우리는 우리의 기술 도우미에 게 빚을: 미국 형제와 H. Shkarlet, 실험 절차 동안 우리를 도운. 이 작품은 EU 보조금 (UniVax, 계약 번호 601738, 및 TRANSVAC2, 계약 번호 730964), 및 헬름홀츠 협회 부여 (하이-IDR)에 의해 부분적으로 투자 되었다. 자금 출처 조사에 영향을 주지 않았다 디자인, 원고 또는 게시를 위해 제출 하는 결정의 세대.

이 연구에 사용 된 모든 마우스 C57BL/6 배경에서 했다. 모든 동물 병원 체 자유로운 조건에서 유지 했다. 모든 실험은 (TierSchG BGBl 독일 동물 보호 법률의 규범에 따르면 수행 했다. 내가 S 1105; 25.05.1998) 허가 번호 33.4-42502-04-13/1281 및 162280에서 색 소니의 낮은 위원회 동물 실험의 윤리 및 국가 사무실 (낮은 색 소니 국가 사무실의 소비자 보호 및 식품 안전)에 의해 승인 했다.
1. CFSE OT의 얼룩-나 T 세포와 입양 전송
참고: OT-난 마우스 transgenically 생성된 동물 고정된 α와 β 사슬 함께 OVA의 면역 지배 펩 티 드를 인식 하는 T 세포 수용 체 (TCR)를 표현 하는 SIINFEKL10,11. 결과적으로, 이러한 마우스 수가 상당히 높은 SIINFEKL 전용 CD8+ T 세포 (97%)12 13정상 또는 OVA-예방 접종을 마우스 (≤ 1%) 비해.
<ol><li>추적 CD8의 절연 OT에서+ T 세포-나 쥐 T 림프 구 특정은 Thy1는는 (Thy1.1) 대립 유전자 표현:<ol>
<li>6-9 주 된 OT를 안락사-나 CO2 흡입에 의해 쥐 뒤에 자 궁 경부 전위14. 피부 외과 플라이어 집게의 도움으로 몸에서 피부를 분리 수술가 위로 절단 하 여 비장 및 주요 림프절 (사 타 구니, 겨드랑이, 자 궁 경부 쌍만) 해 부 고에 넣어 접시 (60 x 15 m m) 각각 포함 하는 100 µ m 기 공 메쉬 컵 조직 연 삭 및 셀 릴리스에 대 한.</li>
		<li>얼음에 있는 완전 한 RPMI 매체 (RPMI 1640, 10 %v / v, FCS 100 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스)의 3-5 ml 접시 (각각 하나의 메쉬 컵)를 유지 합니다.</li>
		<li>주사기 나 비슷한 무 균 악기의 도움으로 장기 매 시 (사전 절단 불필요) 15 mL 원심 분리기 튜브에 결과 단일 세포 현 탁 액을 수집.</li>
		<li>300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한. 원심 분리에 의해 차가운 PBS의 10 mL에 세포를 세척 하 고 다시 염화 암모늄 버퍼 (ACK 버퍼, 상용)의 1 mL/비장에 펠 릿을 일시 중단 하 여 비장에서 적혈구를 lyse. 얼음에 1.5 분에 대 한 셀을 품 어 하 고 이후 원심 분리 (으로 이전)에 의해 차가운 PBS의 10 mL로 세포를 씻어.</li>
		<li>다시 1 ml의 PBS (pH 7.2) 포함 5% 태아 둔감 한 혈 청 자석 절연에 대 한 같은 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마그네틱 격리를 수행 하려면 CD8의 부정적인 선택을 진행+ T 제조업체 지침에 따라 자기 절연 키트를 사용 하 여 셀 또는 프로토콜15게시.</li>
	<li>CFSE 얼룩을 수행 하려면 먼저 CD8 수 계산+ T 세포 OT에서 얻은-난 자동된 셀 카운터 (입자 카운터)를 사용 하 여 마우스. 1-5 107 셀/mL 15 ml 송 골 매 관에 빛에서 보호 하는 37 ° C에서 7 분 5 µ M PBS에 CFSE와 1-5 mL의 볼륨에 배 얼룩.</li>
	<li>CFSE는 세포를 소 태아 혈 청의 같은 볼륨 (1:1)를 추가 하 여 얼룩을 냉각 하 고 빛 으로부터 보호 하는 37 ° C에서 추가적인 7 분에 대 한 그들을 품 어. PBS의 10 mL와 함께 셀을 두 번 세척.</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 3-5 100 µ L에 106 셀/마우스 배를 정 맥 주사 3-5 107 셀/mL PBS의 배을 셀 수 설정 (i.v.) 꼬리 정 맥을 통해.</li>
	<li>꼬리 정 맥 주사를 수행 하려면 적절 한 restrainers에 마우스를 고정. 다시 영역 및 쥐 꼬리 정 맥 혈관 확장을 허용 하도록 1-3 분 거리 20 ~ 25 cm 사이 붉은 빛 램프를 사용 하 여 주입에 쥐의 꼬리를 따뜻한. 참고:이 쉽게 정 맥 검색 및 세포 현 탁 액의 관리에 도움이 됩니다.</li>
	<li>(손으로 쥐와 램프 사이 배치) 확인 그것 너무 쥐에 대 한 뜨거운 고 꼬리 정 맥 명확 하 게 표시 될 때, 주입은. 셀 25 게이지 바늘161 mL 주사기를 사용 하 여 측면 또는 지 느 러 미 꼬리 정 맥에 주사.</li>
</ol>2. 예방접종 (보조 + OVA도 무료)
<ol><li>OT와 이식 생쥐를 배치-마 취 챔버 (1.7, 그림 1단계) 세포와 산소에서 isoflurane 마 취 기계14에 의해 관리.</li>
	<li>마우스 마 취에서 완전히 잠들 때, 약 실에서 그것을 꺼내와 gluteus superficialis (측면 허리)를 통해 깨끗 한 주사를 수행 하기 위해 전기 머리 트리밍 기계를 사용 하 여 영역에 마우스의 모피를 면도 와 응용 분야의 좋은 보기.</li>
	<li>백신, 25 게이지 바늘을 사용 하 여 면도 영역에 사우스 캐롤라이나의 50 µ L을 주입.</li>
</ol>3. 림프 톨 및 흐름 Cytometry 분석에 대 한 얼룩의 격리
<ol><li>림프 톨 및 splenocytes의 격리<ol>
<li>뒤에 자 궁 경부 전위 공동2 흡입에 의해 예방 접종된 마우스를 안락사.</li>
		<li>배출 및 먼 림프절과 비장 추출 하 고 조직 연 삭 및 셀 출시 100 µ m 기 공 메쉬 컵 포함 된 별도 접시에 그들을 배치. 1.1.3 통해 1.1.2 단계.</li>
		<li>원심 분리 후에 상쾌한 가만히 따르다와 다시 셀 펠 릿 잔해 PBS의 동일한 볼륨에 (약 100 µ L) 일시 중단.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교류 cytometry 분석에 대 한 얼룩<ol>
<li>15 mL 원심 분리기 튜브에 표 1에 표시 된 농도에서 착 항 체를 포함 하는 마스터 믹스를 준비, 얼룩 믹스 집중 따라서 2 x 열매를 산출. 샘플 당 100 µ L를 마스터 믹스의 충분 한 볼륨을 준비 합니다. 셀 및 마스터 혼합 1:1 혼합 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 품 어. 참고: 샘플 당 최종 착 볼륨 200 µ L (항 체 마스터 믹스의 셀 릿 + 100 µ L의 100 µ L) 이어야 한다.</li>
		<li>1.1.3, PBS의 10 mL를 두 번 추가에 설명 된 대로 셀 원심 분리에 의해 두 번 세척.</li>
		<li>다시 0.5-1에 얼룩진된 셀 중단 수집 및 전송 중단 교류 cytometer 튜브에 대 한 PBS의 mL. 항상 얼음 샘플을 유지 하 고 빛 으로부터 보호.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cytometry
<ol><li>항상 사전에 70-100 µ m 필터를 사용 하 여 셀 샘플 필터.</li>
	<li>표 1 (구슬 또는 셀)에 대 한 자세한 fluorophores에 대 한 하나의 얼룩 보상 컨트롤을 준비 합니다. 참고: 보상 한다 cytometer 또는 분석 소프트웨어17,,1819 에서 수행 되며 모든 샘플에 적용.</li>
	<li>그림2 제어 전략을 따릅니다. 앞으로 피해 지역 (그림 2A), 그리고 다시 사이드 분산형 및 측면 분산형 영역 (특수, 그림 2B) 남자를 제외 하려면 넓은 대 앞으로 살포 높이에 짧게, 게이트 인구.</li>
	<li>문 사실 CFSE 차별을 위해 BV 650 (자동-형광) FITC (CFSE) 대를 그려서 그림 2B 에서 인구 스테인드 높은 자동 형광 세포에서 세포. 구슬 또는 보상 컨트롤로 BV 650에 활용 된 항 체로 얼룩진 셀을 포함 합니다. 이 그림 (그림 2C) FITC 대 BV 650의 OT 게이트 하는 데 사용 됩니다-난 CFSE 셀 스테인드.</li>
	<li>받는 사람 마우스 대 기증자에서 파생 된 세포를 구별 하기 위해 APC (CD8) 대 Pe-Cy7 (Thy1.1-CD90.1-)에 대 한 그림 2 C 에서 인구를 게이트. 참고: 셀 OT에서 파생 된-난 기증자 마우스는 Thy1.1+ (CD90.1), 반면 WT (C57BL/6, 받는 사람) 마우스 파생 셀 Thy1.2+ (CD90.2) (그림 2D). 일부 연구소는 OT-난 Thy1.2 배경과 WT (C57BL/6)는 Thy1.1에 있는 쥐. 오티에 대 한 Thy1.2에 대 한 항 체를 사용 해야 하는 경우에-게이팅 셀.</li>
	<li>다시 CD8 게이트+ BV 450 (CD4)를 구성 하는 게이트에 APC (CD8) 대 그것을 그려서 Thy1.1+ 인구에서 세포 (그림 2E).</li>
	<li>인구는 CD8의 막대 그래프 디스플레이 사용 하 여 그림 2E 에 문이 표시+ (FITC, 530/15 채널-블루 레이저-), CFSE를 보여주는 셀 게이트 증식된 인구 10에서 농도 포함 하 여 수준2 곳 전적인된 제어 (농도 10 ~5, CFSE 얼룩이 지 고 교류 cytometer에서 전압 설정의 효능에 따라)는 (그림 2F).</li>
	<li>죽은 세포 확산 평가를 병행 평가 추가 게이트 (그림 2에에서는 표시 되지 않음) 플로팅 FITC 대 L/D 마커 (450/20 채널, UV 레이저)를 확인 합니다.</li>
	<li>취득 보상 컨트롤에 대 한 적어도 5000 이벤트 및 교류 cytometer에서 샘플에서 10.000 이벤트 (게이트 E, 그림 2). 낮은 또는 중간 흐름에는 cytometer 실행 (20.000 이벤트/s의 유량을 초과 하지 않는).</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

현대 백신은 이상적으로 composedof 정화 항 리, 바이러스 같은 입자, 나노 입자 또는 라이브 벡터 처럼 전달 시스템의 가능한 추가 adjuvants. 백신을 디자인할 때 중요 한 부분은 임상 필요에 따라 올바른 보조 제를 선택 하는. 범위에 속하는 체액 세포 면역 응답 (또는 둘 다) 대, 조직의 면역 반응 (또는 둘 다), 대 로컬의 선거 및 백신 대상 모집단에 생성 해야 하는 메모리의 종류를 선호 포함할 수 있었다. 보조 평가의 1 개의 중요 한 양상은 빠르게 CTL을 생성 하는 용량을 결정 하는. 우리 여기에 급속 하 게 OT를 측정 하 여는 CTL 응답에서 vivo에서 마우스 모델에서의 기능을 결정을 이미 알려진된 기술에 기반 하는 방법 제시-난 CD8 T 세포 확산. 이 방법은 수 adjuvants 여 elicited 면역 반응의 힘의 예측에 대 한 (OT의 확산-내가 T 셀)만 4 작업 일에. 이 방법은 더 이상 adjuvants 면역 반응 (전신 대 로컬) 측면에서 행동 및 그것의 효과적인 조치의 비교 용이. 여기, 우리가 어떻게 다른 보조 치료 (ADJ1 대 ADJ2) 면역 면역 반응에 영향을 미칠 것에 예를 보여주 있다. ADJ2의 작업은 동일한 복용량 ADJ1의 행동은 더 광범위 하 게, 응답을 생성 CTL 모두 로컬 및 조직 수준 하지만 반면 어디 배출 림프절에서 면역 반응을 활성화 하는 관리의 로컬 영역으로 제한 함께 배출 림프절에 ADJ2 보다 더 적은 힘.
보조의 CTL 용량의 성공적인 평가 위한 중요 한 단계는 젊은 오티의 선택-난 (CD8 T 세포의 소스로) 동물 및 예방 접종에 대 한 OVA도 무료 사용. OT 이후-난 마우스는 OVA 펩 티 드 SIINFEKL에는 MHC 인식 CD8 T 세포를 생산 하기 위해 생성 하는 유전자 변형 동물-나 맥락, 마우스 TCR의의 인공 선택 증가 하이퍼 증식 CD8의 모습+ T 세포 나이로20 . 겨드랑이 림프절의 염증은 이렇게 세 OT의 일반적인 기능-난 쥐. 계정에 이것을 복용, 그것은 젊은 오티를 사용 하 여 권장-난 동물 가능 하면 (6-9 주-오래 된 동물)에서 세포를 분리 하지 않으려면 확대 장기 (림프절의 비장 중 하나). CD8 T 세포 확산 확대 장기의 사용 때문에 가장 가능성이 차이 확산 컨트롤 및 치료는 얻을 수 없는 것 이다 전체 분석 결과 영향을 줍니다. 보조 CTL 세대 용량의 차별에 대 한 비슷한 함정이 없는 OVA21,22 (참조에 비해 더 강력한 면역 반응을 유도 수 있습니다.도의 OVA 단백질을 사용 하 여 생성 될 수 있습니다. 재료 및 시 약), 독 때문에 강한 면역-변조기 se 당 23. 따라서, OVA 단백질 면역에 대 한 사용도 무료 되어야 합니다. 도 없는 OVA의 20 또는 50 µ g 사용 하 여 접종 경로 되 50 µ g 피하 adjuvants의 테스트에 대 한 적절 한 복용량에 따라 달라 집니다. 또한, CFSE의 높은 농도 사용 하 여 스테인드 셀24 를 죽 일 문학에서 보고 되었다 고 분석 결과의 실패에 있는 결과 또한 할 수 있었다.
일부 수정 또는 프로토콜에 사용 되는 다른 기법 개선 실험의 재현성을 증가 하는 동물의 스트레스를 줄이기 위해 구현 되었습니다. 예를 들어 그냥 다시와 쥐와 하지 전체 동물의 꼬리를가 열 하 여 동물의 난방을 최소화 하거나 피하 주사를 피하기 위해 관련 스트레스 여 예방 접종 하기 전에 동물을 마비. 마 취 피하 주입에 대 한 하지만 우리의 경험, 동물 복지 규정에 의해 필요 하지 않습니다 그것은 스트레스 반응에 의해 소개 하는 변화를 감소 하 여 재현성을 향상 시킵니다.
이 방법의 큰 한계는 이후 CFSE는 세포의 막 얼룩, 높은 밝기 보통 손상는 cytosol에서 신호 검 이다. 따라서, CTL 용량 확인이 필요한 경우 IFN-γ의 분 비 평가 되어야 한다 특정 분 비 분석 결과 25, 그리고 세포내 cytokine 얼룩.
4 일만에 adjuvants에 의해 CTL 세대 용량을 추정 하는 확산의 측정의 사용의 장점이 짧은 시간 필요 보다 전통적인 CTL26 분석 실험 그리고 그것은 좋은 예비 실험 경우에서 어디에 추가 다른 방법으로 확인이 필요 합니다.
비록 항 원로 OVA로 제한 따라서 OT의 사용에-내가 T 세포, 제시 하는 방법 여기 증식된 셀의 정렬 후 다른 adjuvants에 의해 유도 된 활성화의 속성의 연구를 수 있습니다. 가능한 응용 프로그램 중 하나는 다른 adjuvants 증식된 오티에 의해 유도 된 변화 서명의 연구-나 T 세포와 메모리27의 발달을 가진 그것의 관계. 추가적인 보조 검사 자극된 세포 cytokines 또는 cytometry에 의해 degranulation 마커 또는 vivo에서 CTL 테스트8, 를 수행 하 여 그들의 세포 독성 용량 식 등의 생물 학적 속성 평가 수 있습니다. 26 , 28. 때문에이 응용 프로그램에 마우스 사용의 제한, 인 간에 게 extrapolations humanized 쥐29,,3031에 따라 착취 검 진에 의해 수행할 수 있습니다.
이 방법은 우리가 여기에 제시는 세포질 응답 활성의 선택에 대 한 첫 번째 검사로 사용 될 만큼 강력 하 고 또한 유연 수정 하거나 증식된 T 세포의 추가 분석을 결합입니다. 요약 하자면, 보조 CTL 세대 용량의이 급속 한 vivo에서 평가 그들의 보조 후보 분자의 행동의 모드의 빠른 특성에 관심이 있는 학계와 업계에서 백신 연구소에 대 한 이상적인 도구입니다.

세포 독성 T 세포 (CTL) 유도 하는 백신은 주요 치료 개입 싸움 암1의 특정 유형을 위해 개발 되었습니다. CTL은 또한 세포내 병원 체2에 대 한 예방 백신에 대 한 중요 합니다. 또한, CTL 누구 또한 초기 생활 감염5에 대처 하기 위해 CTL에 따라 신생아3,4 등 위험 인구에 기능적으로 활성 몇 면역 방어 메커니즘 중 하나입니다. 이와 관련, 백신 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 CTL 응답 (졸업생)을 유도 하지 않는 한 보조 제와 함께 개발 된 유아6에 감염 시 심각한 합병증에 지도 하는 백신의 완전 한 실패 귀착되는. 예방 접종의 이러한 부정적인 효과 CD8에 의해 반전 될 수 있다+ T 세포 응답7. 우리는 이전 인터페론 유전자 (스 팅) 주 작동 근의 어떤 자극에 의해 elicited (유형 I interferons) 주요 cytokines의 확산을 측정 하 여 일부 이러한 adjuvants8에 의해 생성 된 CTL 응답 필수적입니다 증명 하고있다 오티-예방 접종 및 기능을 유도 하는 CTL의 관찰에서 이러한 결과 사용 하 여 확장 예방 접종 일정9후 나 T 세포. OT의 확산의 측정-난 CD8+ T 세포는 야생 타입 (WT) C57BL/6 받는 사람 마우스 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 염료 희석은 생성 하는 백신의 보조 능력의 강력한 추정 크로스-SIINFEKL, (ovalbumin, OVA의 면역 지배 펩타이드)의 프라이 밍 이 기술은 OT의 확산의 평가 위해 널리 이용 된다-내가 CD8+ 및 OT II CD4+ T 세포. 예를 들어 그것은 WT 동물에서 항 원 리콜 후 백신 효능을 측정 하거나 선택한 cytokines (코 쥐)의 부재에 사용 되었습니다. CFSE 스테인드 OT의 수동 전송 후 짧은 프로토콜 (실험 4 일)는 고안-난 CD8+ T 세포, 50의 1 개의 복용량의 구성 된 피하 (사우스 캐롤라이나) 면역 테스트 adjuvants 보충도 없는 OVA의 µ g 관리 (그림 1)입니다. 예방 접종 후 48 h 결과의 후속 CTL 응답을 생성 하는 보조의 용량의 신뢰할 수 있는 증거를 제공 한다. 이 전략에 의해 비장 (또는 먼 림프절) CTL 활동을 측정 하 여 응답의 범위 뿐만 아니라 예방 접종 후 배출 림프 노드의 로컬 면역 반응의 힘을 평가 가능 하다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Special Order</td>
			<td>Flow Cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Proliferation Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480007</td>
			<td>Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Dead Cell Marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0900-82</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>740007</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z2 coulter Particle count and Size Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>9914591DA</td>
			<td>Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td>
			<td>Hyglos(Germany)</td>
			<td>321000</td>
			<td>Ovalbumin endotoxin free tested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#181;m nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Cell strainer (100 &#181;m pore mesh cups).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Vials</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>899366014</td>
			<td>Sample vials for Z2 automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (CD90.2)</td>
			<td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Company is now Envigo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)</td>
			<td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fischer (Corning)</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td>Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL tubes</td>
			<td>Fischer (Corning)</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (500 mL)</td>
			<td>Fischer (Gibco)</td>
			<td>20-012-027</td>
			<td>Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red lamp (heating lamp)</td>
			<td>Dirk Rossmann GmbH (Germany)</td>
			<td>405096</td>
			<td>Heating infrred lamp (100 wats)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (Isoflurane)</td>
			<td>Abbott Laboratories (USA)</td>
			<td>5260.04-05.</td>
			<td>Isoflurane anesthesic (250 mL flask).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td>Isoflurane anesthesia machine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Base medium with Glutamine (500 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>15-140-148</td>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum (Gibco)</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer (100 ml)</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dishes</td>
			<td>Nunc (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>150340</td>
			<td>60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Clump Filter</td>
			<td>CellTrics (Sysmex)</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td>CellTrics&#174; 50 &#956;m, sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development

현대 소 단위 백신의 평가의 중화 항 체 생성은 중요 하지만 보조 선택에 대 한 충분 한 보여준다. 따라서, 세포 독성 T 세포 (CTL) 응답을 홍보할 수 있는 체액과 세포 면역 물질로 기능 adjuvants 절실히 필요 합니다. 따라서, 크로스 못쓰게 유도 하 고 이후 CTL 세대 강화 보조 후보자의 충실 한 모니터링 백신 개발에 중요 한 단계를 나타냅니다. 여기에 우리는 SIINFEKL 전용을 사용 하는 방법에 대 한 응용 프로그램을 제시 (OT-나)는 크로스-프레 젠 테이 션 모델 항 ovalbumin (OVA)는 비보에 다른 보조 후보자의 존재를 모니터링 하는 T 세포. 이 메서드는 adjuvants 최고의 크로스 못쓰게 기능을 선택 하는 빠른 테스트를 나타냅니다. CD8 확산+ T 세포 간 못쓰게의 가장 중요 한 표시 이며 그것은 또한 보조 유도 크로스-프레 젠 테이 션의 상관으로 간주 된다. 이 기능은 림프절과 비장 같은 다른 면역 기관에 평가할 수 있습니다. CTL의 정도 모니터링할 수 있습니다, 따라서 로컬의 특성에 통찰력을 주는 (주로 림프절 배수) 또는 조직의 반응 (먼 파선 또는 비장). 이 기술은 더 또한 종래와 유전자 변형 쥐의 다른 긴장에 사용 될 가능성을 제공 하 고 특정 크로스-프레 젠 테이 션 경로 억제할 수 있는 약물 테스트에 대 한 여러 수정 수 있습니다. 요약 하자면, 우리는 여기에 제시 하는 응용 프로그램 개발 하거나 백신 연구와 개발에 대 한 화학 adjuvants 수정 업계 또는 학계에서 백신 연구소에 대 한 유용할 것 이다.

Adjuvants (ADJ1 및 ADJ2)의 다른 조합을 사용 하 여 치료를 테스트 하려면 우리 adoptively 전송된 OT의 확산을 측정 하 여 CTL 세대 용량 평가-내가 CD8 cytometry (그림 2)에 의해+ T 세포. 이 위해, 우리는 이전 배출 림프절과 비장 (표 1)에서 격리 된 셀 스테인드. CD8의 확산을 측정 하 여 림프절과 비장,+ T 세포는 CTL 세대 고용량 ADJ2의 배수 림프절 (그림 3)에 비교 될 때 ADJ1, OVA 혼자 또는 PBS 컨트롤 확증 수 있었습니다. 반면, 우리는 관찰 ADJ2 조직 (비장)에 CTL 응답을 생성 하지 못했습니다, 반면 ADJ1 비장 CD8에 의해 확산의 표시 높은 수준의+ T 세포, 하지만 하지만 또한 우수한 컨트롤 (PBS 및 OVA)에 비해 ADJ1 하. 이 급속 한 비보에 확산 분석 결과 사용 하 여 ADJ2의 행동을 해 부하 여 우리 로컬 하지만 조직의 CTL 생성기의 강력한 조치를 확인할 수 있습니다. 또한, ADJ1 역할을 모두 주입 (배수 림프 노드)의 로컬 사이트에서 뿐만 아니라 체계적으로 증가 OT와-나 비장에 확산. 얻은 결과 보조의 활동 및 그 정도, ADJ2 (로컬) 및 ADJ1 (조직)의 관찰 된 효과 의해 exemplified 하 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57401/57401fig1.jpg"> 그림 1: 분석 결과 일정. 분석 결과 일정 초기 OT를 나타냅니다-T 셀 전송 하루 하루 1, 0, 사우스 캐롤라이나 예방 접종 및 샘플링 비장 및 배출 림프절 2 일 후에. <a href="/files/ftp_upload/57401/57401fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57401/57401fig2.jpg"> 그림 2: 제어 전략의 흐름도 측정 CD8의 확산을 따라+ T 세포 (OT-난 Thy1.1+) cytometry 여. 두 샘플 더 나은 시각화에 대 한 다양 한 색상 (빨간색과 밝은 파란색)에 표시 됩니다. A-b. 단일 세포는 앞으로-분산형-높이 앞으로 피해 지역 대와 측면-분산형 폭 사이드-분산형-지역 대를 그려서 처음 두 게이츠에 잇따라 남자에서 차별. C. 셀 b에서 문이 BV 650 채널 (자동 형광)의 그들의 CFSE 강도 (희미하게 나타냅니다 세포 분열/증식) 530/30 YG 채널에서에 대 한 플롯의 형광 강도 의해 표시 됩니다. 이 게이트 차별 하 여 진정한 CFSE 긍정적인 셀 선택을 허용 그 높은 자동 형광. D. CFSE 긍정적인 세포 Pe Cy7의 그들의 높은 형광 강도 문이 했다 (Thy1.1, 오티에 대 한 마커-난 세포) 그들의 APC 강도 (CD8) 대. E. BV 450 (CD4) APC (CD8)에 대 한 플롯에 대 한 이전 문이 정확 하 게 선택 CD8 Thy1.1 긍정적인 셀+ T 세포. F. 이전 문이 CD8+ 세포 증식된 인구를 마지막으로 게이트를 CFSE 강도 대 한 히스토그램에 그려집니다. <a href="/files/ftp_upload/57401/57401fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57401/57401fig3.jpg"> 그림 3: 보조 CTL 세대 구동. 로컬 또는 조직의 CTL 응답을 유도 하는 항 원 및 PBS 컨트롤에 따라 2 가지 보조 치료 (ADJ1 및 ADJ2)에 대 한 묘사 된다. Adoptively 전송된 OT의 확산-내가 T 세포 검사 (사 타 구니, exemplified 피하 (사우스 캐롤라이나) 관리에 대 한) 배출 림프 노드 및 비장을 그림 행에 표시 된 대로. 세포 증식 로컬 (배수 림프 노드) 또는 행동의 조직 (비장) 범위에 면역 반응의 정도 정확 하 게 비교 하기 위해서는 모든 관련 치료 (열) 단위로 측정 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57401/57401fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>염료-항 체</td>
			<td>클론</td>
			<td>Fluorophore/채널 필터</td>
			<td>농도 2 X</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thy1.1 (CD90.1)</td>
			<td>HIS51</td>
			<td>PE-Cy7-780/60 YG</td>
			<td>1:750</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>53-6.7</td>
			<td>APC-670/14 R</td>
			<td>1:280</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>RM4-5</td>
			<td>BV 421-450/50 V</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CFSE</td>
			<td>-</td>
			<td>FITC-530/30 YG</td>
			<td>(CFSE 얼룩 프로토콜에 따라)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DCM (죽은 셀 표식)</td>
			<td>-</td>
			<td>-/ U.V.-450/50 UV</td>
			<td>1: 500</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: cytometry에 대 한 항 체 stainings. Fluorophore 활용 된 항 체 클론 사용 하 고 농도 (2 배)을 얼룩이 지는 것이 좋습니다.

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Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

rapid-vivo-assessment-adjuvant-s-cytotoxic-t-lymphocytes-generation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

8.6K 조회수.  Helmholtz Centre for Infection Research. 선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

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Teratoma Generation in the Testis Capsule

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers. This makes them a potentially valuable tool for the treatment of many different diseases. With the advent of induced pluripotent stem cells (iPSCs) and continuing research with human embryonic stem cells (hESCs) there is a need for assays that can demonstrate that a particular cell line is pluripotent. Germline transmission has been the gold standard for demonstrating the pluripotence of mouse embryonic stem cell (mESC) lines1,2,3. Using this assay, researchers can show that a mESC line can make all cell types in the embryo including germ cells4. With the generation of human ESC lines5,6, the appropriate assay to prove pluripotence of these cells was unclear since human ESCs cannot be tested for germline transmission. As a surrogate, the teratoma assay is currently used to demonstrate the pluripotency of human pluripotent stem cells (hPSCs)7,8,9. Though this assay has recently come under scrutiny and new technologies are being actively explored, the teratoma assay is the current gold standard7. In this assay, the cells in question are injected into an immune compromised mouse. If the cells are pluripotent, a teratoma will eventually develop and sections of the tumor will show tissues from all 3 germ layers10. In the teratoma assay, hPSCs can be injected into different areas of the mouse. The most common injection sites include the testis capsule, the kidney capsule, the liver; or into the leg either subcutaneously or intramuscularly11. Here we describe a robust protocol for the generation of teratomas from hPSCs using the testis capsule as the site for tumor growth.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the potential to treat a myriad of different diseases. The utility of these cells lies in the fact that they can differentiate into any cell type in the body. Here we describe the teratoma assay, which is used to demonstrate the pluripotence of hPSCs.

Testis 캡슐의 Teratoma 생성

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

연구

의학

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the low-molecular-weight-heparin (LMWH), enoxaparin. There are also urgent clinical situations where it would be important if this could be determined rapidly. The present assay is designed to accomplish this. We only assayed human blood samples that were spiked with known concentrations of enoxaparin. The essential feature of the present assay is the quantification of the efficacy of enoxaparin in a patient's blood sample by degrading it to complete inactivity with heparinase. Two blood samples were drawn into Vacutainer tubes (Becton-Dickenson; Franklin Lakes, NJ) that were spiked with enoxaparin; one sample was digested with heparinase for 5 min at 37 &deg;C, the other sample represented the patient's baseline anticoagulated status. The percent shortening of clotting time in the heparinase-treated sample, as compared to the baseline state, yielded the anticoagulant contribution of enoxaparin. We used the portable, battery operated Hemochron 801 apparatus for measurements of clotting times (International Technidyne Corp., Edison, NJ). The apparatus has 2 thermostatically controlled (37 &deg;C) assay tube wells. We conducted the assays in two types of assay cartridges that are available from the manufacturer of the instrument. One cartridge was modified to increase its sensitivity. We removed the kaolin from the FTK-ACT cartridge by extensive rinsing with distilled water, leaving only the glass surface of the tube, and perhaps the detection magnet, as activators. We called this our minimally activated assay (MAA). The use of a minimally activated assay has been studied by us and others. 2-4 The second cartridge that was studied was an activated partial thromboplastin time (aPTT) assay (A104). This was used as supplied from the manufacturer. The thermostated wells of the instrument were used for both the heparinase digestion and coagulation assays. The assay can be completed within 10 min. The MAA assay showed robust changes in clotting time after heparinase digestion of enoxaparin over a typical clinical concentration range. At 0.2 anti-Xa I.U. of enoxaparin per ml of blood sample, heparinase digestion caused an average decrease of 9.8% (20.4 sec) in clotting time; at 1.0 I.U. per ml of enoxaparin there was a 41.4% decrease (148.8 sec). This report only presents the experimental application of the assay; its value in a clinical setting must still be established.

Demonstration of a rapid quantitative assay of the inhibition of blood coagulation by the low-molecular-weight-heparin, enoxaparin. The contribution of enoxaparin is assessed by removing its influence through digestion with heparinase. A fuller description of the assay is detailed in our published paper.1 The assay still requires clinical confirmation.

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

골육종 세포의 광 역학 치료의 세포 독성 효능<em&gt; 체외</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

차세대 시퀀싱에 대한 수집 및 타액 DNA의 추출

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

마이크로 컴퓨터 단층 촬영과 누드 마우스에 인간의 지방 주입의 생존 능력의 평가

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...