설정 하 고 10-20 분 (교 반 하면서 주석 포 일 또는 파라핀 필름 커버) 파문 혼합물 허용.</li>
		<li>플라스틱 퍼 널을 사용 하 여 250 mL 유리 병에 혼합된 솔루션을 부 어 하 고 증기 두건에.</li>
		<li>플라스틱 가기 여과 장치 (0.22 μ m 멤브레인 필터, 500 mL), aliquot 20 mL 50 mL 튜브 (총 10 관) 및 사용까지-20 ° C에서 저장소를 통해 솔루션을 전달 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RPMI 1640 미디어 (세척 솔루션 및 10% 완전 한 성장 매체는 2%)
	<ol>
<li>RPMI 1640와 FBS 증기 두건에서 유리 병에 결합 합니다.</li>
		<li>2 %FBS 솔루션, 490 mL와 10 mL FBS RPMI 1640의 결합.</li>
		<li>10 %FBS 솔루션 RPMI 1640 450 mL 및 50 mL FBS 결합 하 여.</li>
		<li>Normocin의 500 μ RPMI 미디어와 FBS (50 mg/mL 재고, 0.05 mg/mL 작업 농도)를 포함 하는 이전 단계에서 500 mL 유리병에 플라스틱.</li>
		<li>사용까지 4 ° C에서 500 mL 유리병에는 0.22 μ m 멤브레인 필터 및 저장소를 통해 미디어를 전달 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험을 시작 하기 전에 30 분 배치의 약 20 mL 수 37 ° C 비드 욕조에 효소 소화 솔루션 냉동, 2 %FBS 37 ° C 비드 욕조에 10% FBS RPMI 1640 미디어 락 물 목욕 설정 하 고 37 ° C로 설정 2 세대, 그리고 설정 4 ° c 온도 제어 원심 분리기</li>
</ol>2. Decidual 조직 용어 Placental 세포 막에서의 수집
<ol><li>HBSS 병 장소 + +, HBSS-/-5 50 mL 튜브 랙 연기 후드 아래에. HBSS 25 mL를 플라스틱 + + 1 개의 관에.</li>
	<li>
Gloved 손을 사용 하 여, 꺼내 용어 태 반 수술 실 극장에서 수송을 위해 사용 하는 컨테이너에서. 기저귀 패드 (어머니 쪽)에 태를 놓고 태아 막이 위와 집게를 사용 하 여 밖으로 확산.
	<ol>
<li>증기 두건에 겹치는 기저귀 패드를 하다.</li>
		<li>별도 기저귀를 사용 하 여 그래서 어머니 쪽 얼굴 태를 플립.</li>
		<li>고 막 파열의 지점을 찾아 전개 하 여 fumehood 표면에 평평 하다 막 수 있도록 절 개. 참고: 막 태에서 철수는, 일단은 decidua 얼굴 뒤에 amnion 레이어와 chorion 레이어에 휴식 될 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chorion 25 mL HBSS 포함 50 mL 튜브에 장소에서 decidual 조직을 긁어 신중 하 게 플라스틱 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 + +.</li>
	<li>적당 한 압력으로 멤브레인을 다쳤어요. 그것은 chorion 오염 발생할 수 있습니다 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다. 뿐만 아니라, 일부 decidual 셀을 포함 하는 이러한 작은 혈전을 수집 합니다. 주의: decidual 컬렉션 후 태 고 해야 합니다 생물 플라스틱 상자에 포장 (제도적 규칙)에 따라 적절 한 처리 하기 전에-20 ° C 냉동 고에 얼. 피 묻은 기저귀 패드 인감 꽉 비닐 봉투에 포장 하 고 생물 안전 상자에서 삭제 해야 합니다.</li>
</ol>3. 세탁기 및 효소 소화 Decidual 조직의
<ol><li>부드럽게 손으로 50 mL 튜브를 흔들어 하 메 마른 견본 (소변) 컨테이너에 휴식 250 μ m 금속 체 (250 μ m, 크기 60 메쉬)를 통해 전달 하 여 수집 된 조직 세척.</li>
	<li>HBSS로 두 번 세척을 반복 + +와 두 번 HBSS-/-각 세척에 대 한 신선한 튜브에. (최종 HBSS-세척 /-칼슘과 마그네슘 HBSS에 존재의 제거에 대 한 수 있습니다 + +는 그렇지 않으면 다음 효소 소화 과정을 방해). 참고입니다. 세척 단계 동안 chorion 조직 오염 decidual 조직 색상에 핑크 빛과 chorion 동안 비정 질 이며 백색, 밀도, 힘 줄은 명백한 될 것입니다. 따라서, chorion 오염 집게와 함께 쉽게 제거할 수 있습니다.</li>
	<li>필요에 따라 decidual 조직이 두꺼운 경우 무 균 10 cm 직경 페 트리 접시에 그것을 전송 하 고 접시에 두 개의 반대 scalpels와 조직의 말하다 계속 합니다.</li>
	<li>
효소 소화 솔루션의 조직/mL의 100 mg을 포함 하는 살 균 50 mL 튜브에 씻어 조직 배치 (준비 참조).
	<ol>
<li>참조 점으로 decidual 조직의 수준 50 mL 튜브에 5-10 mL 마크에 도달 하면 확인 합니다.</li>
		<li>효소 소화 솔루션 (단계 1.1에서에서 Prepared)의 약 20 mL를 사용 하 여 전체 기간 태아 막에서 수집한 총 decidua 소화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파라핀 영화와 튜브의 뚜껑을 봉인 (튜브를 단단히 밀봉 하 고 포장 모자와 튜브의 상단 주위 파라핀 필름) 문화에서 후드를 떨고 물 목욕 (145 rpm에서에서 20 분 동안 37 ° C에서 decidual 조직을 품 어 2 세대).</li>
	<li>부 화, 후 파라핀 필름을 제거 하 고 소화 조직 70% 에탄올을 포함 하는 튜브의 표면 소독 연기 후드 아래. 짧게 손으로 튜브 흔들.</li>
	<li>새로운 살 균 견본 콘테이너로 금속 체 (250 μ m, 크기 60 메쉬)을 통해 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 효소 반응을 중지 RPMI + 10 %FBS 포함 0.1 %normocin 동등한 볼륨 (20 mL)와 희석. 원심 분리 단계 4.1 직접 진행 합니다.</li>
	<li>필요한 경우, 나머지 소화 되지 않은 조직 20 mL 신선한 효소 소화 솔루션의 새로운 50 mL 튜브에 다시 놓고 소화 (20 분, 물 목욕을 떨고 37 ° C)를 반복 합니다.</li>
	<li>두 번째 소화 필요한 경우 얼음 (무 균 유지 파라핀 필름 커버)에 셀 서 스 펜 션 첫 번째 튜브를 놓습니다. 3.5-3.6 단계를 반복 하 고 두 셀 정지를 결합.</li>
</ol>4. 단일 셀 서 스 펜 션 생성
<ol><li>세포 현 탁 액 (420 g, 4 ° C, 11 분) 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 resuspend RPMI + 2 %FBS 포함 0.1 %normocin ("워시 버퍼") 40 mL에 셀. 참고: 셀 펠 릿 느슨한 하 고 붉은 혈액 세포 오염 때문 젤라틴, 발음 주의 상쾌한 것입니다. 수동 피 펫을 상위 단계의 제거 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>11 분 4 ° C에서 420 g에서 원심 분리를 반복 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 (참고 단계 4.2 했 듯이)는 상쾌한을 제거 하 고 워시 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend 같은 튜브에 35 mL의 적혈구 세포의 용 해 버퍼를 추가. 참고: 펠 릿이 크거나 매우 살 벌 한, 그것은 수 분할 적혈구 세포 단계에 대 한 두 개의 튜브로 추가 하 여 워시 버퍼의 10 mL를 추가 하 고 두 개의 튜브를 똑같이 나누어 적혈구 세포의 용 해 버퍼의 35 mL 각 튜브를.</li>
	<li>20 분 시작 하 고 붉은 혈액 세포를 lyse에 외피의 끝에 짧게 소용돌이 tube(s)에 대 한 얼음에 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에 11 분 420 g에서 원심</li>
	<li>신중 하 게, 제거는 상쾌한 고 워시 버퍼의 40 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>세포 세포 덩어리를 제거 하는 70 μ m 나일론 필터를 통해 전달 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 11 분 420 g에서 원심 분리기</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 완전 한 매체의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend (RPMI 10% + 0.1 %normocin 포함 하는 FBS).</li>
	<li>
Trypan 파랑 염료-제외 hemocytometer 절차 아래에 설명된대로 사용 하 여 셀의 개수:
	<ol>
<li>문화 후드 부드럽게 trypan 블루와 결합 하기 전에 철저 하 게 혼합 하기 위하여 세포 현 탁 액 3 배 아래로 플라스틱. 1.5 ml에서 튜브 준비 세포 현 탁 액, 1:2 (trypan 블루 솔루션의 결합 20 μ)과 20 μ decidual 세포 현 탁 액의 희석. 조심 스럽게 몇 번 (이 솔루션은 불 임) 위아래로 pipetting으로 trypan 블루 셀 솔루션을 혼합.</li>
		<li>위에 유리 coverslip와 현미경의 스테이지는 hemocytometer를 놓습니다. 참고: Hemocytometer 트리플 라인에 의해 분할의 큰 사각형 9 개에 게 그것에 격자와 현미경 슬라이드입니다. 각 큰 광장 1 m m2의 면적을가지고 그리고 챔버에 액체의 깊이 0.1 m m. 따라서, 각 큰 사각형을 채울 수 있는 액체의 볼륨은 1mm * 1mm * 0.1 m m = 0.1 m m3= 10-4 mL.</li>
		<li>천천히 전체 슬라이드 (정지 전에 혼합 잘 채우고) 동안 셀 혼합 분산을 모 세관 행동을 수 있도록 hemocytometer의 홈으로 trypan 블루 셀 혼합물의 10 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>(10 배 확대)에서 현미경으로 세포를 확인 하 고 trypan 블루 (이들은 실행 가능한 세포)는 hemocytometer의 4 개의 큰 외부 사각형에 제외 된 모든 화이트/그린 셀. 라인을 터치 하는 셀을 계산 하는 경우 그 터치 오른쪽 및 위쪽 라인 하지만 왼쪽 및 아래쪽 라인을 만지고 그 들만 계산 합니다. 어두운 파란색 셀;를 계산 하지 않음 파란색 셀이 죽은 trypan blue 염료 관통할 수 있다 쉽게 플라즈마 세포 막을 통해 세포질으로 나타냅니다.</li>
		<li>세포 현 탁 액 (X)의 1 mL에 가능한 셀의 수 계산: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg"> 2 = 희석 비율 10000 변환 계수 = (1 mL = 1 c m3 = 10, 000 * 0.1 m m3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Decidual 셀 RPMI + 10%에서 바람직한 최종 농도를 희석 FBS (성장 매체). 참고: 조직 문화 도금, 플라스틱 2 * 106 셀/잘 플라스틱 6 잘 플레이트, 10 cm 플라스틱 격판덮개로 10 * 106 세포 또는 유리 coverslip 75000 셀.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells.">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li><li>Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Decidualization and relevance to menstruation. , 187-212 (1990).</li><li>Kariya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+inhibits+in+vitro+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).</li><li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).</li><li>Wu, W. -. X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+decidualization+and+prolactin+mRNA+and+production+at+different+stages+of+human+pregnancy.">The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy.</a> Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).</li><li>Bell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+secretion+of+protein+by+the+endometrium+and+decidua.">Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua.</a> Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).</li><li>Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+natural+killer+cells:+key+regulators+of+placental+development.">Decidual natural killer cells: key regulators of placental development.</a> Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).</li><li>Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytosis+and+monocytic+infiltration+of+decidua+in+early+pregnancy.">Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy.</a> Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).</li><li>Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+colony-+stimulating+factor-1+in+the+human+uterus+and+placenta.">Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).</li><li>Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cachectin/tumor+necrosis+factor-alpha+formation+in+human+decidua.+Potential+role+of+cytokines+in+infection-induced+preterm+labor.">Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor.</a> Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).</li><li>Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+lymphocyte+alloreactivity+by+early+gestational+human+decidua.+II.+Characterization+of+the+suppressor+mechanisms.">Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms.</a> Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).</li><li>Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infiltration+of+myeloid+cells+into+decidua+is+a+critical+early+event+in+the+labour+cascade+and+post-partum+uterine+remodelling.">Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).</li><li>Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+pro-inflammatory+cytokine+expression+in+human+fetal+membranes,+decidua,+cervix+and+myometrium+before+and+during+labour+at+term.">Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term.</a> Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).</li><li>Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+maternal+leukocytes+are+activated+in+response+to+cytokines+secreted+by+uterine+tissues+of+pregnant+women.">Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women.</a> Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).</li><li>Hamilton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+infiltrate+the+human+and+rat+decidua+during+term+and+preterm+labor:+evidence+that+decidual+inflammation+precedes+labor.">Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor.</a> Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).</li><li>Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+infection-induced+preterm+labour.">Cytokines and infection-induced preterm labour.</a> Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).</li><li>Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+leukocyte+traffic+and+activation+in+parturition.">The role of leukocyte traffic and activation in parturition.</a> Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).</li><li>Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+in+term+and+preterm+labor.">Immune cells in term and preterm labor.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).</li><li>Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+leukocytes+from+the+human+maternal-fetal+interface.">Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).</li><li>Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+of+cells+from+the+human+fetal-maternal+interface.">Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface.</a> Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).</li><li>Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+establishing+primary+human+endometrial+stromal+cells+from+hysterectomy+specimens.">Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens.</a> Journal of Visualized experiments. 87, (2014).</li><li>Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+mesenchymal+stem/stromal+cells+derived+from+human+placenta+tissue.">Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue.</a> Journal of Visualized experiments. 112, (2016).</li><li>De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+endometrial+epithelial+and+stromal+cells+for+in+vitro+decidualization.">Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization.</a> Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).</li><li>Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+and+activation+status+of+maternal+and+peripheral+blood+leukocytes+during+pregnancy+and+labour,+both+term+and+preterm.">Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).</li></ol>

저자 공개할 게 없다

여기에 설명 된 프로토콜은 비용은 매우 간단 하 기본 decidual 세포를 고립 시키기를 위한 효과적인 방법 전체 인간의 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 이 프로토콜의 성공은 두 가지 중요 한 요소, (1) 태아 막 및 (2) 치료는 decidual 세포 프로토콜 통해 처리의 chorion 계층에서 근 근이 살아가고 decidual의 효율에 따라 달라 집니다. 그것은 중요 한 chorion 조직 오염 보장 하 여 아무도 실수로 포함 decidual 된다고 하는 동안 및 식별 하 고 제거 하는 세척 단계 (decidua 및 chorion 형태학에 차이 중 어떤 오염 든 지에 의해 제어 됩니다. 수 수는 decidua와 실수로 수집 될 수 있습니다 있는 chorion의 쉬운 제거를 위한). Decidual 셀은 깨지기 따라서 빠르고 빈번한 pipetting 감소 가능성에 발생할 수 있습니다. 좋습니다, 그럼, 피 펫 배출 속도 설정을 느린 유지 한다 고 최소 pipetting 셀 때 사용 되어야 한다.
이 프로토콜 trophoblast 오염을 방지 하는 방법 중 하나는 전적으로 태 반 (decidua parietalis 함유)의 태아 세포 막에서 decidua을 모아서, 제외 biopsies을 취 함으로써 이루어집니다 decidua basalis의 컬렉션 태 반의의 모성 측. 따라서, 우리의 현재 프로토콜 우리가 분리 decidual 세포 인구의 순도 향상, 하는 동안 그것은 decidua (즉 decidua basalis)는 decidua의이 부분을 대상으로 하는 연구에 대 한 제한 사항으로 제기할 수 있는의 섹션 제외지 않습니다 또는 때 모두 섹션에 decidua의가 필요 합니다. 이 제외는이 연구의 가장 큰 한계를 구성 되어 있습니다. 또한, 인간 환자에서 decidual 세포를 분리 하는 동안 수 있습니다 decidual에 대 한 더 많은 생물학 관련 통찰력 임신 연구, 적은 조작 및 적은 기간 공부 될 수 있다 윤리적인 이유로 설치류 기반 연구에 비해.
이 프로토콜을 통해 어려움을 만들 증명할 수 있는 단계는 제대로 5 월을 완화 하는 경우 셀 생산량 및 생존 능력에 영향을 미칠. 이 일주, 수정 할 필요가 있습니다. 가장 중요 한 태아 막의 decidual 된다고 하는 것이 충분 한 (단계 2.4); 인지 확인 하는 것입니다. 인간의 다양성으로 인해 각 태 반 조직의 일관성 decidual 조직과 조직의 건조의 레벨의 양 측면에서 달라질 수 있습니다. 그것은 변조 decidua만 제거 되도록 된다고 하는 것이 중요입니다. Decidua 고 막이 건조, PBS/수 수 있도록 쉽게 된다고 막에 부 어. 두 번째 단계는 decidual 세포 현 탁 액 (3.4 단계)의 적혈구 세포 이다. 언급 했 듯이, 셀 펠 릿 매우 큰 이며 혈액의 높은 금액을 포함 하는 경우, 펠 릿은 lysing의 효율성을 개선 하기 위해 2 개의 관으로 나눌 수 있습니다. 아직이 단계 후에 적혈구는 최대 효율을 위한 더 튜브 펠 릿을 나눌 필요가 있을 수 있습니다.
동안 다른 decidual 격리 프로토콜 용어 태 반 및 hysterectomies를 받고 비 임신 여성에서 자궁내 막 세포의 고립에서 이전에 게시18,19, 이러한 방법은 다양 한 해결 하지 않습니다. 제한, 낮은 세포 생존 능력 등 인접 조직 오염. 우리 고려 이러한 경계 여기, 프로토콜을 설계할 때 더 큰 셀 생산량에 이르게 생존 능력을 증가 하 고 주위 조직에서 오염의 위험을 감소. 이전에, 자동 dissociations decidual 조직19,20뜨 기계적으로 사용 되었습니다. 이 방법은 상대적으로 가혹한 결과 그것은 신속 하 게 뜨 조직가 위를 회전 하 여 믹서 기에 유사 하 게 작용 하는 기계에 삽입 튜브에서 decidual 조직 수집 활발 한 기계적 분리를 포함 감소 세포 생존 능력입니다. 여기 설명 하는 우리의 새로운 방법을 행동 하는 조직에 적용 되는 기계적 힘 대신 부드러운 락 물 목욕 움직임과 함께 효소 소화는 짧은 (20 분)를 결합 합니다. 효소 소화 솔루션은 세포 생존 능력 및 수율, decidual 조직;의 기질을 소화 (1) 콜라를 포함 하도록 (콜라;의 나머지 trypsinolytic 활동으로 인해 일반적인 소화를 방지 하기 위해 콩 트립 신 억제제 2) (3) DNase 부동성 DNA (4) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 오버 소화에서 세포를 보호 하기 위해 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 단백질 제거를 1. 이전 연구의 두 번째 주요 한계는 사실에 있는 decidua basalis trophoblastic 오염에서 잠재적으로 발생할 수 있습니다는 태 반의의 모성 쪽의 상위 레이어를 절단 하 여 수집 된. 우리의 새로운 프로토콜 격리 decidua parietalis는 decidua 부드럽게 된다고 하 여 태아 막 (chorion) 끄고 chorion 오염 세척 단계 동안 쉽게 제거할 수 있습니다.
따라서, 우리의 메서드를 사용 하면 기본 decidual 셀의 단순한 격리 placental 세포 막에서 (전체 프로세스는 약 3 시간 소요) 시간의 짧은 기간에 높은 셀 생산량 및 우수한 세포 생존 능력의 결과로. Decidual 세포 격리 되 면 그들은 사용할 수 있습니다 다양 한 실험; 예를 들어, 인간의 기본 decidual 셀 immunocytochemical 분석에 대 한 coverslips에 시드할 수 있습니다, 그들은 수 다양 한 트리 트 먼 트 및 조작, 문화에서 성장 뿐만 아니라 수 직접 얼룩진 다 색 흐름 cytometry 분석 평가 하는 다른 셀 부분 모집단의 역할을 이해 하는 시도에 임신 합병증과 인간의 decidua의 구성. 여기에 제시 된 방법 용어 태 반 (인간 임신의 세 번째 3 개월의 끝)에서 세포를 분리 하는 데 사용 했다,이 프로토콜도 쉽게 적용할 수 있습니다 첫 번째 및 두 번째 임신 태 반 임신 단계의 유연성에 대 한 허용 그의 연구는 해결 됩니다.
이전 게시 프로토콜 자동 dissociations 떨어져 decidual 조직 또는 효소 소화 혼자21,22휴식을 사용. 결합 하 여 부드러운 기계적인 힘 (37 ° C에 물 목욕 락) 칵테일 효소 소화 소화와 세포 생존 능력을 최적화 하도록 설계 되었습니다 뿐만 아니라, 위에서 설명한 프로토콜 셀 생산량과 생존 사이 이상적인 균형을 만듭니다. 또한, 이전 프로토콜 요약 셀 수확량 그들의 격리와만 현재 셀 생존 비율19에서 얻은 언급 못했다. 여기 우리가 decidual 셀 셀 (태 반 당 10-20 백만에서 배열 하는) 계산을 통해 결정의 높은 수익률을 보여줍니다. 또한, 현재 간행물 쥐;에서 기본 decidual/자궁내 막 세포의 절연을 보여 줍니다. 우리의 프로토콜 인간의 조직, 세포 실험23의 더 생물학적으로 관련 소스 렌더링의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜도 쉽게 적용할 수 있습니다 첫 번째 고 그 하나는 임신 단계 연구의 유연성에 대 한 수 있도록 두 번째 임신 태 주소입니다. 일단 세포 격리 되어, 그들은 사용할 수 있습니다 다양 한 immunocytochemistry, cytometry, 단백질 및 RNA 추출, 백혈구 등의 후속 격리 실험 기법에에서 시도에서 다른 세포의 역할을 이해 하 부분 모집단입니다. 실시간 PCR 또는 게놈 넓은 사용 (자간 전 증 또는 preterm 노동) 등 복잡 하 고 건강 한 임신 사이 decidua 관련 연구에서 유전자와 단백질 식에 차이 식별에 도움이 수 있는 소설 대상 제공할 수 있습니다. 진단 및 치료 도구 개발입니다. Decidual 세포, 특히 백혈구, cytometry 사용을 통해 쉽게 확인 될 수 있는의 비율로 변경이 모두 백혈구의 변화와 같은 임신 합병증의 병 인에 대 한 답변을 제공할 수 있습니다 또한 또한, 부분 모집단 비율 뿐만 아니라 기간에 진통24변조 표시 되었습니다 그들의 정품 인증 상태.

가장 적극적인 성인 여성 조직 중 하나 endometrium 난소 호르몬, 에스트로겐 (E2)과 황 체 호르몬 (P4)에 의해 자극에 대 한 응답에서 각 생리 주기를 개장 하는 극적인 겪 습. 일컬어 임신 endometrium decidua P4 기반 차별화 E2 지배 증식 단계 결과로 postovulatory 단계의 끝에 의해 형성 되는 매우 중요 한 생식 조직 이다. Decidual 셀 성공적인 blastocyst 이식 한 태아 이식 모성 관용을 유지 하기 위한 utero placental 인터페이스의 개발을 위한 호르몬 요인의 분 비에 대 한 책임이 있습니다.
Decidualization는 주입 및 후속 decidual 나선형 동맥의 리 모델링 필요 합니다. 자궁내 막 기질 세포 decidualization을, P4 및 캠프, 통제 생리 주기1의 후반 luteal 단계를 겪는 다. 이 프로세스는 주위 혈관 및 개장 하는 맥 관 구조에 규제를 밀매 하는 백혈구의 역할을 제안 하는 기질에 걸쳐 확산 시작 됩니다. 이 세포 변환 원형 형태, 증가 핵 크기 및 거친 바인딩과 그물 및 Golgi 기구2의 확장 특징 이다. Decidualized stromal 세포 paracrine 요인 blastocyst 이식 지원 수 있으며 수많은 호르몬 (즉, prolactin), 신생 성장 인자, 인슐린 성장 인자 의무적인 단백질-1의 분 비에 의해 특징 (IGFBP-1), 스타 글란 딘 (PG) E (세포내 캠프의 자극), cytokines, 세포 외 기질 구성 요소 및 태 반 착상 및 개발3,,45,6에 대 한 필수적인 영양소 .
Decidual 셀 인구 decidualized stromal 세포와 전적으로 이루어진 하지 하지만 또한 큰, 임신 특정 decidual 백혈구 인구를 포함 되어 있습니다. Decidualization 과도 지역화 된 부 종 및 자연적인 살인자 (NK) 세포, T 세포, 수지상 세포, 대 식 세포의 유입을 포함 됩니다. 가장 큰 백혈구 부분 모집단은 자 궁 NK 세포, cytokines의 소스는 decidua 및 신생 요인 decidualization 과정에서 원조 하 고 증가 수 있습니다 침투 모든 모성 백혈구의 약 50-70%를 구성 임신7전체 수입니다. 대 식 세포, 면역 세포의 두 번째로 큰 부분 모집단을 되 고 이식 사이트 발견 하 고 임신8증가. Cytokines의 근원 그리고 성장 요소 (CSF-1)9, 종양 괴 사 인자 α (TNFα)10 및 스타 글란 딘을 자극 하는 식민지 같은 요인 (PG) E11.
임신, 내내 그리고 기간 노동 전에 decidua cytokines 및 발산 모성 주변 백혈구 활성화 및 노동 시작 자 궁 조직으로 마이그레이션하기에 대 한 책임의 주요 원천이 다. 동물 연구를 보여주는 수많은 프로 염증 성 cytokines 있습니다 마우스 decidua에 최대 통제 노동, 동안와 같은 TNF-, 일리노이-6, 일리노이-12, IL-1b12. 인간의 decidua에서 프로 염증 성 cytokines 일리노이-1b, 일리노이-6와 IL-8 (주요 호 중구 chemoattractant) 노동13에 비해 노동 하는 동안 더 높은 식 전시. 이러한 decidual 조직14;으로 활성화 및 백혈구의 유입에서 cytokines 결과 분 비 myometrial 4-fold, 가 두 인접 한 자 궁 조직 사이 활성화의 나타내는 더 큰 앞 decidual 침투 기간 노동, 동안 decidual 대 식 세포와 두 인간 호 중구 침투와 쥐에서 증가 볼 15. 백혈구 침투 이러한 PGs myometrium16의 동기 수축 활성화의 생산, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs) 막 시작17,18, 파열 뿐만 아니라 증폭 자 궁 활성화 과정 ('cytokine 폭풍우') 프로 염증 성 cytokines.
Decidual 세포 이식 과정, 초기 임신 기간에 노동의 활성화에 참여 하는 고에 산 모-신생아 공차를 유지에 중요 한 역할을 하는 등의 많은 중요 한 기능으로 인해 다른 병 리 중 발생할 수 있는 임신입니다. 예를 들어, 회귀 이식 실패와 반복 임신 손실 (1) 불 임; decidual 성숙의 오류 로부터 발생할 수 있습니다. (2) 자궁내 성장 금지 (IUGR)과 부적 절 한 개발 및 부전 decidua/태 반 또는; decidual myometrial에 손상 된 혈관 변환의 자간 전 증 (3) 조산 뿐만 아니라 있는 조기 decidual 활성화에서 발생할 수 있습니다.
이러한 주요 질환, 인간 생체 내에 연구의 윤리적이 고 실질적인 제한 함께 비추어 이해의 목적으로 생체 외에서 분석을 위해 필수적 이다 기본 인간 decidual 세포 라인을 설립 하 고 임신 합병증의 임상 관리를 개선. 따라서, 우리의 연구의 목적은 높은 셀 생산량 및 생존 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집 된 인간의 기본 decidual 셀의 격리에 대 한 허용 하는 프로토콜을 개발 했다. 이 현재 프로토콜 명확 하 게 설명 합니다 시간 및 비용 effective 메서드는 세포 decidual의 특정 하위의 분리에 대 한 생체 외에서 분석의 다양 한 사용 될. 풍부의 특성화 및 기간과 비교를 첫 번째 또는 두 번째 임신에서 decidual 부분 모집단의 표현 형 인간의 임신 기간 내내 그들의 역할을 정의 하는 데 중요 하다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution with calcium and magnesium</td>
			<td>Prepared in facility (LTRI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution without calcium and magnesium</td>
			<td>Prepared in facility (LTRI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaper pads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>AL Medical</td>
			<td>2018-12-20.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable cell scraper (25 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mm (size 60 mesh) metal sieve</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1020-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel with plastic handle (#21)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-927-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon filter (70 mm)</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin (50mg/ mL)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy bean trypsin inhibitor, powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9003-250mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEA software</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated Vimentin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC2105A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC H7-conjugated CD45 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>641399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated Cytokeratin antibody</td>
			<td>MACs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-47941PCP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor450 Fixable Viability dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65-0863-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-7558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 primary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin primary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 7 primary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 secondary antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary human decidual cells from the fetal membranes of term placentae

Decidua, 일컬어 임신 endometrium, 비판적으로 중요 한 생식 조직 이다. Decidualized stromal 세포와 면역 세포의 주로 구성 decidual 세포는 호르몬 및 염증 성 요소는 성공적인 blastocyst 주입, placental 개발에 대 한 중요 한 역할의 분 비에 대 한 책임은 용어 및 preterm 노동의 개시입니다. 많은 임신 합병증은 다른 세포 인구 decidua 구성의 정밀한 균형의 물결에서 발생할 수 있습니다. 특정 decidual 세포 유형의 비율 변경 수 있습니다 이러한 중요 한 프로세스를 방해 하 고 배아 이식 실패, 자궁내 성장 제한, 자간 전 증 임신의 심각한 합병증 개발의 위험을 증가 하 고 preterm 노동입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 비용 및 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 효과적인 방법 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 결합 하 여 효소 소화와 부드러운 기계적 장애 decidual 조직, 고수익 decidual 셀 chorion 오염 거의 없이 함께 얻은 것입니다. 중요 한 것은, 격리 decidual 셀 특징 이었다 (stromal 세포 (55-60%), 백혈구 (35%), trophoblast (0.01%) 세포 또는 상피 (1%)) 유지 높은 생존 능력 (80%)는 멀티 컬러 이미징 흐름 cytometry 분석 결과 의해 확인 되었다. 이 프로토콜에 decidua parietalis 이며 첫 번째 및 두 번째 임신 placentae을 적용할 수 있습니다. 절연, 일단 decidual 세포는 다양 한 임신 합병증에 다른 decidual 셀 부분 모집단의 역할을 이해 하는 것을 목표로 하는 실험적인 응용 프로그램에 대 한 사용할 수 있습니다.

효율성과 격리 된 셀의 유효성을 검사, 그들은 두 가지 방법으로 특징 했다: cytometry와 immunocytochemistry (ICC). 4 세포 인구를 표적으로 했다; 팬 백혈구 마커 CD45 decidual 면역 세포를 식별 하는 데 사용 되었다, cytokeratin 상피/내 피 세포를 감지 하는 데 사용 했다 및 cytokeratin 7 어떤 감지 하는 데 사용 되었다 마지막으로, decidualized stromal 세포 안티 vimentin 항 체에 의해 발견 된 잠재적인 trophoblast (chorion 또는 placental) 오염.
멀티 컬러 이미징 cytometry에 의해 특성화에 대 한 갓 격리 decidual 세포는 세포 생존 능력을 결정 하는 고칠 수 염료와 스테인드 했다. 셀 permeabilized 및 고정, vimentin APC, CD45-APC-H7, cytokeratin FITC와 cytokeratin 7-PerCP를 대상으로 하는 형광 색소 활용 된 마우스 단일 클론 항 체와 얼룩이 옵니다. 항 체 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. 고정 및 스테인드 셀 탠덤 색소의 분리를 방지 하기 위해 이미지 스트림 MK2 이미징 교류 cytometer에서 다음 날 실행 버퍼 얼룩에 하룻밤 4 ° C에서 저장 되었다. 분석은 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. 세포 파편 및 집계 직렬 게이팅 3 순차 기능/마스크 조합 (그림 1A-B)를 사용 하 여 제외 했다. 형광-1 (FMO) 제어 컨트롤 긍정적인 decidual 세포 인구를 식별 하는 데 사용 했다 그리고 단일 얼룩 세포 보상 (그림 2)을 위해 사용 되었다. 최종 점 플롯 4 마커 (그림 2)의 긍정적으로 얼룩진된 세포 인구 80% (그림 1C)의 세포 생존을 보여 줍니다. 그림 1D에 긍정적으로 얼룩진된 셀의 대표 이미지를 볼 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 우리가 발견 인구 주로 stromal 세포 (55-60%), 백혈구 (35%), 상피의 구성 (%1) 또는 trophoblast (0.01%) 세포 (그림 1E). 실험은 세 번 반복 되었다. 이러한 결과 순도 (trophoblast 오염은 chorion에서의 부재) 기본 인간 decidual 세포 수집 및 기간 placentae의 태아 세포 막에서 분리의 높은 생존 확인 합니다.
별도 ICC 실험에서 갓 격리 decidual 셀 유리 coverslips (75, 000 셀/coverslip), 첨부할 수 그리고 문화에서 48 시간 동안에 시드 했다. 미디어 연결 되지 않은 죽은 세포를 제거 하는 24 시간 후 변경 되었습니다. 셀 다음 50% 아세톤-50% 메탄올, 0.02% 비 이온 계면 활성 제와 permeabilized로 고정 하 고 불특정 바인딩 솔루션 차단 된 차단 되었습니다. 셀은 물 들일 다음 마우스 단일 클론 항 체: 안티-CD45 (팬 백혈구 표식), 안티-cytokeratin (상피 세포 마커) 및 안티-cytokeratin 7 (trophoblast 표식), 그리고 염소 안티 vimentin polyclonal 항 체 (stromal 세포 마커). 당나귀 반대로 염소와 당나귀 반대로 마우스 2 차 항 체로 사용 되었다. DAPI는 핵 얼룩에 사용 되었다. 마우스 IgG, 염소 IgG 및 이차 항 체 혼자 부정과 특이성 컨트롤으로 사용 되었다. 이미지 회전 디스크 confocal 현미경에 20 배 확대에서 찍은 사진. 항 체 사용 재료의 테이블에 에서 나열 되 고 대표 이미지는 그림 3에 표시 됩니다. 우리의 시각적인 관찰 나타냅니다 연결 된 기본 decidual 셀의 그 대다수는 vimentin 긍정적인 stromal 세포 (약 95%), 백혈구 (약 1-2%), 상피의 작은 수 (약 1%)와 trophoblast (단일 세포는 세포 인구 검색에 대 한 회계 < 모두의 0.01%). 흐름 cytometric와 ICC 결과 큰 차이점은 cytometry에 의해 감지 CD45 긍정적인 백혈구 인구에서 감소 이다. 이 불일치는 두 실험 실시 했다 하는 방법으로 설명 될 수 있다: 교류 cytometry 분석에서 격리 decidual 셀 즉시 처리 및 스테인드, 의미 백혈구 인구 분석에 포함 되었다. ICC, 총 decidual 셀 서 스 펜 션은 도금와 실질과 상피 세포, 하지만 하지 면역 세포의 첨부 파일을 지 원하는 대부분은 미디어에서 48 시간 동안 경작. 24 시간 후 미디어 변화,이 두 가지 방법으로 제시 하는 결과에 차이 대 한 회계 기간 동안 연결 된 면역 세포 제거 되었습니다. 우리가 복잡 한 임신 특별 한 예방에서 인간의 decidua 하위 인구 백혈구 인구의 실수로 제거를 방지 하기 위해 사용 해야 하는 백혈구를 공부 하는 결론을 내렸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57443/57443fig1.jpg"> 그림 1: 게이팅 decidual 셀 인구 차별에 대 한 전략. (A) 갓 절연된 고정된 decidual 셀 셀 남자, 및 (B) 이후 세포 파편을 제외 하 3 순차 기능/마스크 조합을 사용 하 여 문이 제외 하 문이 처음 했다. (C) 라이브 셀 (핑크 게이트, 총인구의 80%)는 죽은 세포 (블루 문, 전체 인구의 20%)에서 분화 되었다 고칠 수 생존 염료를 사용 하 여. (D) decidual 셀의 대표 이미지 스테인드 생존 마커 및 4 개의 형광 활용 된 항 체 (Ab) (vimentin APC, CD45-APC-H7, cytokeratin FITC와 cytokeratin 7-PerCP). 점선된 눈금 막대 7 μ m을 같습니다. (E) 파편 무료, 라이브 세포 인구를 확인 이러한 마커 decidual 셀 인구 내의 각 셀 형식의 비율을 결정 하기 위해 사용 되었다. 그림 1B 및 1 C, 각 점은 단일 decidual 셀을 나타냅니다. 그림 1A 와 1c, 점 플롯의 색상 범위 셀 밀도, 빨간 기억을 고집적 세포와 파란색 셀의 덜 조밀한 묘사. 여기에 제시 된 데이터 3 생물 복제의 대표 이다. <a href="/files/ftp_upload/57443/57443fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57443/57443fig2.jpg"> 그림 2: 플롯 게이팅 FMO와 함께 인간의 기본 decidual 셀 Representativeflow cytometric 분석. 셀의 대표 컬러 도트 플롯 용어 decidua에서 고립 되 고 (A) vimentin-APC (stromal 세포 마커), (B) CD45-APC-H7 (백혈구 표식), (C) cytokeratin FITC (상피 세포 마커)와 (D) 스테인드 cytokeratin 7-PerCP (trophoblast 마커) 각 각각 FMO 제어와 함께. 형광-마이너스-1 (FMO) 컨트롤, 튜브 질문에 마커 마이너스 칵테일와 동일 하 게 완전히 스테인드 실험 샘플 준비 전체 항 체를 포함 하는 진정한 긍정 확인 흐름 cytometry 데이터 분석 하는 동안 사용 되었다 decidual 셀의 인구 FMO 컨트롤 상대 배경을 표시 하 고 진정한 긍정적인 신호의 정확한 게이팅 허용 합니다. 여기에 제시 된 데이터 3 생물 복제의 대표 이다. <a href="/files/ftp_upload/57443/57443fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57443/57443fig3.jpg"> 그림 3: 기본 인간의 decidual 셀의 대표 Immunocytochemical 분석. 기본 인간 decidual 셀 미디어 변경 24 헤 셀 아세톤-메탄올으로 고정 되었고 단일 클로 널 마우스 안티-CD45 (백혈구 마커) 물 들일 후 48 h에 대 한 유리 coverslips에 성장 했다 안티-cytokeratin (상피 세포 마커)와 안티-cytokeratin 7 (trophoblast 마커) 항 체, 그리고 염소 안티 vimentin polyclonal 항 체 (stromal 세포 마커). 대표 이미지 표시 (A) vimentin 양성 섬유 아 세포 (보조 Abs: 당나귀 안티 염소), (B) CD45 + 백혈구 (보조 Abs: 당나귀 반대로 마우스), (C) cytokeratin 긍정적인 상피 세포 (보조 Abs: 당나귀 반대로 마우스) 및 (D) cytokeratin 7-긍정적인 trophoblast 셀 (보조 Abs: 당나귀 반대로 마우스) 검색 (붉은 얼룩) 했다. DAPI 얼룩 (블루 얼룩) 세포의 핵 염색에 사용 되었다. 일반적인 마우스와 염소 IgG (M IgG와 G IgG) 부정적인 컨트롤 사용, 기본 생략 Abs 이차 항 체 컨트롤 (M 2nd 만 G 2nd 만)으로 사용 되었다. DMI 회전 디스크 confocal 현미경에 20 배 확대에서 이미지를 가져옵니다. 스케일 바 = 32 μ m. <a href="/files/ftp_upload/57443/57443fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할 연구

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

14.1K 조회수.  University of Toronto. 이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할 연구

비디오: Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

연구

의학

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

마우스 종양 모델에서 종양 세포 순환의 분리 및 전파

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...