저자는 Sphingonet 컨소시엄이이 작업을 지원 하기 위한 Leduq 기초에 의해 투자를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 또한 "혈관 차별화 및 리 모델링" 공동 연구 센터에 의해 지원 되었다 (CRC / Transregio23, 프로젝트 C1)와 7. FP, COFUND, 괴테 국제 Postdoc 프로그램 이동-IN, No. 291776 자금. 우리 더 처리 및 유전형 캐슬 린 서머를 한 쥐와 그녀의 기술 지원에 대 한 인정합니다.

모든 동물은 절차 동안 통증이 나 불편을 최소화 하는 최대 관심을가지고 처리 합니다. 이 절차 우리 기관의 동물 보호 지침을 다음과 같이 하 고 지역 위원회 (Regierungspraesidium 다름슈타트, 승인 번호 FK/1044)에 의해 승인 되었습니다.
침투성 시험 쥐에서 vivo에서 에 대 한 작업 단계의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 각 단계의 자세한 내용은 아래 설명 되어 있습니다.
1입니다. 동물 처리
<ol><li>
준비 및 추적기 및 마 취약의 관리
	<ol>
<li>침투성 시험 전날 이상 포함 하는 조직에 대 한 레이블된 튜브와 금형을 준비 합니다. 깨끗 한 증기 두건에서 작업 하 고 80% 에탄올으로 청소 하는 도구를 사용 하 여 프로토콜을 통해 무 균 상태를 유지 합니다. 현재 프로토콜에 대 한 3-6 개월의 성숙한 성인 연령 집단에 있는 남성 또는 여성 야생-타입 (WT) 또는 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) CD1 마우스를 사용 합니다. 앞에서 설명한 10쥐의 유전형을 수행 합니다. 참고: 80% 알코올 살 균 계기 초래 하지 것입니다 있지만 준비 샘플의 오염을 최소화 됩니다.</li>
		<li>2mm 주식으로 메 마른 PBS에 모든 추적기를 희석 하 고-20 ° c.에 빛에서 보호 하는 aliquots를 저장</li>
		<li>(Tetramethyl Rhodamine) TMR 같은 추적기를 선택 하 고 (fluorescein isothiocyanate) 고유 여기/방출 스펙트럼과는 FITC는 리 형광 현미경 검사 법에 의해 모두 염료 간의 최소한의 간섭 결과로 고칠 수 (는 TMR을 사용 하 여 또는 FITC 각각 필터)와 fluorometry 침투성 분석 결과 대 한 플레이트 리더에 의해. 참고: TMR dextran 3 kD FITC dextran 3 kD는 연구에 사용 된 두 리 고칠 수 및 따라서 사용 될 수 있는 또한 알데하이드와 immunohistochemical 분석 후 고정 지역 차이 조사 하기 위하여.</li>
		<li>최대한 주의 기관 관리 지침에 따라 모든 동물을 처리 합니다. 추가 추적 프로그램 1:1 믹스10,13의 각 추적기의 100 µ L를 사용 하 여 결합 될 때 200 µ L까지 증가 될 수 있다 100 µ L 추적 솔루션으로 intraperitoneally 각 마우스를 주사. 혼자 autofluorescence 배경 빼기에 대 한 가짜 제어 역할을 추적기 대신 PBS를 가진 하나 이상의 동물을 주입.</li>
		<li>추적 프로그램 삽입 후 5 분 anesthetize i.p 주사 마 취 제 및 Xylazine를 가진 동물 (100 mg과 5-10 밀리 그램 0.9%에서 염 분 당 킬로그램 몸 무게 각각, 150 µ L 당 25 g 마우스 칵테일의). 참고: 수 의사 연 고는 적용 되지 눈에 절차 동안 동물 마 취과 관류/희생 사이 기간 이었다 짧은 (10 분) 관찰 되지 있던 모든 눈의 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈액 수집 및 심장 관류
	<ol>
<li>동물 마 취 관리 후 심장 관류 10 분에 대 한 준비. 동물 마 취의 수술 평면에 도달 했습니다 수 있도록 발 트 위치 응답의 부재를 확인 합니다.</li>
		<li>그들의 뒤에는 동물을 80% 에탄올 복 부의 피부에 적용. 바로 흉 곽 아래에 작은 절 개 (2 cm)와 복 벽을 열어 작은 위를 사용 하 여. 횡 경 막에서 간 고 천천히 횡 격 막 흉 막 캐비티 15노출 극복 합니다.</li>
		<li>양측 흉 곽을 잘라 고 왼쪽된 심 실 노출 하려면 컷된 흉 골을 해결. 좌 심 실의 뒷부분에 연동 관류 시스템에 연결 된 21-게이지 나비 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>오른쪽 아 트리 움 펑크와 신속 하 게 (10 s) 혈 청 컬렉션 튜브에 혈액 1 mL 피 펫 팁 (최종 마감)를 사용 하 여 흉 강에 발표의 200-300 µ L를 수집 하 고 얼음에 저장. 참고:이 관류 절차는 비 생존.</li>
		<li>즉시 혈액 수집 관류 시스템 (10-12 rpm, 5 mL/min)에 전환 하 고 따뜻한 (RT) 1 x PBS로 3 분에 대 한 동물을 perfuse (Ca의 무료2 +Mg2 + 이온). 참고: PBS 포함 캘리포니아2 +/Mg2 + 이온 활용할 수 있습니다 더 나은 심장 활동에는 관류 동안. PBS 관류에 대 한 사용의 총 금액은 15 ~ 20 mL의 범위입니다.</li>
		<li>간, 색상을 지적 함으로써 관류 품질 평가 신장 관류 후 화이트/창백을 표시. 참고: 신장 또는 간 관류 반드시 나타내지 않습니다 뇌 관류로 동맥 (경 동맥/척추) 도달 뇌 대동맥에서 특히 심 방 찔린 중 3 단계에서 준비 하는 동안 파열 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 조직 처리
<ol><li>장기 수집 및 저장
	<ol>
<li>관류의 끝에, 자 궁 경부 전위 및 수확 뇌와 신장에 의해 동물의 죽음을 확인 합니다. 관류 품질은 좋은 동물 침투성 분석에서 제외 되므로 뇌 관류 (meninges의 혈관에서 보이는 혈액), 머리의 색깔에 의해 확인 합니다. 메스 (그림 1)를 사용 하 여 2 hemibrains로 두뇌를 구분 합니다.</li>
		<li>후 엽과 소 뇌의 무료 메스 한 hemibrain와 dissect 그리고 2 mL 튜브에는 hemicerebrum를 전송. 소 뇌 침투성 평가에 필요한 경우 추가 튜브에 헤 미-소 뇌를 저장 합니다.</li>
		<li>다른 2 mL 튜브에 단일 신장 전송. 드라이 아이스에 샘플을 즉시 저장 합니다.</li>
		<li>기본적으로 나머지 신장과 hemi-뇌 (소 뇌와 후 엽으로 구성 된)에 포함 조직-테크 최적의 절삭 온도 (O.C.T) 드라이 아이스에 화합물.</li>
		<li>결국, 원심 10, 000g, 4 ° c.에서 10 분에 혈 청 컬렉션 튜브에 얼음에 저장 된 혈액 샘플 1.5 mL 튜브에 혈 청 supernatants 전송 및 드라이 아이스 컨테이너에 넣어.</li>
		<li>추가 처리까지-80 ° C 냉장고를 드라이 아이스에 수집 된 모든 샘플을 전송 합니다. 참고: 그것은 녹고 동결로 후 균질 효율성 증가로 균질 단계를 진행 하기 전에 샘플을 동결 하는 것이 중요입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>균질 및 원심 분리
	<ol>
<li>Hemi-뇌와 신장 샘플 다운-80 ° C에서 냉동 얼음에 thaw와 장기를 포함 하는 튜브를 무게. 이러한 무게에서 조직 무게를 여러 빈 관 (약 20)의 평균 값을 뺍니다. 추가 300 µ L 및 감기 1의 200 µ L 신장과 hemi-뇌, 각각 포함 된 튜브에 X PBS. 참고: (헤 미-소 뇌, 100 mg 아래) 같은 조직의 낮은 금액에 대 한 개별 튜브의 무게는 것이 좋습니다.</li>
		<li>소계 (PTFE) 유 봉 약 15 스트로크를 수행 하 여 전기 오버 헤드 교 반기 (1, 000 rpm)에 연결 된과 원래 eppendorf 관에서 각 샘플을 균질 (1 스트로크 = 1 및 1 다운). 샘플 사이 PBS 가진 유 봉 헹 구 고 닦아 다음 예제를 진행 하기 전에 건조. 참고: 균질 동안 세제의 사용 했다 fluorometry 잠재적인 간섭으로 인해 피할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜에 세포내 추적 감지 또한 조직을 철저 하 게 균질 한 라운드의 동결 해 동 후는 더 효율적으로.</li>
		<li>빛과 15000 g, 20 분, 탁상 원심 분리기에 4 ° C의 끝에 모두 함께 원심 분리기에서 보호 하는 얼음에 무 균된 샘플을 저장 합니다. 즉각적인 fluorometry 또는 나중에 분석할 수-80 ° C에서 얼음에 새로운 1.5 mL 튜브 supernatants 전송.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 측정 및 정량화
	<ol>
<li>이전 단계의 끝에 동결 조직 상쾌한 및 혈 청 샘플은 호 일 빛에서 그들을 보호 하는-80 ˚C에 저장 된 얼음에 녹여.</li>
		<li>384 잘 검정 잉크 판으로 희석된 혈 청 (30 µ L 1 x PBS + 20 µ L 세럼) 또는 (있는 그대로) 조직 supernatants의 50 µ L 플라스틱. 이 조직 homogenate 배경 일반적으로 희석제로 사용 하는 PBS의 이상으로 혈 청 및 조직의 supernatants 적절 한 배경 빼기를 보장 하기 위한 가짜 동물에서 적어도 하나의 샘플을 포함 합니다. 참고: 3 가짜 동물의 평균 비록 가짜 autofluorescence 값 (데이터 표시 되지 않음)에 아주 작은 변화 관찰 되었다 autofluorescence에 대 한 사용할 수 있습니다. PBS, 또한 뇌 샘플 같은 낮은 형광 샘플에 대 한 신호 대 잡음 비 증가 수와 그것을 diluting 하 여 혈 청 사용의 금액을 줄일 수 있습니다. 최대 10 µ L 세럼 40 µ L PBS와 그것을 diluting 테스트를 했다. 아니 거품 우물에 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>384 잘 블랙 플레이트 플레이트 판독기에 삽입 하 고 형광 측정을 선택 하는 새로운 스크립트를 엽니다.</li>
		<li>최적 이득을 설정 하 고 각각 TMR 또는 FITC dyee에 대 한 550/580 또는 490/520 여기/방출 (nm) 값을 사용 하 고 원시 형광 단위 (RFUs)를 측정 시작.</li>
		<li>플레이트 리더에서 원시 형광 단위 (RFUs)를 사용 하 여 해당 하는 가짜 값을 뺀 후 침투성 색인 (PI) 계산.<ol>
<li>
* 침투성 인덱스 (mL/g) = (조직 RFUs/g 조직 중량) / (혈 청 RFUs/mL 혈 청)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>예제 계산 뇌 침투성 색인 (PI)에 대 한 동물 GOF1의 (표 1).<ol>
<li>GOF1 RFUs-가짜 뇌 RFUs 뇌 = 154-22.5 131.5 =</li>
			<li>GOF1 혈 청 RFUs-가짜 혈 청 RFUs 38305-27 = = 38278</li>
			<li>뇌의 무게 (g) = 0.195</li>
			<li>혈 청 볼륨 (ml) = 0.02</li>
			<li>뇌의 침투성 인덱스 (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352 참고: 침투성 인덱스 계산 항복 값을 절대 및 실험 및 조직 유형 사이 비교. 그러나 이들은 2 그룹 12사이 비교의 용이성에 대 한 비율으로 제시 될 수 있습니다. 이 두 그룹에 각 동물의 PI 1 아직 유지 간 동물 변형 제어 그룹에서 통해 컨트롤 그룹 평균 운전 제어 그룹의 평균 PI와 함께 나누어 얻을 수 있습니다. 이 변화는 1로 설정 하는 컨트롤 그룹을 기준으로 실험 그룹 (또는 그룹)에 대 한 값을 제공 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>추적의 면역 형광 시각화
	<ol>
<li>10 µ m는 cryostat에 섹션-20 ° C로 설정 하 고 실내 온도 슬라이드 섹션을 전송으로 조직-테크 화합물 (O.C.T) (2.1 단계)에 기본적으로 포함 된 신장/hemi-두뇌 블록을 잘라. 섹션은 일단 말리 면 (약 30 분), 전송 슬라이드-80 ° C 냉동 고 사용까지.</li>
		<li>얼룩이 지기의 날, 10 분 동안 37 ° C에서 슬라이드를 해 동 하 고 PBS에서 빠른 세척 뒤 실 온에서 10 분 동안 4 %paraformaladehyde (PFA)와 섹션을 수정.</li>
		<li>Permeabilization/차단 버퍼 1 %BSA 및 0.5% 트라이 톤 X-100 pH 7.5 실 온에서 1 h 포함 된 살 균 PBS의에서 섹션을 품 어.</li>
		<li>CD31 1 차 항 체로 상 온에서 1.5 h에 대 한 슬라이드를 품 어 (0.5 mg/ml, 멕 13.3 복제), 트라이 톤 X-100 (pH 7.2) PBS에 3 5 분 세척 뒤 살 균 PBS, 0.5% BSA 0.25%를 포함 하는 버퍼에 1: 100에 희석.</li>
		<li>수행 이차 항 체 외피 종의 함께 실 온에서 1 h 대 위의 버퍼 붙일 항 체 희석된 1: 500 (2 mg/mL)를 표시 합니다. CD31에 대 한 염소 반대로 쥐 알 렉 사 568 또는 알 렉 사 488 1: 500의 희석에 사용할 수 있습니다. DAPI를 포함 (300 μ M) 이차 항 체는 핵에 대 한 얼룩 (1:1, 000 희석 주식에서) 혼합.</li>
		<li>아쿠아 polymount와 스테인드 섹션을 탑재 하 고 어둠 속에서 실 온에서 중 합에 대 한 그것을 떠나 하룻밤.</li>
		<li>스펙트럼 영상 confocal 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. NIS 요소 소프트웨어 (버전 4.3)에 의해 이미지를 분석 합니다. 몽타주 그림의 생성을 위해 포토샵과 같은 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier.">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

혈액-뇌 장벽 부전 기본 및 보조 뇌종양 이나 뇌졸중 등 신경 성 질환의 숫자와 연결 됩니다. BBB 붕괴는 종종 CNS 부 종 생명이 연결 됩니다. 트리거 오프닝 분자 메커니즘의 해명 또는 BBB의 폐쇄는 그러므로 신경 장애 그리고 일반적으로 치료 의미의 조사 연구자에 의해 있다. 그러나, 조사 하는 방법을 문학에서 보고 된 BBB 침투성에서 vivo에서 수시로 연관 된다 형광 이미지17,18 의 지루하고 주관적인 정량화에 의존 하는 기술적인 어려움 , 19. 또한, 방법의 일부 포함 뇌 형광 이미징으로 더 단단한 방 벽을 형성 하지 않는다 표면 뇌 혈관의 침투성을 나타내는 그릇입니다. 동물은 종종 중요 한 피 분수 인해 잘못 된 해석으로 이어지는 끼얹는다는 객관적인 뇌 조직 흡 광도 (예: 에반스 블루 침투성 평가)에 따라도 때 정량화 수행 되었습니다. 뇌 무게는 침투성 계산에 포함 되지 자주 하지만 혈관 침투성에서 발생 하는 부 종 수 무게를 증가 하 고 net 침투성을 변경할 필요가 다른 변수입니다. 또한, 섹스와 동물-동물 두뇌 무게 변이 침투성 차이 클라우드 수 있습니다. 14C 자당 등 [3h] 눌린 방사성 트레이 서 두뇌 침투성 인덱스 성공적으로 적용 된 하지만 다양 한 크기와 충전 붙일 레이블된 추적기20으로 침투성 조사를 기반으로 제공 하지 않습니다.
위의 이유로, 우리는 간단 하 고 객관적인 혈액-뇌 장벽 침투성에서 비보에 붙일 레이블된 추적기를 사용 하 여 마우스에 추정에 양적 방법을 채택 했다. Dextrans 그들의 보통 높은 분자량 (kD 3-200)에 의해 특징 친수성 다 당 류 이며 충전 또는 충전 분자 활용된 fluorophore를 기반으로 얻을 수 있습니다. 내 피 꽉 접합 주로 claudins (1, 3, 5, 12)에 의해 형성 하 고 occludin, 함께 paracellular 크기 결정 공 잔류물 (21에서검토) 그들의 첫 번째 extracellular 루프에는 충전에 의해 선택도 충전. 혈액-뇌 장벽에서 비보에 걸쳐 침투성은 또한 glycocalyx와 기저 lamina BBB22,23의 양쪽에 있는 두 개의 구조에 의존 합니다. Luminally 현재 glycocalyx은 알 부 민 등 혈액을 매개로 고분자를 장벽 역할도 부정 청구 oligosaccharides (헤 파 린 황산 염)에 의해 형성 된 구조 처럼 젤. 우리는 야생 타입 마우스10에 비해 기능 마우스의 angiopoietin 2 이득에 관찰 glycocalyx 두께 또는 구성 변화 혈관 침투성 변화에 연관 있습니다. 지하실 막 두 혈관 지하실 멤브레인 parenchymal 지하실 막 또는 astrocytic 지하실 막 만든 반면 내 피 세포와 pericytes에 의해 만들어진 구성 된 내 피 세포의 abluminal 측에 존재는 다른 한편으로 의해 이다. 지하실 막이 또한 부정적으로 위탁 하 고 따라서 또한 충전 방 벽으로 봉사 하는 능력을가지고. 이와 관련, 활용된 dextrans 크기와 충전 기반 침투성의 조사를 제공합니다. 예를 들어 TMR-dextran 3 kD는 음이온 TXR-dextran 3 kD는 중립, 활용된 높은 결합 한 이러한 추적기 FITC dextran 70 같은 분자량 dextran 동일한 혼합에 kD 쥐에 주입, 하나 크기 기반 침투성 평가할 수 있습니다. 우리 더 형광 표시 된 dextrans 탐험 표준 면역 형광 염색에 침투성에 있는 지역 다름의 lysine 고칠 수 자연의 활용. Dextrans는 또한 일반적으로 낮은 immunogenicity를 전시 하 고 따라서 좋은 추적기 역할. 루시퍼 노란색, cadaverine, fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTSC)는 낮은 분자량 범위에 있는 다른 추적기 (0.4-0.8 kD)와 고칠 수 있다.
우리의 방법에는 추적기 i.p 경로 뒤에 쥐를 perfusing에 의해 주입 했다 하 고 젖은 무게와 혈 청 형광으로 정규화 뇌 homogenates의 형광을 취득 합니다. 이것은 간단한 아직은 매우 정량적 객관적인 방법을 선택 영역이 없는 섹션/이미지에서 고아 하 게 사용 되는 immunofluorecence 메서드에 의해 정량화의. 우리 침투성 분석 결과 대 한 하나의 hemi-두뇌 활용를 면역 형광 분석 화살 섹션 같은 동물에 지역 차이 제공 하 여 얼룩에 대 한 다른 hemibrain. 고유한 동시 측정을 위한 각 반의 두뇌를 사용 하 여 우리의 프로토콜의 주요 장점 중 하나입니다. 또한, 신장, 간 등 다른 장기의 침투성 좋은 내부 제어 기저 침투성은 이러한 기관에서 높은 역할. 2 그룹을 비교 하기 위해 가짜 동물 (그 추적 프로그램 주입 받지 않았다)를 먼저 할 것 모두 그룹에 모든 동물 및 모든 조직에서 autofluorescence 유형 (신장, 뇌, 그리고 혈 청) 각 추적에 대 한과 다음에 정규화 진행 2 그룹을 비교 하는 계산. 침투성 색인 (PI) 얻은 것입니다 조직 조직 무게와 혈 청 볼륨을 정규화 하는 혈 청 형광의 비율로 표시 됩니다. 우리의 계산 실험 및 조직 유형 사이 비교 될 수 있는 추적 프로그램 침투성에 대 한 절대 값을 산출 한다. 그러나 이러한 값, 수 있다 쉽게 표현 될 비율 또는 %2 그룹으로 우리는 또한 이전12비교 되. 이 컨트롤 그룹에 있는 모든 동물의 평균 PI와 두 그룹에서 각 동물의 파이 나누어 얻을 수 있습니다. 이 1의 제어 그룹 평균을 기준으로 값을 주고 동물 사이 및 실험적인 그룹에 대 한 오류를 유지 아직 1 통해 컨트롤 그룹 PI를 드라이브 것입니다.
I.p 여 추적기의 주입은 쉽게, 하지만 더 많은 비용 집중에 비해 i.v 주입, 추적의 양을 증가 시킬 필요가. 이 점에서 우리의 데이터 (표시 되지 않음) 나타냅니다 추적기에 거의 2-fold 높은 금액 i.p 주입 테타에 비해 형광 값 유사한 혈 청을 얻을 하는 데 필요한. 또한, 순환의 시간 i.p 경로 추적 혈 류로 흡수에 대 한 촬영 시간이 테타에 비해 높은 수준 이다. 이와 관련, 15 분 게시물 i.p 주입에 혈 청 형광 값은 0.4-4 사이의 낮은 중간 분자량 범위에서 추적기에 대 일 분 게시물 i.v 주입에 비해 kD (데이터 표시 되지 않음). Paracellular 침투성 선형 이며 상당한 조직 형광 검출된 게시물 관류 짧은 순환 시간 (15 분) 후, 그것은 이미 이면 침투성 형 우리가에서 보고 있다 때문에 우리는 짧은 순환 시간 제안 우리의 이전 간행물10,12,,1314. 동시에 아직 한 정규화에 대 한 혈 청 형광을 얻을 수 있습니다. 긴 순환 시간, 조직 정리에 상당한는 혈 청 형광을 상당히 감소 하 고 따라서 혈 청으로 정규화 침투성 값에 영향을 수도 있습니다. 추적 프로그램의 크기/충전에 관하여 순환의 시간 각 시나리오에 대 한 최적화 하는, 시작 지점으로 짧은 순환 시간을 것이 좋습니다. 이 플라즈마 같은 높은 분자량 용액에도 적용 됩니다 IgGs 및 fibrinogen (150-400 kD) 누구의 침투성 특성은 그들의 매우 큰 크기 및 Fc 같은 세포 수용 체와의 특정 상호 작용 때문에 불활성 dextran 추적기와 달리 그들의 하프 라이프24변경 수용 체입니다. Dextrans 다른 한편으로 어떤 특정 교통 시스템 내 피 레벨25 에 고 단백질 (PLVAP)26 plasmalemma 기의 낮은 수준에 관련 된 뇌 내 피 세포로 인해 상당한 수준 pinocytosis 매우 받아야 하지 할로 , dextrans의 수송의 주요 경로 paracellular. 우리와 같은 유전자 변형 쥐에 침투성 야생-타입 littermates에 비해 치료 개입10, 후 야생 타입 마우스에 침투성 변화 평가 성공적으로 여러 시나리오에서 위의 방법을 적용합니다 12 , 13 , 14. 요약 하자면, 면역 형광 얼룩과 결합 하 여, 여기에 설명 된 침투성 분석 결과 이며 간단한 마우스에서 생체 내에 다른 작은 동물에도 적용 될 수 있는의 침투성을 평가 하는 강력한 방법.

Microvascular 내 피 세포 (ECs)는 ensheathed 기저 lamina에, 밀접 하 게 관련 된 pericytes (Pc), 및 지하실 막의 끝 발1 봉투 이다 (ACs)에서 지 원하는 이루어져 혈액-뇌 장벽 (BBB) ,2. 여러 셀 형식을 지원 하 고 규제 장벽 기능을 주로 ACs 및 Pc, 상호 작용 하는 ECs 그리고 또한 신경 및 microglia, 모두는 함께 형성 neurovascular 단위 (NVU). NVU는 BBB는 혈액을 매개로 독 소 및 두뇌에 들어가기에서 병원 체의 전송 제한 기능에 대 한 중요 합니다. 이 함수는 ECs 사이 p-당단백질 (P-gp) 그 경과 분자 endothelium 입력으로 다시 같은 전송기의 작용으로 인해 claudin-5, occludin, zonula occludens-1, 꽉-접합 분자의 결과 선박 루멘1,2,3. 그러나 BBB는 영양분 (포도 당, 철, 아미노산) 등 필수 분자의 수송에 대 한 특정 전송기 EC 플라즈마 막1,,23에 의해 수 있습니다. EC 레이어 luminal (혈액 연결)와 abluminal (뇌 연결 막) 대 한 구체적이 고 vectorial 전송 기능4,5 수 있도록 다양 한 전송기의 분포에 관하여 매우 편광은 . BBB 단단히 CNS 환경 규제에 대해 보호 하는 동안, CNS 약물 전달 기능 BBB와 파 킨 슨 등 질환에 대 한 주요 도전 이다. BBB 장애와 신경 질환에도 장벽 부전 손상 Alzheimer의 질병 (광고)에서 예를 들어 특정 전송 대상에 포함 될 수 있습니다 때문에 특히 두뇌 약물 전달 증가 추측 될 수 없다. 광고에서 LRP1, 분노, P-gp 등 여러 가지 아 밀 로이드 베타 전송기 dysregulated 것으로 알려져 있습니다 하 고 쓸데6,,78수 있습니다 따라서 이러한 전송기를 대상으로 합니다. BBB는 획, 광고, 수 막 염, 다 발성 경화 증 및 뇌 종양9,,1011등 여러 신경 질환에 손상 이다. 장벽 기능 복원 치료 전략의 중요 한 부분 이며 따라서 그 평가 중요 한.
이 작품에서는, 우리는 설명 된 객관적이 고 침투성 분석 결과 우리가 성공적으로 적용할 여러 마우스 라인 모두 실험과 유전자 변형 질환 모델10,12,13 설치류에 대 한 양적 프로토콜 ,14. 방법은 혈관 칸막이 추적기를 제거 뒤에 쥐의 관류 형광 추적기의 간단한 복 주사를 기반으로 합니다. 뇌 및 기타 장기 수집된 게시물 관류 및 침투성 객관적인 평가 절대 침투성 인덱스 플레이트 리더에서 조직 homogenates의 형광 측정에 따라 있습니다. 모든 원시 형광 값 조직 homogenates 또는 어떤 추적 프로그램에는 영향을 받지 않는 가짜 동물에서 혈 청을 사용 하 여 배경색을 수정할 수 있습니다. 충분 한 정규화 세럼 볼륨, 혈 청 형광, 및 조직, 따라서 저조한 침투성 인덱스를 완전 하 고 실험 및 조직 유형 사이 비교의 무게에 대 한 포함 되어 있습니다. 그룹 사이 비교의 용이성, 절대 침투성 인덱스 값 수 쉽게 변형 될 비율을 우리12이전 수행 했다. 동시에, 저장 된 hemi-두뇌와 신장 수 활용할 수 추적 프로그램 시각화를 위한 형광 현미경 검사 법10. 고전적인 형광 현미경 검사 법 이기는 하지만 조직 단면도 및 반 정량 분석에 대 한 이미지의 주관적인 선택으로 인해 성가신 침투성에 지역 차이 얻기에 중요 한 될 수 있습니다. 자세한 단계는 프로토콜에서 제공 됩니다 그리고 적절 한 노트 추가 됩니다. 이 성공적으로 다른 작은 동물을 확장할 수 있는 쥐에서 vivo에서 침투성 시험을 수행 하기 위한 필요한 정보를 제공 합니다. 분석 결과 추적기의 많은 종류에 적용 될 수 있습니다 추적기와 독특한 형광 스펙트럼의 조합에 의해 침투성 평가 기반으로 책임과 크기에 대 한 허용.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>D3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>D3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketavet)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Rompun)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Saline</td>
			<td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek O.C.T compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldhehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td>prepare a 4% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti rat alexa 568</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti rat alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua polymount</td>
			<td>Polyscience Inc</td>
			<td>18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge butterfly needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>387455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serum collection tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>41.1500.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL eppendorf tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.695.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech precision wipes tissue wipers</td>
			<td>Kimberley-Clark Professional</td>
			<td>05511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well black plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slides superfrost plus</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE pestle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electric overhead stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR VOS 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Microm GmbH</td>
			<td>HM 550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic perfusion system</td>
			<td>BVK Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo blood-brain barrier permeability assay in mice using fluorescently labeled tracers

혈액-뇌 장벽 (BBB) 두뇌 microenvironment 독 소 및 순환에 있는 병원 체에서 보호 하 고 두뇌 항상성 유지 하는 특수 방 벽 이다. 방 벽의 주요 사이트는 그 장벽 기능 꽉 세포 접합 및 원형질 막에 경과 전송기에서 결과 뇌 모세 혈관의 내 피 세포. 이 함수는 pericytes와 함께 혈관 단위 (NVU)를 형성 하는 이다 통제 된다. Alzheimer의 질병 (광고), 등 여러 신경 질환 뇌종양 장애인된 BBB 기능으로 연결 됩니다. BBB 침투성의 평가 중요 한 신경 질환의 심각도 및 고용 치료 전략의 성공에 따라서.
우리는 현재 여기 간단한 아직 강력한 침투성 분석 결과 여러 가지 마우스에 성공적으로 적용 된 둘 다, 유전과 실험 모델. 방법은 매우 양적이 고 일반적으로 적용 되는 현미경에 의해 추적 형광 분석에 비해 객관적입니다. 이 방법에서는, 마우스는 쥐 마비 뒤 수성 불활성 형광 추적기의 믹스와 함께 intraperitoneally 주입 수 있습니다. 동물의 심장 관류 뇌, 신장 또는 다른 장기 수확 전에 수행 됩니다. 장기 무 균 및 centrifuged는 상쾌한에서 형광 측정에 의해 따라. 혈액 관류의 바로 전에 심장 펑크에서 그려진 혈관 칸막이를 정규화 목적을 위해 제공 합니다. 조직 형광은 양적를 젖은 무게와 혈 청 형광으로 정규화 추적 침투성 색인. 추가 확인, contralateral hemi 두뇌 immunohistochemistry 보존 추적 형광 시각화 용도로 활용할 수 있습니다.

우리는 최근에 angiopoietin-2 (중앙-2) 함수 이득 (GOF) 마우스 건강 조건10제어 마우스 보다 더 높은 두뇌 혈관 침투성을가지고 나타났습니다. 뇌졸중 유발 쥐에서 그것은 또한 쇼 프 쥐 했다 더 큰 경색 크기와 제어 littermates 보다 큰 침투성. 이러한 결과 BBB에 침투성에 중앙 2의 중요 한 역할을 보여 줍니다. 따라서 프로토콜 GOF 마우스를 활용 하 고 비보에 침투성 분석 결과 설명 하기 위해 littermates를 제어 하는 그들을 비교. 그러나,이 방법은 어떤 질병 모델, 유전자 변형 마우스 모델에 적용 될 수 있다 또는 우리가 했던 이전 10,11,,1213BBB 침투성을 변경 하는 치료 약물.
침투성 분석에 대 한 짧은 순환 시간 (15 분)은 제안으로 긴 순환 시간 큰 클리어런스 또한 이전 연구16에 관찰 되었습니다 혈관 구획에서 이어질 것입니다. 3의 클리어런스 kD 2 h (그림 2 FITC dextran C, D) (그림 2 15 분 보다 훨씬 더 A, B) 뇌 조직에서 뿐만 아니라 신장에서. 뇌에서는 이러한 성인 WT 쥐 (그림 B, D)에 그대로 혈액-뇌 장벽으로 인해 아주 작은 extravascular 추적 프로그램입니다. 이 방법을 적용, WT littermates과 중앙 2 GOF에서 추적 침투성 비교 되었다. 테이블 형식 (표 1)에 제시 결과 WT 쥐에 비해 GOF 쥐의 두뇌에서 높은 추적 축적을 나타냅니다. 그러나, 신장 형광이이 그룹 사이 되지 변경 됩니다. 면역 형광 이미지 확인 GOF 마우스 (그림 3 에 extravascular 추적 증가 B, D) WT 마우스 (그림 3 에 비해 A, C) 추적 프로그램 혈관 구획에 제한 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57038/57038fig1.jpg"> 그림 1. 비보에 침투성 분석 결과 형광 추적기를 사용 하 여에 대 한 워크플로의 회로도 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57038/57038fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57038/57038fig2.jpg"> 그림 2입니다. 짧고 긴 순환 시간에서 추적 정리. 침투성 분석 결과, 15 분의 짧은 순환 시간에 대 한 추적 프로그램 순환 시간을 설정 하기 위해 (A, B)는 2 h (C, D) 게시물 추적 프로그램 삽입의 긴 순환 시간 비교 되었다. 2 h의 더 긴 순환 시간 FITC dextran-3 kD (녹색의 매우 높은 정리 때문에 잠재적으로 짧은 15 분 순환 시간 (A) 에 비해 신장 (C) 기저 침투성이 높은 추적 축적의 매우 낮은 금액을 주도 채널) 혈관 구획에서. 이 효과 꽉 혈액-뇌 장벽 (B, D)에 의해 특징 두뇌에 더욱 극적인 했다. CD31 얼룩 (빨강 채널) 관심 영역에서 혈관의 존재를 확인 했다. 2 야생-타입 성인 CD1 쥐 각 시간 포인트와 동물에 대 한 추적 프로그램 주입에서 단일 동물에서 대표 이미지는 혈관 내 추적 프로그램을 시각화 하는 그들을 perfusing 없이 희생 되었다. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57038/57038fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57038/57038fig3.jpg"> 그림 3입니다. 면역 형광 검사 GOF 쥐에서 뇌 침투성 변화를 평가 하는 추적기에 대 한 얼룩. 3의 침투성을 증가 kD TMR dextran 추적 프로그램 (빨간색)으로 중앙 2 GOF 쥐 (B, D) (A, C)는 피 질 영역에서 WT littermates에 비해 구상 될 수 있다. WT 동물 추적 프로그램 extravascular 추적 프 쥐 ( B, D에흰색 화살표)에서 관찰 될 수 있다 반면 혈관 (A, C)에 제한 됩니다. CD31 (블루)에 대 한 병합 된 이미지에 얼룩이 (A-D) 혈관의 존재를 확인 합니다. 그림 2에서 대표 이미지 WT 2 GOF 쥐 추적기 i.p 주사 하 고 15 분 포스트 주입 관류와 희생입니다. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57038/57038fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">동물 ID</td>
			<td rowspan="2">두뇌 무게 (g)</td>
			<td rowspan="2">신장 중량 (g)</td>
			<td rowspan="2">혈 청 볼륨 (mL)</td>
			<td rowspan="2">세럼 RFU</td>
			<td rowspan="2">신장 RFU</td>
			<td rowspan="2">두뇌 RFU</td>
			<td colspan="2">펌 인덱스 (10 ^-3 ml/g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>신장</td>
			<td>뇌</td>
		</tr>
<tr>
<td>GOF 1</td>
			<td>0.195</td>
			<td>0.252</td>
			<td>0.02</td>
			<td>38305</td>
			<td>31051</td>
			<td>154</td>
			<td>64.4</td>
			<td>0.352</td>
		</tr>
<tr>
<td>GOF 2</td>
			<td>0.177</td>
			<td>0.249</td>
			<td>0.02</td>
			<td>42001</td>
			<td>31411</td>
			<td>126</td>
			<td>60</td>
			<td>0.278</td>
		</tr>
<tr>
<td>무게 1</td>
			<td>0.167</td>
			<td>0.301</td>
			<td>0.02</td>
			<td>40904</td>
			<td>31591</td>
			<td>64</td>
			<td>51.2</td>
			<td>0.122</td>
		</tr>
<tr>
<td>WT 2</td>
			<td>0.146</td>
			<td>0.294</td>
			<td>0.02</td>
			<td>39502</td>
			<td>31768</td>
			<td>70</td>
			<td>54.8</td>
			<td>0.164</td>
		</tr>
<tr>
<td>가짜</td>
			<td>0.155</td>
			<td>0.27</td>
			<td>0.02</td>
			<td>27</td>
			<td>36</td>
			<td>22.5</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 조직 침투성 계산. 침투성 인덱스 계산 중앙 2 이득-의-(GOF) 기능과 야생-타입 littermates (WT) 쥐에 대 한 명확 하 게 보여 더 큰 (약 2-fold) GOF 쥐 WT 쥐에 비해 침투성 두뇌. 그러나 신장 침투성은 2 그룹 간에 동일한 범위에. 기저 신장 침투성은 훨씬 더 단단한 방 벽을 형성 하지 않는다 신장에서 fenestrated endothelium 인해 예상 대로 뇌에 비해.

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An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

an-vivo-blood-brain-barrier-permeability-assay-mice-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

24.3K 조회수.  Goethe University Hospital. 여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

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Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

연구

신경과학

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form during the earliest stages of brain development and are maintained throughout the animal's life. The brain ventricular system is found in vertebrates, and the ventricles develop after neural tube formation, when the central lumen fills with cerebrospinal fluid (CSF) 1,2. CSF is a protein rich fluid that is essential for normal brain development and function3-6.
In zebrafish, brain ventricle inflation begins at approximately 18 hr post fertilization (hpf), after the neural tube is closed. Multiple processes are associated with brain ventricle formation, including formation of a neuroepithelium, tight junction formation that regulates permeability and CSF production. We showed that the Na,K-ATPase is required for brain ventricle inflation, impacting all these processes 7,8, while claudin 5a is necessary for tight junction formation 9. Additionally, we showed that "relaxation" of the embryonic neuroepithelium, via inhibition of myosin, is associated with brain ventricle inflation.
To investigate the regulation of permeability during zebrafish brain ventricle inflation, we developed a ventricular dye retention assay. This method uses brain ventricle injection in a living zebrafish embryo, a technique previously developed in our lab10, to fluorescently label the cerebrospinal fluid. Embryos are then imaged over time as the fluorescent dye moves through the brain ventricles and neuroepithelium. The distance the dye front moves away from the basal (non-luminal) side of the neuroepithelium over time is quantified and is a measure of neuroepithelial permeability (Figure 1). We observe that dyes 70 kDa and smaller will move through the neuroepithelium and can be detected outside the embryonic zebrafish brain at 24 hpf (Figure 2).
This dye retention assay can be used to analyze neuroepithelial permeability in a variety of different genetic backgrounds, at different times during development, and after environmental perturbations. It may also be useful in examining pathological accumulation of CSF. Overall, this technique allows investigators to analyze the role and regulation of permeability during development and disease.

We describe a live whole animal quantitative measurement for permeability of the embryonic zebrafish brain. The technique analyzes the ability to retain cerebrospinal fluid and molecules of different molecular weights within the neural tube lumen and quantifies their movement out of the ventricles. This method is useful for determining differences in epithelial permeability and maturation during development and disease.

Zebrafish 배아 Neuroepithelium의 투과율에 대한 분석

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

FITC 표시 된 알 부 민 신경 질환의 마우스 모델에서의 정 맥 주입에 의해 혈액-뇌 장벽 침투성의 평가

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

쥐 모델에서 집중 초음파를 사용하여 위치 특정 혈액 뇌 장벽 개방에 대한 벤치 탑 접근

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. Adeno-associated viruses (AAVs) are increasingly used to improve understanding of brain circuits and their functions. The AAV-mediated manipulation of specific cell populations and/or of precise molecular components has been tremendously useful to identify new sleep regulatory circuits/molecules and key proteins contributing to the adverse effects of sleep loss. For instance, inhibiting activity of the filamentous actin-severing protein&#160;cofilin&#160;using AAV prevents sleep deprivation-induced memory impairment. Here, a protocol is&#160;described that combines the manipulation of cofilin function in a cerebral cortex area with the recording of ECoG activity to examine whether cortical cofilin modulates the wakefulness and sleep ECoG signals. AAV injection is performed during the same surgical procedure as the implantation of ECoG and electromyographic (EMG) electrodes in adult male and female mice. Mice are anesthetized, and their heads are shaved. After skin cleaning and incision, stereotaxic coordinates of the motor cortex are determined, and the skull is pierced at this location. A cannula prefilled with an AAV expressing cofilinS3D, an inactive form of cofilin, is slowly positioned in the cortical tissue. After AAV infusion, gold-covered screws (ECoG electrodes) are screwed through the skull and cemented to the skull with gold wires inserted in the neck muscles (EMG electrodes). The animals are allowed three weeks to recover and to ensure sufficient expression of cofilinS3D. The infected area and cell type are verified using immunohistochemistry, and the ECoG is analyzed using visual identification of vigilance states and spectral analysis. In summary, this combined methodological approach allows the investigation of the precise contribution of molecular components regulating neuronal morphology and connectivity to the regulation of synchronized cerebral cortex activity during wakefulness and sleep.

This article describes a protocol for the manipulation of molecular targets in the cerebral cortex using adeno-associated viruses and for monitoring the effects of this manipulation during wakefulness and sleep using electrocorticographic recordings.

쥐에서 코필린을 표적으로 하는 아데노 관련 바이러스를 사용하여 조작된 대뇌 피질 지역의 전기 코르티코그래피 기록

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...